Nghiên cứu khảo sát hoạt tính sinh học và xác định thành phần hóa học của các loại cao chiết lá đinh lăng (polyscias fruticosa (l ) harms)

343 NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC LOẠI CAO CHIẾT LÁ ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L ) HARMS) Nguyễn Đức Thiên An, Chu Trực Nhân, Trương Thị Hồng Thảo,[.]

NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC LOẠI CAO CHIẾT LÁ ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS) Nguyễn Đức Thiên An, Chu Trực Nhân, Trương Thị Hồng Thảo, Đặng Huỳnh Xuân Trúc Viện Công nghệ Việt  Nhật, Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh GVHD: ThS Phạm Minh Nhựt TÓM TẮT Bệnh tiêu chảy với nhiều biến chứng nguy hiểm tình hình lão hóa thể người mối đe dọa lớn đến sức khỏe toàn cầu Nghiên cứu thực nhằm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn khả kháng ôxy hóa Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms Tiềm điều trị bệnh tiêu chảy Đinh lăng khảo sát thông qua phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion method) dựa phương pháp Anonymous (1996) Hadecek, ctv (2000) Đường kính vịng ức chế số lượng chủng vi khuẩn mà cao kháng xuất đ a thạch sau 24 ủ tủ ấm 37 oC thể mức độ kháng khuẩn dựa vào đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao Ngoài để đánh giá khả kháng ơxy hóa Đinh lăng giá trị IC50 (nồng độ chất kháng ơxy hóa để ức chế 50% gốc tự DPPH) sử dụng làm tiêu chuẩn đánh giá Giá trị IC50 nhỏ hoạt tính kháng ơxy hóa Đinh lăng mạnh Giá trị IC50 xác định phương pháp DPPH lập phương trình đường chuẩn: y = ax + b Việc định tính thành phần hóa học có cao chiết xác định thơng qua phương pháp thử nghiệm đặc trưng từ kết luận mẫu cao Đinh lăng có hiệu việc điều trị bệnh tiêu chảy nói riêng nâng cao sức khỏe người nói chung Từ khóa: Cao, đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms, kháng khuẩn, kháng ơxy hóa, thành phần hóa học ABSTRACT Diarrhea with many dangerous complications and aging processing in the human body is a great threat to global health This research was conducted to investigate the antibacterial activity and antioxidant ability of Polyscias fruticosa (L.) Harms leaves The potential of diarrhea’s treatment by using Polyscias fruticosa (L.) Harms leaves was examined through agar well diffusion method based on Anonymous (1996) and Hadecek, et al (2000) The inhibitory loop diameter and the number of bacterial strains resistant of leaf extract appeared on agar plates after 24 hours of incubation in a 37 oC incubator will show antibacterial activity and will be used to assess the antibacterial activity of leaf extract In another hand, to assessing the antioxidant capacity of Polyscias fruticosa (L.) Harms leaves, IC50 values (antioxidant concentrations to be able to inhibit 50% 343 of free radicals DPPH) will be used as the evaluation criteria The more smaller the IC50 value, the more stronger the antioxidant activity of the leaves The value of IC50 was determined by DPPH and set up by the equation for the line: y = ax + b The qualitative determination of the chemical constituents in the extract is determined through specific test methods and it is therefore possible to conclude which samples of the leaves are more effective in treating diarrhea and improve human health Keywords: Extract, Polyscias fruticosa (L.) Harms, antibacterial, antioxidant, chemical constituents L I GIỚI THIỆU Những năm trở lại đây, Đinh lăng dần ứng dụng rộng rãi l nh vực chăm sóc cải thiện sức khỏe Các ứng dụng nhắc đến nhiều Đinh lăng kể đến là: hoạt huyết dưỡng não, tăng cường trí nhớ sức chống chịu, lợi tiểu, giảm sưng,… Và phận sử dụng để làm dược liệu chủ yếu rễ Đinh lăng (hay cịn ví Nhân sâm Việt Nam) Bên cạnh tác dụng kể từ rễ có nhiều báo cáo khảo sát, phân tích ứng dụng phận khác cành, để làm dược liệu nhằm tận dụng tối đa lợi ích mà Đinh lăng mang lại Cùng chung mục tiêu trên, nghiên cứu hướng đến việc khảo sát số đặc tính Đinh lăng đề cập tài liệu thuốc, dược liệu Việt Nam thiếu liệu sở Từ đó, đưa lời nhận xét tiềm ứng dụng Đinh lăng trở thành dược liệu bên cạnh rễ cây, đưa ứng dụng quy mô sản xuất công nghiệp Đồng thời, kết nghiên cứu xem liệu sở, bổ sung thêm thông tin hữu ích Đinh lăng 1.1 Tên gọi, phân nhóm Tên gọi khác: Cây gỏi cá, Nam dương sâm [3] Tên khoa học: Polyscias fruticosa (L.) Harms, Panax fruticosum L, Nothopanax fruticosus (L.) Miq., Tieghemopanax fruticosus (L.) R Vig [3, 4] Tên nước ngoài: Ginseng tree (Anh), Polyscias (Pháp) [3] Họ: Ngũ gia bì (danh pháp khoa học: Araliaceae) [4] Phân nhóm: Đinh lăng nhỏ, đinh lăng to, đinh lăng tròn, đinh lăng đ a, đinh lăng viền bạc đinh lăng [3] 1.2 Đặc điểm sinh thái Mô tả: Cây đinh lăng loài thân nhỏ, xanh tốt quanh năm, thường cao 0,8 – 1.5,m cao đến m Thân nhẵn khơng có gai, phân nhánh, mang nhiều vết sẹo to, màu xám Lá to, mọc so le, kép lông chim – lần, dài 20 – 40 cm, khơng có kèm rõ; chét có cuống dài – 10 mm, phiến chét có cưa nhọn, đơi chia thùy, gốc đầu thn nhọn, có mùi thơm vị nát; cuống dài, phát triển thành bẹ to phần cuối 344 Cụm hoa mọc thành hình chùy ngắn – 18 mm, mang nhiều tán; bắc rộng, sớm rụng; hoa nhỏ, màu lục nhạt trắng xám; đài hàn liền, mép uốn lượn; tràng cánh hình trái xoan; nhị 5, nhị ngắn; bầu hạ, ơ, ngăn có dìa trắng nhạt Quả dẹt từ – mm dày khoảng mm, hình trứng rộng, màu trắng bạc, có vịi tồn Mùa hoa quả: Tháng  [3, 4] Phân bố: Thảo dược có nguồn gốc từ đảo khu vực Thái Bình Dương Hiện đinh lăng trồng nhiều địa phương nước ta Ban đầu trồng để làm thực phẩm làm cảnh Gần đây, đinh lăng sử dụng loại dược liệu 1.3 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến, bảo quản Bộ phận dùng: Lá, thân, cành rễ Thu hái: Thu hoạch thời điểm năm, thường dùng trực tiếp Đối với rễ thu hoạch trồng từ năm nên thu hoạch vào mùa xn Đem rễ rửa sạch, sau đem phơi khơ nơi mát thống gió Chế biến: Đem rễ tẩm nước gừng tươi sơ qua, sau tẩm với mật ong mật mía Bảo quản: Nơi khơ thoáng, tránh ẩm ánh nắng mặt trời [3, 13] 1.4 Thành phần hóa học Cây đinh lăng có chứa loại saponin (một vài loại tương tự thành phần sâm), glucoside, tannin, khoảng 13 loại acid amin (như Arginin, Alanin, Asparagin, Acid glutamic, Leucin, Lysin, Phenylalanin, Prolin, Threonin, Tyrosin, Cystein, Tryptophan, Metionin,… , alkaloid, vitamin tan nước (như B1, B2, B6, C ,… Một nghiên cứu khác việc cô lập từ rễ Đinh lăng tìm thấy hợp chất thuộc loại hợp chất polyacetylene [7, 8, 10, 14, 15] Một nghiên cứu khác phân tích thành phần tinh dầu Đinh lăng mọc Fiji Thái Lan cho thấy tinh dầu có khoảng 24 cấu tử, có chất -elemen, -germacrenD, E--bisabolen -bergamoten [1, 10, 14] Ngoài ra, Chaboud A cộng nghiên cứu lập từ tìm thấy saponin triterpen Bên cạnh vào năm 1992, Nguyễn Thị Nguyệt cộng cô lập acid oleanolic từ Đinh lăng Đến năm 1998, Võ Duy Huấn cộng nghiên cứu cô lập thêm 11 saponin triterpene [2, 8, 11, 12] Trong năm gần đây, có nhiều hợp chất saponin phân lập [2, 5] 1.5 Tính vị Rễ Đinh lăng có vị ngọt, tính bình; vị nhạt, đắng, tính bình Đinh lăng độc Nhân sâm khác với Nhân sâm; không làm tăng huyết áp.[4] 345 1.6 Tác dụng dược lý Theo nghiên cứu dược lý đại: Theo nghiên cứu Tiến s Nguyễn Thị Thu Hương số cộng Trung tâm Sâm Dược liệu TP HCM (2000 – 2007) [9, 10] Tác dụng tăng cường thể lực, giảm stress: Cây đinh lăng có chứa thành phần tương tự sâm nhung có khả kích thích hoạt động não bộ, chống mệt mỏi, ơxy hóa giảm lo âu, mệt mỏi tăng cường miễn dịch; Bảo vệ gan; Giảm sưng viêm; Giảm đau khớp; Kích thích tiểu tiện; Điều trị hen suyễn: Dịch chiết cồn từ thảo dược có tác dụng chống histamin chống hen suyễn; Tăng trí nhớ thời gian sống (thực nghiệm chuột già) Theo y học cổ truyền: Lá chữa cảm sốt, sưng tấy mụn nhọt Thân cành chữa tê thấp, đau nhức lưng Rễ thuốc bổ, lợi tiểu TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU VÀ MỤC TIÊU KHẢO SÁT 2.1 Vật liệu Nguyên liệu dùng nghiên cứu Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms), 12 năm tuổi thu hái huyện Đức Linh, tỉnh Bình Thuận Mẫu bảo quản Trường Đại học Công nghệ TP.HCM sở Công nghệ cao Quận Lá rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh cuống lớn, chia làm phần (lá tươi khơ), sau xay nhỏ để sử dụng cho nghiên cứu Vi sinh vật thị (VSVCT) sử dụng nghiên cứu chủng VSVCT cung cấp GVHD ThS Phạm Minh Nhựt, bao gồm: Nhóm vi khuẩn Escherichia: E coli; Nhóm vi khuẩn Salmonella: S typhii; Nhóm vi khuẩn Shigella: S boydii; Nhóm vi khuẩn Vibrio: V cholerae; Nhóm vi khuẩn Listeria: L monocytogene; Vi khuẩn gây bệnh hội da: S aureus Thiết bị sử dụng nghiên cứu gồm: Máy cô quay chân không Heidolph (Đức), Máy đo quang phổ UVVis Optima SP300 (Nhật), Tủ cấy (Class II BSC, Esco, Indonesia), Bếp điều nhiệt cách 346 thủy Memmert WNB14 (Đức), Tủ hút chân không BestLab BLH1.6 (Việt Nam), Tủ sấy Memmert (Đức ,… cung cấp Phịng thí nghiệm Trường Đại học Cơng nghệ TP.HCM Hóa chất sử dụng thí nghiệm gồm: Ethanol 70o, nước cất, methanol tuyệt đối, DMSO đậm đặc 50%, H2SO4 đậm đặc, H2SO4 loãng, HCl loãng, acid acetic glacial, pyridine, NaOH 10%, FeCl3 10%, ammonia, NaCl 10%, chì acetate 10%, gelatin 1%, glycerol 40%, acetic anhydride, kháng sinh Ciprofloxacin,… Các thuốc thử: Molisch, Barfoed, Meyer, Dragendorff, Hager, Wagner, Fehling A Fehling B, Ferric chloride 10%, Ninhydrin, DPPH Môi trường: BHI (Brain Heart Infusion Broth) BHIA (Brain Heart Infusion Agar) 2.2 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thu xử lý nguồn mẫu Mẫu thực vật thu với số lượng lớn cành mang rửa chia làm phần: Phần tươi để nước xay nghiền nhỏ (PfT); Phần phơi bóng râm từ 57 ngày, sau xay nghiền nhỏ (PfK) Lượng mẫu sau xay nghiền đóng gói túi zip lưu trữ tủ lạnh dùng để tách chiết cao sử dụng thí nghiệm Mẫu trình bảo quản thực thí nghiệm đảm bảo chát lượng, không bị nhiễm tạp chất hay mầm bệnh khác 2.2.2 Phương pháp tách chiết thu nhận cao thực vật Mẫu thực vật tách chiết nhiều loại dung môi khác phương pháp chiết ngâm nhiệt độ thường thu nhận cao chiết cách cho bay hơi, loại bỏ lượng dung môi dịch chiết thiết bị thích hợp Tiến hành: Cân 50 g bột tươi/khô ngâm với 1000 ml nước cất/ethanol 70o (tỷ lệ 1:20 (w/v)) Đối với dịch ngâm nước cất thời gian ngâm Đối với dịch ngâm ethanol 70o thời gian ngâm 24 Sau ngâm đủ thời gian, tiến hành lọc thô qua vải lọc lọc tinh qua giấy lọc Cuối thu dịch lọc trong, màu đặc trưng khơng có cặn Bã sau lọc tiếp tục đưa ngâm thêm  lần Dịch lọc sau đưa quay cách chân không 70  80 oC (dung môi ethanol 70o) đun cách thủy 75 oC (dung môi nước cất) Sau cô quay, thu cao chiết có dạng sệt, màu mùi đặc trưng Đồng thời tính hiệu suất chiết tách so với trọng lượng khô (%) Hiệu suất tách chiết = Trọng lượng cao chiết Trọng lượng bột khô  100% 347 Các cao chiết thu bao gồm: Cao dịch lọc khô ngâm nước (PfKN); Cao dịch lọc khô ngâm ethanol 70o (PfKE); Cao dịch lọc tươi ngâm nước (PfTN); Cao dịch lọc tươi ngâm ethanol 70o (PfTE) Các mẫu cao bảo quản tủ lạnh nhiệt độ oC Đảm bảo chất lượng cao suốt trình lưu trữ 2.2.3 Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật thị Mục đích: Hoạt hố vi khuẩn giữ giống phát triển lại bình thường chúng bị suy yếu trình bảo quản Tiến hành: Đối với chủng VSVCT giữ glycerol 40%, tiến hành tăng sinh cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào bình chứa 20 ml mơi trường BHI điều kiện vơ trùng Sau tiến hành lắc với tốc độ 170 vòng/phút 24 nhiệt độ phòng Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013) Mật độ tế bào vi khuẩn xác định phương pháp đo mật độ quang OD ước sóng 600 nm [6] Cơng thức tính tốn xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland): Mật độ = OD600  1,02  109 (CFU/ml) Mật độ tế bào VSVCT sau tăng sinh không thấp 106 CFU/ml 2.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Tiềm hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết khảo sát phương pháp khuếch tán giếng thạch (well diffusion agar method) dựa phương pháp Anonymous (1996) Hadacek, ctv (2000) có điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm Tiến hành: Các chủng VSVCT hoạt hóa từ ống giống gốc môi trường lỏng BHIB, lắc qua đêm Cấy trang 100 µL dịch khuẩn (mật độ tế bào tương đương 106 CFU/ml) lên bề mặt đ a petri có chứa mơi trường BHIA đặc tiến hành đục giếng với đường kính d = mm cho giếng cách khoảng  cm Chuẩn bị dịch cao chiết cách hòa tan lượng cao chiết Dimethyl Sulfoxide (DMSO) 50% theo nồng độ: 100 mg/ml 200 mg/ml Mẫu dịch chiết chia thành cặp để khảo sát hoạt tính với nhau: PfKN  PfTN PfKE  PfTE Bổ sung 100 µL dịch cao chiết vào giếng thạch đ a petri giữ đ a nhiệt độ phòng để dịch cao khuếch tán vào mơi trường thạch Sau đó, ủ đ a vào tủ ấm 37 oC 24 tiến hành đọc kết cách đo giá trị đường kính vòng ức chế (mm) đ a thạch 348 Đối chứng (ĐC dung dịch kháng sinh Ciprofloxacin ĐC âm khơng bổ sung vào mơi trường Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Với mục tiêu nghiên cứu nhằm ổn định hệ vi sinh vật đường ruột điều trị bệnh tiêu chảy, việc nhận xét tiềm kháng khuẩn cao đinh lăng thông qua phương pháp khuếch tán giếng thạch cần đạt yêu cầu sau: Kháng từ bốn chủng VSVCT trở lên; Đường kính vịng kháng phải ≥ mm 2.2.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng ơxy hóa Khả kháng ơxy hóa chất biểu giá trị IC50, nồng độ chất kháng ôxy hóa để ức chế 50% gốc tự DPPH Giá trị IC50 nhỏ, hoạt tính kháng ôxy hóa mạnh IC50 giá trị dùng để đánh giá khả ức chế chất kháng ôxy hóa mạnh yếu mẫu khảo sát IC50 (Inhibitory Concentration of 50%) định ngh a nồng độ (µg/mL) chất kháng ơxy hố mà loại bỏ 50% gốc tự do, tế bào enzyme, mẫu có hoạt tính cao giá trị IC50 thấp Giá trị IC50 xác định phương pháp lập phương trình đường chuẩn: y = ax + b Với giá trị x bao gồm nhiều nồng độ khác Khi phần trăm (%) ức chế tuyến tính với nồng độ mẫu, cho y = 50% thay vào phương trình có, từ giá trị x IC50 Tiến hành: Mẫu cao chiết Đinh lăng pha dung dịch DMSO đậm đặc theo nồng độ 100 mg/ml Sau tiếp tục pha loãng mẫu theo dãy nồng độ 1000 μg/ml; 800 μg/ml; 600 μg/ml; 400 μg/ml; 200 μg/ml; 100 μg/ml Dung dịch DPPH hồ tan dung mơi methanol tuyệt đối nồng độ mM Hút 100 μL dung dịch DPPH vào 2800 μL methanol tuyệt đối, sau bổ sung 100 μL dịch mẫu ĐC dương Vitamin C pha DMSO đậm đặc theo nồng độ ban đầu mg/ml Hút 100 μL dung dịch DPPH nồng độ mM vào 2800 μL methanol, sau bổ sung 100 μL dung dịch Vitamin C Mẫu trắng: Hút 100 μL DPPH vào 2900 μl methanol Cả ba mẫu dung dịch tiến hành ủ dung dịch điều kiện tối 37 oC 30 phút, sau đo độ hấp thu ước sóng 517 nm Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Nhận xét khả kháng ơxy hóa mẫu cao chiết so với dung dịch ĐC Vitamin C 2.2.6 Phương pháp xác định thành phần hóa học có cao chiết Các nhóm hợp chất hữu có mẫu cao chiết định tính phương pháp thử nghiệm hóa học với loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng Tiến hành: Các mẫu cao chiết pha lỗng với nồng độ thích hợp Sau tiến hành định tính thành phần hóa học với loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng: 349 ... pháp xác định thành phần hóa học có cao chiết Các nhóm hợp chất hữu có mẫu cao chiết định tính phương pháp thử nghiệm hóa học với loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng Tiến hành: Các mẫu cao chiết. .. dùng nghiên cứu Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L. ) Harms), 12 năm tuổi thu hái huyện Đức Linh, tỉnh Bình Thuận Mẫu bảo quản Trường Đại học Công nghệ TP.HCM sở Công nghệ cao Quận Lá rửa sạch, loại. .. nhỏ, đinh lăng to, đinh lăng tròn, đinh lăng đ a, đinh lăng viền bạc đinh lăng [3] 1.2 Đặc điểm sinh thái Mô tả: Cây đinh lăng loài thân nhỏ, xanh tốt quanh năm, thường cao 0,8 – 1.5,m cao đến