Luận văn thạc sĩ nông nghiệp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn salmonella gây bệnh trên vịt nuôi tại huyện sơn tịnh, tỉnh quảng ngãi

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Tơi Số liệu kết Luận văn trung thực Tôi phối hợp với quan liên quan đồng nghiệp thực Số liệu kết nghiên cứu chưa dùng để báo cáo hay bảo vệ cơng trình khoa học Tơi xin cam đoan giúp đỡ điều cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rỏ nguồn gốc Thừa Thiên Huế, ngày tháng năm 2016 Tác giả Lương Nhất Sinh PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn cố gắng thân Tôi nhận quan tâm hướng dẫn giúp đỡ tận tình q thầy cơ, nhiều quan cá nhân Nhân dịp Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến: TS Nguyễn Xn Hịa người hướng dẩn khoa học tơi q thầy, tận tình giảng dạy, hướng dẫn Tơi suốt thời gian qua Phịng đạo tạo sau đại học Khoa chăn nuôi Thú y trường Đại học Nông Lâm Huế tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Nhân xin gửi lời cảm ơn đến lãnh đạo Chi cục Chăn nuôi Thú y Quảng Ngãi; Trạm Chăn nuôi Thú y Sơn Tịnh tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn Cuối xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp cảm ơn em sinh viên lớp Thú y khóa 45 tạo điều kiện hỗ trợ tơi q trình thực đề tài Chân thành cảm ơn ! Thừa Thiên Huế, ngày tháng năm 2016 Tác giả Lương Nhất Sinh PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma iii TĨM TẮT ĐỀ TÀI • Với nội dung nghiên cứu - Điều tra tỷ lệ nhiễm thu mẫu vi khuẫn Salmonella Vịt bị tiêu chảy huyện Sơn Tịnh, tỉnh Quảng Ngãi - Phân lập chủng vi khuẩn gây bệnh - Xác định đặc tính sinh hóa chủng Salmonella phân lập - Kiểm tra hình thái, đặc điểm sinh học - Xác định độc lực vi khuẩn Salmonella phân lập - Xác định tính mẩn cảm với kháng sinh với số chủng Salmonella - Điều trị thử nghiệm hướng dẫn điều trị • Kết thực - Nghiên cứu tiến hành địa bàn huyện Sơn Tịnh tỉnh Quảng Ngãi Thông qua khảo sát điều tra cho thấy: Tổng số vịt bị tiêu chảy điều tra 19.950 con, chiếm 18,22% so với tổng đàn thời điểm điều tra chiếm 13,43% so với tổng đàn thống kê Từ mẫu bệnh phẩm thu thập được, tiến hành phân lập vi khuẩn, giám định đặc tính sinh hóa, kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh kết sau: - Những đặc điểm hình thái tính chất ni cấy mẫu vi khuẩn mà phân lập từ lách vịt bị bệnh huyện Sơn Tịnh, tỉnh Quảng Ngãi giống với đặc tính vi khuẩn Salmonella tác giả nước mô tả Tất chủng vi khuẩn Salmonella phân lập có đặc tính ni cấy, sinh vật hoá học đặc trưng giống Salmonella như: Lên men đường Gluco, Saccharose, di động, sinh hơi, sinh H2S,…không lên men đường lactose, không sinh indol, không phân giải ure Tất chủng Salmonella thử nghiệm độc lực chuột gây chết chuột nhắt trắng vòng 24h Kết cho thấy tất chủng Salmonella có độc lực mạnh có khả gây bệnh - Các chủng Salmonella có độc lực kiểm tra tính mẫm cảm với kháng sinh cho thấy 100% đề kháng với Tetracycline Neomycin Trong chúng mẫn cảm cao với Cefotaxime Rifampin, mẫn cảm trung bình với Gentamycin, Colistin, Kanamycin, Ampicilin, Streptomycine, Cephalexin từ 33,3-16,7% - Kết điều trị cho thấy, với nhóm điều trị sử dụng Cefotaxime số điều trị 86 con, số khỏi bệnh 74 con, tỷ lệ khỏi bệnh 86,04% Nhóm điều trị sử dụng Ceftiofur số điều trị 97 con, số khỏi bệnh 86 con, tỷ lệ khỏi bệnh 88,66% - Từ kết điều trị sở ta khuyến cáo người chăn nuôi vịt địa bàn huyện Sơn Tịnh tỉnh Quãng Ngãi bị bệnh vi khuẩn Salmonella gây sử dụng Cefotaxime Ceftiofur để điều trị PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT ĐỀ TÀI iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾTTẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ viii PHẦN MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC 1.1 CƠ SỞ LÝ LUẬN CHO CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.1 Vi khuẩn Salmonella 1.1.2 Các yếu tố gây bệnh vi khuẩn Salmonella 1.1.3 Các yếu tố độc tố 1.1.4 Các yếu tố độc tố 10 1.1.5 Bệnh vi khuẩn Salmonella gây vịt 13 1.2 CƠ SỞ THỰC TIỂN CHO CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 18 1.2.1 Tình hình nghiên cứu Salmonella 18 1.2.2 Tình hình dịch tể địa phương 22 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG 24 VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 24 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 24 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma v 2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Nội dung nghiên cứu 24 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 CHƯƠNG 32 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 TÌNH HÌNH NHIỄM BỆNH DO SALMONELLA TRÊN ĐÀN VỊT NUÔI TẠI HUYỆN SƠN TỊNH 32 3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN SAMONELLA TRÊN VỊT NUÔI TẠI HUYỆN SƠN TỊNH 33 3.3 KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN SALMONELLA PHÂN LẬP ĐƯỢC 35 Như chủng vi khuẩn phân lập điều có đặc điểm sinh hóa phù hợp với cơng bố, nghiên cứu trước 36 3.4 KIỂM TRA HÌNH THÁI VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC 36 3.5 KIỂM TRA ĐỘC LỰC CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC 38 CHƯƠNG KẾT LUẬN 45 4.1 KẾT LUẬN 45 4.2 KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾTTẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ (-) Âm tính (+) Dương tính Cs Cộng SS Salmonella -Shigella PTH Phó thương hàn BPW Buffered Pepton Water BSA Bismuth Sulfite Agar KN Kháng nguyên O O-Anttigen H H-Antigen K K-Antigen V- I Vùng V- II Vùng V -II Vùng LPS Lipopolysaccharide ST Heat Stable Toxin LT Heat Lable Toxin RPF Rapid permeability Factor viết tắt RPF DPF Delayed permeability Factor viết tắt DPF CHO Chinese Hamster Ovary cell PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1.Thời gian sống Salmonella loại môi trường Bảng 2.2 Đặc tính sinh hóa vi khuẩn Salmonella Bảng 3.1 Kết điều tra tình hình nhiễm bệnh địa bàn huyện Sơn Tịnh 32 Bảng 3.2 Kết phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu bệnh phẩm thu thập 33 Bảng 3.5 Kiểm tra kết độc lực chủng Salmonella phân lập chuột 39 Bảng 3.6.Kết kiểm tra tính mẫn cảm với số loại kháng sinh Salmonella 41 Bảng 3.7 Kết điều trị thử nghiệm 43 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma viii DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 3.3 Kết kiểm tra số đặc tính sinh hóa 36 Hình 3.4.c Khuẩn lạc mọc môi trường XLD 37 Hình 3.4.a Kết phân lập Salmonella mơi trường đặc hiệu SS 38 Hình 3.4.b Tăng sinh Salmonella môi trường BHJ 38 Hình 3.4.d Hình ảnh sau nhuộm Gram 38 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma PHẦN MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngành chăn nuôi tỉnh Quảng Ngãi ln chiếm vị trí trọng cấu sản xuất nơng nghiệp nói riêng kinh tế nước ta nói chung Chăn ni giúp tạo cơng ăn việc làm tạo cải tạo có giá trị góp phần phát triển kinh tế khơng tỉnh Quảng Ngãi Việc nâng cao chất lượng đàn gia súc, gia cầm ngày trọng đất nước gia nhập tổ chức Thương mại giới (WTO) Kế hoạch phát triển ngành chăn nuôi 2016 với: Tổng đàn heo đạt 27,500 triệu Trong đàn heo nái đạt 3.905 nghìn con, tỷ lệ nái ngoại đạt 24%, tỷ lệ heo lai, ngoại đạt 92,6% Tổng đàn gia cầm đạt 350,5 triệu con, đàn gà đạt 265 triệu Tổng sản lượng thịt loại đạt 5.009 nghìn Trong thịt heo đạt 3.603 nghìn tấn, thịt gia cầm đạt 987 nghìn Trứng loại đạt 9.290 triệu (Cục chăn ni 2015) Để hồn thành mục tiêu ta cần ý đến việc phát triển giống, thức ăn áp dụng khoa học kỹ thuật công tác thú y chăn nuôi Những năm gần ngành chăn nuôi vịt phát triển mạnh, từ chăn nuôi chạy đồng (chăn nuôi chủ yếu dựa vào thức ăn tự nhiên) đến chăn nuôi bán chăn thả chăn ni theo hướng ni nhốt hồn tồn Dịch bệnh đàn vịt mối lo ngại cho người chăn nuôi vịt địa bàn Quảng Ngãi Vi khuẩn Salmonella gây thiệt hại kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi vịt Quảng Ngãi Vi khuẩn Salmonella phân bố rộng rãi tự nhiên, đường tiêu hóa thủy cầm, mơi trường nước ao hồ bãi chăn Salmonella chủ yếu gây cho vịt 20 ngày tuổi, với tỷ lệ chết cao.Bệnh nguy hiểm cho sức khỏe cộng động số chủng Salmonella có liên quan đến ngộ độc thực phẩm người Thiệt hại bệnh gây bao gồm vịt bị bệnh, tỷ lệ vịt chết loại thải cao, vịt chậm lớn, tiêu tốn thức ăn nhiều, sức đề kháng giảm, ảnh hưởng đến chất lượng giống, tỷ lệ ấp nở thấp Nhằm đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng, tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 7046-2002) qui định khơng có vi khuẩn Salmonella 24gam thịt, có gia cầm sản phẩm gia cầm Vi khuẩn Salmonella không gây hại cho vật chủ mang bệnh mà ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng thực phẩm gây ngộ độc cho người sử dụng sản phẩm mang vi khuẩn Salmonella Trong lồi Salmonella S enterica chủng gây bệnh thương hàn nguy hiểm người Có nhiều tác giả nghiêm cứu vi khuẩn như: Nguyễn Ngọc Huân cộng (2006) xác định lưu hành Salmonella đàn vịt CV Super-M nuôi trại vịt giống Vigova Cù Hữu Phú cộng (2005) nghiên cứu thành cơng kít chẩn đốn nhanh vi khuẩn Salmonella gia cầm; Nguyễn Đức Hiền PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma cs (2012) nghiên cứu tượng kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Salmonella đàn vịt nuôi cần thơ Trần Linh Thước (2005) phát đề kháng thuốc kháng sinh chủng Salmonella phân lập từ bê, nghé Nghiên cứu lưu hành, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh hóa, độc lực, đề kháng độ mẫn cảm với loại kháng sinh phổ biến hiên điều trị thử nghiệm với Vi khuẩn Salmonella phân lập từ Vịt có ý nghĩa to lớn khoa học thực tiển Theo báo cáo hàng năm Chi cục thú y Quảng Ngãi cụ thể Trạm thú y Sơn Tịnh tình hình bệnh Salmonella gây vịt nghiêm trọng Những ảnh hưởng loại vi khuẩn địa bàn huyện Sơn Tịnh gây vịt chết cao, điều trị gặp nhiều khó khăn sử dụng kháng sinh đa số kháng sinh thị trường Sơn Tịnh mẫn cảm với vi khuẩn này; Vịt sau điều trị phát triển tỷ lệ mang trùng sản phẩm thịt vịt lớn Xuất phát từ thực tế đồng ý giáo viên hướng dẫn tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Salmonella gây bệnh vịt nuôi huyện Sơn Tịnh, tỉnh Quảng Ngãi” Mục tiêu đề tài Nghiên cứu lưu hành, tính mẫn cảm kháng sinh hướng dẩn điều trị cho người chăn nuôi địa bàn huyện Sơn Tịnh, tỉnh Quảng Ngãi điều trị bệnh Salmonella gây vịt Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu đề tài cung cấp thêm liệu khoa học chủng gây bệnh, đặc tính sinh học độ mẫn cảm kháng sinh số chủng vi khuẩn Salmonella gây bệnh hiệu điều trị gia cầm địa bàn huyện Sơn Tịnh, tỉnh Quảng Ngãi 3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Kết nghiên cứu phân lập vi khuẩn Salmonella nhằm xác định chủng vi khuẩn gây bệnh đàn vịt nuôi sơ để xác định biện pháp phòng bệnh cho đàn vịt, hạn chế ảnh hưởng điều kiện tự nhiên, nhằm làm giảm tỷ lệ mắc bệnh - Kết nghiên cứu nhằm đánh giá tính mẫn cảm vi khuẩn với kháng sinh thông dụng thi trường xác định khả kháng thuốc kháng sinh Salmonella sở để xác định phác đồ điệu trị phù hợp có hiệu cao đàn vịt nuôi, nhằm giảm tỷ lệ chết vịt tỷ lệ mang trùng vịt lớn, nâng cao hiệu kinh tế chăn nuôi - Hướng dẫn điều trị bệnh cách hiệu tránh kháng kháng sinh tiết kiệm cho người chăn nuôi PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC 1.1 CƠ SỞ LÝ LUẬN CHO CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.1 Vi khuẩn Salmonella Năm 1885 vi khuẩn Salmonella lần phát Salmon D.E Smith T phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm lợn tiêu chảy xem nguyên nhân gây bệnh dịch tả lợn Đến năm 1903 nhà khoa học xác định nguyên nhân gây bệnh dịch tả lợn virus cho Salmonella có vai trị kế phát (Nguyễn Như Thanh cs, 2000) Theo Woolcok (1973), 2000 chủng Salmonella phân lập có khoảng 5% số có khả gây bệnh cho người động vật 1.1.1.1 Đặc điểm chung Salmonella Trực khuẩn Salmonella thuộc Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae Giống Salmonella gồm loài: S enterica S bongori phân chia thành 2000 serotype theo bảng phân loại Kauffmann-White sở cấu trúc kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K) Gần đây, loài S enterica phân thành phân lồi là: S enterica subsp enterica, S enterica subsp salamae, S enterica subsp arizonae, S enterica subsp diarizinae, S enterica subsp houtenae, S enterica subsp indica Trong đó, phân loài S entericasubsp enterica gồm phần lớn chủng Salmonella tác nhân gây bệnh cho người động vật (Quinn P cộng sự, 2002) 1.1.1.2 Đặc điểm hình thái Theo Bergeys Manual (1994) (Bergeys M., 1994), vi khuẩn Salmonella trực khuẩn ngắn, hai đầu trịn, có kích thước 0,4 - 0,6 × 0,1 - 0,3 µm, bắt màu Gram âm, khơng hình thành nha bào giáp mơ Đa số lồi Salmonella có lông (flagella) từ - 12 xung quanh thân (trừ S gallinarum-pollorum) Lơng giúp cho vi khuẩn có khả di động Lơng có hình trịn, dài, xuất phát từ màng cytoplasma Do cấu trúc từ sợi protein hình xoắn nên co giãn di động nên lơng chúng khó nhuộm Nếu nhuộm phương pháp Haschem (1972) nhìn thấy chúng kính hiển vi điện tử (Lê Văn Tạo, 1993) Lơng có tính kháng ngun gen mã hóa tổng hợp protein riêng quy định Hầu hết chủng Salmonella có khả di động nhờ flagella dạng lông rung, ngoại trừ S galinarum Trước người ta cho S pulorum khơng có khả di động Nhờ kính hiển vi điện tử, cấu trúc roi type huyết phát dạng sợi mảnh có số lượng flagella S enteritidis PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Các chủng Salmonella có Fimbriae ( Pili hay lơng nhung ), trừ S paratyphi A Fimbriae có cấu tạo dạng lơng bao phủ bề mặt vi khuẩn giúp cho vi khuẩn bám dính vào tế bào chủ Fimbriae tạo thành từ đơn vị fimbrillin chứa lượng lớn amino acid kị nước (40%) (Đỗ Thị Huyền, Tô Long Thành, 2009) 1.1.1.3 Sức đề kháng Vi khuẩn Salmonella mẫn cảm với nhiệt độ chất sát trùng mạnh Ở nhiệt độ50ºC giờ, 70ºC 20 phút, 100ºC 15 phút ánh sáng mặt trời chiếu thẳng diệt vi khuẩn (Laval A., 2000) Các chất sát trùng thông thường dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn như: Phenol 5%, Formon 1/500 diệt vi khuẩn 15 - 20 phút Với hóa chất, Salmonella tỏ có sức chịu đựng cao: dung dịch MgCl2 1%, formon 0,2%, axit phenic 3% diệt Salmonella 15 - 20 phút Dung dịch muối ăn 19%, nhiệt độ 8ºC Salmonella tồn - tháng Nhưng số hóa chất Cristal violet, Malachite, Natrihyposunfit, Dixitrat, muối mật với nồng độ vừa đủ gây độc cho E coli khơng ảnh hưởng đến phát triển Salmonella Dựa vào tính chất người ta chế tạo mơi trường chọn lọc để kìm hãm phát triển E coli giúp cho Salmonella phát triển dễ dàng Theo Laval (2000), vi khuẩn Salmonella sống lâu điều kiện lạnh, chúng sống bột thịt tháng, điều liện môi trường pH chúng sống thời gian ngắn Salmonella chủ yếu ký sinh ống tiêu hóa người động vật Ngồi vi khuẩn cịn tìm thấy nước thải sinh hoạt, nước sông, nguồn nước khác đất Chúng có khả sống lâu nước (hàng tháng) đất (hàng năm) (Bảng 2.1) Bảng 2.1.Thời gian sống Salmonella loại môi trường Thời gian sống Môi trường 89 ngày Nước máy 115 ngày Nước ao 120 ngày Đất 280 ngày Đất đồng cỏ chăn nuôi 28 tháng Phân lồi thuộc họ chim “Nguồn: Đỗ Thị Huyền Tơ Long Thành, 2009” PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Vi khuẩn Salmonella tồn chất độn chuồng tới 30 tuần, sống độ sâu đất tới độ sâu 0,5 cm thời gian tháng Ở sàn gỗ, tường gỗ điều kiện ánh sáng 87 ngày, máng gỗ 108 ngày (Đào Trọng Đạt cs, 1995) Salmonella sống thịt ướp muối (29%) - tháng nhiệt độ từ 12ºC Xử lý miếng thịt nhiễm trùng hơ lửa hay nướng có tác dụng diệt Salmonella bên (Nguyễn Như Thanh,1997) 1.1.1.4 Đặc tính ni cấy Vi khuẩn Salmonella loại vi khuẩn phát triển điều kiện hiếu khí tùy tiện, dễ ni cấy Nhiệt độ thích hợp 37ºC, phát triển nhiệt độ từ - 42ºC Nuôi cấy 43ºC loại trừ tạp khuẩn mà Salmonella phát triển (Timoney J F cộng sự, 1988), pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển - 7, nhiên vi khuẩn phát triển pH từ - Khi nuôi cấy vi khuẩn môt trường bồi dưỡng (tăng sinh) BPW (Buffered Pepton Water) môi trường RV (Rappaports Vassiliadis) sau vài nuôi cấy thấy môi trường vởn đục nhẹ, sau 18 đến 24 thấy canh trùng đục đều, mặt mơt trường có màng mỏng, đáy ống nghiệm có cặn Trên mơi trường BSA (Bismuth Sulfite Agar): sau 48 nuôi cấy 37 0C, vi khuẩn Salmonella mọc lên khuẩn lạc đặc trưng, xung quanh khuẩn lạc màu nâu thẫm, vào khuẩn lạc đậm chuyển dần sang màu đen, khuẩn lạc có màu ánh kim (Nguyễn Như Thanh cộng sự, 2001) Trên môi trường thạch thường, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc dạng S (Smooth), tròn, sáng xám, nhẵn bóng, rìa gọn, lồi giữa, đường kính khoảng từ - 1,5 mm, thấy khuẩn lạc dạng R (rough), nhám, mặt mờ Môi trường thạch máu, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc trịn, màu xám, trơn bóng, lồi lên (Nguyễn Như Thanh, 2001) Trên môi trường MacConkey (MacC) vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc trịn, khơng màu Trên môi trường BSA Salmonella mọc khuẩn lạc đặc trưng: xung quanh màu nâu sẫm, vào màu vàng đậm, gần đen, khuẩn lạc có màu ánh kim (Timoney cs, 1988) Vi khuẩn Salmonella thể tính kiềm, hình thành khuẩn lạc màu đỏ môi trường BGA Trong mơi trường TSI hình thành khuẩn lạc nhạt màu, mặt nghiêng mơi trường có màu đỏ, màu hồng đáy sản sinh H2S làm cho môi trường chuyển màu đen (Quinn P J cộng sự, 1994) Trên môi trường SS (Shigella – Salmonella Agar): Salmonella hình thành khuẩn lạc trịn, bóng có tâm đen PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Trên môi trường Kligler: mặt nghiêng môi trường không đổi màu vi khuẩn không lên men đường lactose, phần thạch đứng môi trường đổi từ màu đỏ tím sang màu vàng chanh, xen kẽ thạch có bọt khí vi khuẩn lên men đường glucose làm thay đổi pH môi trường sinh Trong thực tế vi khuẩn sinh H2S, nên phần thạch đứng có màu đen, nên màu vàng thường bị lấn át, khó quan sát mắt thường Nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường nồng độ muối, liên quan chặt chẽ đến phát triển vi khuẩn Salmonella Nhiệt độ thích hợp cho phát triển vi khuẩn 37ºC Tuy nhiên Salmonella mọc tốt nhiệt độ 42ºC.Đặc tính ứng dụng phân lập Salmonella nhằm ức chế vi khuẩn khác bệnh phẩm bị nhiễm Mơi trường có pH 6,5 - 7,5 thích hợp cho phát triển vi khuẩn (Nguyễn Như Thanh, 1990) Tuy Salmonella phát triển pH từ 4,5 9,0 Nồng độ muối NaCl - 4% môi trường ức chế phát triển Salmonella 1.1.1.5 Tính trạng sinh hóa Theo Quinn cs (2002), giống vi khuẩn Salmonella chia làm phân nhóm, phân nhóm có khả lên men số loại đường định không đổi Phần lớn phân loài Salmonella enteritica subsp enteritica gây bệnh cho động vật máu nóng Chúng lên men sinh hơi: Glucose, Manit, Mantose, Galactose, Dulcitol, Arabonose, Sorbitol Cũng nhóm này, chủng Salmonella không lên men Lactose Saccharose Vi khuẩn Salmonella có phản ứng indol âm tính, MR âm tính, VP âm tính, sử dụng citrat dương tính, di động, lysin decarboxylaza dương tính, adonit âm tính, lên men manit, thường không lên men lactose, saccharose trừ số ngoại lệ dạng huyết thanh, dạng sinh học định (Phạm Hồng Sơn, 2002) Bảng 2.2 Đặc tính sinh hóa vi khuẩn Salmonella Phản ứng sinh hóa Biểu Maltose + Glucose + Lactose - H2 S +/- Citrate - PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Phản ứng sinh hóa Biểu Ure - Nitrate + Indol - Voges Proskauer - Mobility + Rouge Methyl “Nguồn: Theo Ewing Eward (1970) 1.1.1.6 Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn Salmonella Cấu trúc kháng nguyên Salmonella phức tạp, gồm nhiều loại Theo Phạm Hồng Sơn (2002) Salmonella có 67 loại kháng nguyên O (có nhiều tài liệu công bố 80 loại), 94 loại kháng nguyên H pha 1, 11 kháng nguyên H pha 2, kháng nguyên K kháng nguyên Vi Cần phân biệt loại kháng nguyên vi khuẩn Salmonella là: Kháng nguyên O (O-Antigen): kháng nguyên thân Kháng nguyên H (H-Antigen): kháng nguyên lông Kháng nguyên K (K-Antigen): kháng nguyên vỏ 1.1.1.7 Kháng nguyên thân O (O-Antigen) Kháng nguyên O nằm thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúc Lipopolysacharide (LPS) thành phần cấu tạo nên lớp màng ngồi thành tế bào vi khuẩn Gram âm Kháng nguyên O chịu nhiệt (Heat-stable) kháng cồn, bị biến tính sử dụng formaldehyde Kháng nguyên O gồm nhóm chính: Polysaccharde khơng có nhóm hydro, khơng mang tính đặc trưng kháng nguyên tạo khác biệt hình thái khuẩn lạc từ dạng S (Smooth) sang dạng R (Rough) dẫ đến giảm độc lực vi khuẩn (Selbitz H., 1995) Polysacharide nằm có nhóm hydro định kháng nguyên đặc trưng serotype Kháng nguyên O xem nội độc tố (Endotoxin) mà cấu tạo nhóm hỗn hợp Glyco-polypeptid tìm thấy màng ngồi vỏ bọc vi khuẩn PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Theo CIRAD (2006) (CIRAD, October 2006), kháng nguyên thân O vi khuẩn Salmonella có 67 loại chính, chia thành 50 nhóm, số cịn lại đóng vai trị phụ 1.1.1.8 Kháng nguyên lông H (H-Antigen) KN - H Salmonella chất protein nằm phần lông vi khuẩn KN - H không chịu nhiệt, bền vững so với KN - O; bị phá huỷ 600ºC giờ, dễ bị phá hủy cồn axit yếu KN - H khơng có ý nghĩa việc tạo miễn dịch phòng bệnh, có ý nghĩa việc phân loại, định danh vi khuẩn KN - H không định yếu tố độc lực, khơng có vai trị bám dính, có tác dụng bảo vệ vi khuẩn đường ruột tránh tiêu diệt đại thực bào, giúp vi khuẩn sống nhân lên tế bào gan, thận đại thực bào (Weinstein D L cộng sự, 1984) KN - H chia làm pha: Pha có tính chất đặc hiệu, gồm có 28 kháng ngun lông, biểu thị chữ la tinh thường: a, b, c, d, f, g hết 28 chữ người ta sử dụng chữ f số đứng bên phải chữ f Ví dụ f5, f27 Pha khơng có tính chất đặc hiệu, gồm có loại, biểu thị chữ số Ả rập: 1, 2, 3, 4, 5, Pha pha biểu thị H H2 kiểm tra phát động H2 (Promoter H2), nhờ phát động mà chuyển ngược lại mặt thúc đẩy H2 ức chế H1 H2 bị ức chế H1 lại hoạt động (Kneckner N cộng sự, 1997) 1.1.1.9 Kháng nguyên vỏ K Kháng ngun vỏ có số lồi S typhi, S paratyphi, S dublin chứa Vi - Antigen giống K - Antigen E coli Theo Kauffmann F M D (1972) có loại kháng nguyên K là: kháng nguyên (KN - 5), kháng nguyên Vi (KN - Vi), kháng nguyên M (KN - M) Đây kháng nguyên vỏ (capsular) phân thành nhiều nhóm họ vi khuẩn đường ruột, biểu thị chữ A, B, L nhờ đặc điểm sinh hoá khác (Chữ K bắt nguồn từ chữ Kapsel tiếng Đức) KN - dễ bị axit HCl phá hủy tính chất ngưng kết KN - hoàn toàn bị phá hủy nhiệt độ 120ºC, không bị phá hủy cồn KN - Vi có sức đề kháng cao với cồn axit HCl KN - Vi không liên quan đến độc lực vi khuẩn, đóng vai trị việc tạo miễn dịch chủ động thụ động động vật người PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma 1.1.2 Các yếu tố gây bệnh vi khuẩn Salmonella Để thực trình gây bệnh vật chủ, Salmonella sử dụng yếu tố độc tố số kháng nguyên (O, K, H), khả bám dính, xâm nhập, tổng hợp sắt, kháng kháng sinh Các yếu tố độc tố độc tố đường ruột (Enterotoxin), nội độc tố (Endotoxin) 1.1.3 Các yếu tố độc tố Kháng nguyên O: Chất lượng thành phần hóa học, cấu trúc kháng nguyên O ảnh hưởng tới độc lực vi khuẩn Salmonella Kháng nguyên O yếu tố độc lực giúp vi khuẩn chống lại khả phòng vệ vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển tổ chức, chống lại thực bào đại thực bào (Morris I A cộng sự, 1976) Kháng nguyên O kích thích quan đáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể đặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên tương ứng Cơ chế phòng vệ giúp thể vật chủ chống lại trình tái xâm nhập vi khuẩn Kháng ngun H: kháng ngun H khơng có ý nghĩa việc tạo miễn dịch phịng bệnh, khơng định yếu tố độc lực, có vai trị bảo vệ cho vi khuẩn khơng bị tiêu diệt trình thực bào, giúp vi khuẩn sống nhân lên tế bào đại thực bào, tế bào gan thận (Weinstein D L cộng sự, 1984) Kháng nguyên K: tạo hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại ngoại cảnh tượng thực bào (Nguyễn Như Thanh, 2001) Yếu tố bám dính: Là yếu tố quan trọng vi khuẩn đường ruột, giúp vi khuẩn bám vào tế bào vật chủ, yếu tố bám dính cịn kháng nguyên bám dính Khi vi khuẩn cư trú đường tiêu hóa, q trình di động xảy tượng tiếp xúc vi khuẩn tế bào nhung mao ruột Sự tiếp xúc tình cờ ngẫu nhiên, gặp điều kiện thuận lợi bề mặt tế bào niêm mạc ruột tiếp xúc tăng tính bền vững vi khuẩn lại lâu lớp nhầy Tiếp theo tiếp xúc hấp phụ vi khuẩn lên bề mặt niêm mạc ruột yếu tố bám dính (Fimbriae typ I) vi khuẩn bám vào điểm tiếp nhận tế bào nhung mao Quá trình bám dính vi khuẩn lên tế bào nhung mao thực có phù hợp cấu trúc phân tử điểm tiếp cận (Jones G W., Richardson A L., 1981).Theo Lê Văn Tạo (1993), tế bào vi khuẩn Salmonella có từ 250-400 fimbriae, chúng giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột non để gây bệnh Khả xâm nhập: Vi khuẩn xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột bước cần thiết quy trình gây bệnh Sự xâm nhập Salmonella vào tế bào biểu mô ruột trình tổng hợp gồm nhiều yếu tố tham gia PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma 10 Theo Finlay cs (1988) khả xâm nhập vào tế bào có nhân lớp niêm mạc đường ruột đặc tính số chủng Salmonella có độc lực Các biến chủng Salmonella khơng có khả xâm nhập vào tế bào thường chủng khơng có độc lực Sau tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella tác động làm tăng hàm lượng Ca++ nội bào, hoạt hóa actin depolimeriring enzymes, làm thay đổi cấu trúc, hình dạng sợi actin, biến đổi màng tế bào, dẫn đến hình thành giả túc bao vây tế bào vi khuẩn dạng khơng bào chứa vi khuẩn Sau đó, Salmonella xâm nhập vào tế bào, tồn tại, tiếp tục phát triển nhân lên với số lượng lớn phá vỡ tế bào vật chủ, sản sinh enterotoxin, làm xuất trình tiêu chảy vật chủ Các hạch viêm tích nước, biểu viêm hạch hệ đáp ứng xâm nhiễm Salmonella (Frost A J cộng sự, 1997) Khả tổng hợp sắt: Theo Benjamin (1985), yếu tố giúp vi khuẩn Salmonella tăng nhanh số lượng làm suy yếu khả chống đỡ vật chủ bị thiếu sắt Cũng theo tác giả, vi khuẩn Salmonella có phản ứng với thay đổi chế chu chuyển sắt; trình tổng hợp sắt bị ức chế, chúng chuyển toàn protein màng điều phối sắt lên bề mặt tế bào vi khuẩn, làm cho khả hấp thu sắt tăng cường cách rõ rệt Khả kháng kháng sinh Theo Kneckner cs (1997) vi khuẩn có sẵn yếu tố gây bệnh khả kháng kháng sinh làm tăng tính gây bệnh vi khuẩn tăng lên gấp bội Việc sử dụng rông rãi loại thuốc kháng sinh để phịng trị bệnh, kích thích sinh trưởng gia súc,gia cầm, tạo nhiều giống vi khuẩn có khả kháng thuốc, mang plasmid kháng kháng sinh, tồn lâu thể người, vật nuôi mơi trường Khả kháng kháng sinh Salmonella thay đổi, phụ thuộc vào địa phương thời điể m làm kháng sinh đồ, loại vật nuôi 1.1.4 Các yếu tố độc tố Nếu yếu tố gây bệnh độc tố tác nhân gián tiếp, quan trọng trình sinh bệnh vi khuẩn Salmonella, yếu tố độc tố lại tác nhân trực tiếp định trình sinh bệnh Các yếu tố gây bệnh độc tố Salmonella bao gồm: nội độc tố (Endotoxin), ngoại độc tố đường ruột (Enterotoxin) độc tố tế bào (Cytotoxin) (Finlay B B., Falkow, 1988) PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma 11 1.1.4.1 Nội độc tố (Endotoxin) Nội độc tố thường Lipopolysaccharide (LPS) giải phóng từ vách tế bào vi khuẩn bị dung giải Dưới tác động nội độc tố quan tế bào có biểu thể vật chủ có biểu tắc mạch máu, giảm trương lực cơ, thiếu oxy, toan huyết, rối loạn tiêu hóa… Evan D.G Evan D.J (1973) nghiên cứu độc tố đường ruột Salmonella cho thấy độc tố gồm hai thành phần độc tố thẩm xuất nhanh (Rapid permeability Factor viết tắt RPF) độc tố thẩm xuất chậm (Delayed permeability Factor viết tắt DPF) Theo Peterson J.W (1980) độc tố thẩm xuất nhanh giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột, cấu trúc thành phần giống độc tố chịu nhiệt E coli, gọi độc tố chịu nhiệt Salmonella (Heat Stable Toxin viết tắt ST) Độc tố thẩm xuất chậm có thành phần giống độc tố không chịu nhiệt vi khuẩn E coli, nên gọi độc tố không chịu nhiệt Salmonella (Heat Lable Toxin viết tắt LT) Nội độc tố tác động trực tiếp lên hệ thống miễn dịch thể vật chủ, kích thích hình thành kháng thể, tăng tiết histamine, serotonia; ngưng kết tiểu cầu gây tắc mạnh quản LPS tác động lên q trình biệt hóa tế bào lympho B, tăng cường tổng hợp globulin miễn dịch (IgM IgG); tăng cường chức lâm ba cầu T tế bào miễn dịch trung gian Sau bám lên “điểm tiếp nhận”, LPS hấp thu, vận chuyển vào nguyên sinh chất tế bào Tại đây, chúng kết hợp với lysosomes hình thành dạng lysosomes thứ cấp, giải phóng enzym, đẩy mạnh q trình phân bào, đồng thời cường tổng hợp mARN, phá hủy mitochodria bào quan khác Sau vận chuyển qua màng vào nguyên sinh chất tế bào, LPS bám lên màng mitochondria vận chuyển vào màng Tại chúng m thay đổi cấu trúc chức màng này, dẫn đến tăng cường hoạt động ATP - aza; gây tượng tích lũy ADP phốt vô nguyên sinh chất tế bào, từ làm tăng cường phân giải glucose Do tác động mitochondria với LPS, dẫn tới tăng xuất H 2O2 vàO2, phá hủy màng bào quan khác PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma 12 1.1.4.2 Độc tố đường ruột (Enterotoxin) Độc tố đường ruột vi khuẩn Salmonella có hai yếu tố chính: yếu tố thẩm xuất nhanh (Rapit Permeability Factor - viết tắt RPF) yếu tố thẩm xuất chậm (Delayed Permeability Factor - viết tắt DPF) (Peterson J W., 1980) Yếu tố thẩm xuất nhanh giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô một, làm trương tế bào CHO (Chinese Hansten Ovary Cell) Yếu tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc, thành phần giống độc tố chịu nhiệt E coli gọi độc tố chịu nhiệt Salmonella (Heat Stable Toxin - viết tắt ST), cấu trúc phân tử gồm chuỗi polysaccarit số chuỗi poly-peptit phân tử lượng lớn 90.000 dalton, chịu nhiệt độ 1000C giờ, bị phá huỷ nhanh hấp cao áp bền vững nhiệt độ thấp Độc tố làm tăng tính thấm thành mạnh, phá hủy mạch máu cục Độc tố RPF kích thích lên hệ thống men Guanylate Cyclase tế bào biểu mô ruột, chuyển GTP thành GDP Trong tế bào, GDP tăng cao làm cho nồng độ Ca ++ tăng cao, dẫn đến ngăn cản hấp thu chất điện giải nước xoang ruột Do vậy, lượng nước ruột tăng cao, kích thích niêm mạc ruột, tăng co bóp, cho gia súc ỉa chảy Yếu tố thẩm xuất chậm có thành phần giống độc tố không chịu nhiệt E coli, nên gọi độc tố không chịu nhiệt Salmonella (Heat Lable Toxin - viết tắt LT), cấu trúc phân tử gồm chuỗi polypeptit số hợp chất khác, phân tử lượng 40.000 - 50.000 dalton Độc tố bị phá hủy 70ºC phút 56ºC Độc tố không chịu nhiệt Salmonella làm thay đổi trình trao đổi nước chất điện giải thể dẫn đến rút nước vào lòng ruột gây tiêu chảy Khi người động vật bị tiêu chảy, hàng loạt tế bào biểu mô ruột bị phá hủy bị tổn thương độc tố tế bào (cytoxin) Salmonella gây theo chế ức chế tổng hợp protein tế bào EU Karyota làm trương tế bào CHO Theo Clarke cs (1988), độc tố tế bào có dạng ức chế tổng hợp protein tế bào Hela làm teo tế bào; có dạng dung giải khơng bào nội bào, làm chết tế bào Vera, tế bào Hela tế bào CHO Như vậy, Salmonella gây bệnh yếu tố làm biến đổi cấu trúc, chức tế bào biểu mơ ruột, làm rối loạn q trình tiêu hóa - hấp thu, dẫn đến hội chứng tiêu chảy 1.1.4.3 Độc tố tế bào (Cytotoxin) Đặc tính chung Cytotoxin có khả ức chế tổng hợp Protein tế bào có nhân làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell), đa phần độc tố chúng bị phá hủy nhiệt độ PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ... hành thực đề tài ? ?Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Salmonella gây bệnh vịt nuôi huyện Sơn Tịnh, tỉnh Quảng Ngãi? ?? Mục tiêu đề tài Nghiên cứu lưu hành, tính mẫn cảm kháng sinh hướng dẩn điều... BỆNH DO SALMONELLA TRÊN ĐÀN VỊT NUÔI TẠI HUYỆN SƠN TỊNH 32 3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN SAMONELLA TRÊN VỊT NUÔI TẠI HUYỆN SƠN TỊNH 33 3.3 KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ CỦA... chủng gây bệnh, đặc tính sinh học độ mẫn cảm kháng sinh số chủng vi khuẩn Salmonella gây bệnh hiệu điều trị gia cầm địa bàn huyện Sơn Tịnh, tỉnh Quảng Ngãi 3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Kết nghiên cứu phân