KHOA HỌC CÔNG NGHỆ N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n KỲ 2 TH¸NG 10/2020 85 NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM NHŨ TƯƠNG TỪ HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA CÂY BẠCH ĐÀN TRẮNG (Eucalyptus camaldulensis Dahnardt) PHỤC V[.]
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM NHŨ TƯƠNG TỪ HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA CÂY BẠCH ĐÀN TRẮNG (Eucalyptus camaldulensis Dahnardt) PHỤC VỤ PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY Ở TÔM CHÂN TRẮNG Lê Minh Hải1, Mai Thị Minh Ngọc2 , Đồn Quốc Hưng1 TĨM TẮT Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPNS) tác nhân vi khuẩn V parahaemolyticus gây nguyên nhân ảnh hưởng trực tiếp tới phát triển bền vững ngành nuôi tôm công nghiệp Nghiên cứu tiến hành nhằm mục đích tìm thơng số kỹ thuật tối ưu quy trình trích lý tinh dầu bạch đàn, đánh giá khả kháng khuẩn tinh dầu chế phẩm nhũ tương tinh dầu bạch đàn chủng vi khuẩn V parahaemolyticus DHM-03.18, V parahaemolyticus DHM-04.19 gây bệnh AHPNS tôm nuôi điều kiện phịng thí nghiệm in vitro Kết nghiên cứu cho thấy yếu tố trích lý, có ảnh hưởng đến hiệu suất trích lý tinh dầu bạch đàn điều kiện phù hợp để chưng cất tinh dầu bạch đàn phương pháp lôi nước là: tỷ lệ nguyên liệu/nước 1/7, nhiệt độ 1400C, thời gian 4,5 Thử nghiệm cho thấy khả ức chế chủng vi khuẩn Vibrio gây AHPNS dịch chiết tinh dầu Bạch đàn trắng tương đối tốt, khả ức chế vi khuẩn tỷ lệ thuận với lượng tinh dầu bổ sung Đường kính vịng vơ khuẩn thu thấp 9,35 mm ứng với lượng tinh dầu 25 µl đường kính vịng vơ khuẩn thu cao 23,55 mm với nồng độ thảo dược 100 µl Sử dụng chế phẩm nhũ tương tinh dầu bạch đàn trắng trị bệnh AHPNS tôm chân trắng cho thấy tỷ lệ chết giảm Từ khóa: AHPNS, bạch đàn, tinh dầu, Vibrio, tơm chân trắng ĐẶT VẤN ĐỀ2 Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPNS) tác nhân vi khuẩn V parahaemolyticus gây nguyên nhân ảnh hưởng trực tiếp tới phát triển bền vững ngành nuôi tôm công nghiệp Do tác nhân gây AHPNS vi khuẩn nên việc lạm dụng kháng sinh nuôi tôm phổ biến lại trở nên thường xuyên tràn lan Sự lạm dụng thuốc kháng sinh thiếu hiểu biết kháng sinh nuôi trồng thủy sản nói chung gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe động vật nuôi, môi trường sinh thái đặc biệt tạo chủng vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh, làm giảm hiệu điều trị bệnh tăng nguy nhiễm khuẩn có khả kháng thuốc cho người, động vật tồn dư thịt động vật thủy sản (Brown, 1989) Do vậy, hướng nghiên cứu chất có hoạt tính kháng khuẩn nguồn gốc thảo dược tập trung nghiên cứu nhằm tạo sản phẩm sử dụng phòng Trường Đại học Vinh Trường Đại học Mở Hà Nội trị bệnh mà thân thiện với mơi trường đảm bảo an tồn thực phẩm (Cos et al., 2006) Kháng sinh có nguồn gốc thảo dược nghiên cứu ứng dụng phòng trị bệnh (Nguyễn Văn Thanh Nguyễn Thanh Hải, 2014) Dịch chiết sim dịch chiết hạt sim cho kết kháng vi khuẩn gây AHPNS điều kiện in vitro (Đặng Thị Lụa cs., 2015) Cây bạch đàn trắng xem dược liệu dùng tươi, khô bào chế thành tinh dầu Tinh dầu bạch đàn trắng sử dụng để làm thuốc hỗ trợ kháng khuẩn đường hô hấp chữa số bệnh da Là nguyên liệu cho chất gơm, có tác dụng điều trị tiêu chảy, dùng làm săn niêm mạc họng, chống nhiễm trùng vết thương, chữa họng bị giãn hỗ trợ cải thiện số bệnh lý nha khoa (Đỗ Tất Lợi, 1999) Nhiều nghiên cứu khẳng định, hoạt chất chiết xuất từ bạch đàn trắng có khả tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn gây bệnh có chủng vi khuẩn kháng lại nhiều loại kháng sinh Trong nghiên cứu này, xác định yếu tố trích ly tối ưu trích ly tinh du Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 10/2020 85 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ bạch đàn thử nghiệm, đánh giá khả kháng khuẩn tinh dầu bạch đàn trắng chế phẩm dạng nhũ tương số chủng vi khuẩn gây bệnh AHPNS nguy hiểm tôm, làm sở khoa học cho việc chế tạo sản phẩm phòng trị bệnh động vật thủy sản có nguồn gốc thảo dược VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Lá bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dahnardt) thu hái loại trưởng thành sau búp hai lá, rửa sấy nhiệt độ 400C đến khô Lá khô nghiền nhỏ đến đường kính < 0,1 mm, bảo quản túi nilon kín 40C làm nguyên liệu để tách chiết Vi khuẩn V parahaemolyticus DHM-03.18, V parahaemolyticus DHM-04.19 gây AHPND lưu giữ Phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Hà Nội Nguyên vật liệu khác bao gồm: Môi trường chọn lọc vi khuẩn Vibrio Thiosulfate Citrate Bile Salts (TCBS) rắn, sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn Môi trường Nutrient Broth (NB) dạng lỏng có bổ sung 2% NaCl, hấp khử trùng 121oC 15 phút dùng để nuôi cấy thu dịch vi khuẩn Môi trường Mueller Hinton Agar (MA) bổ sung 2% NaCl hấp tiệt trùng để nguội tới 40 - 50oC, đổ vào đĩa petri có đường kính 10 cm với độ dày ± 0,2 mm, sử dụng để thử kháng sinh đồ 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp lôi nước tách chiết tinh dầu bạch đàn trắng Nguyên tắc: Bột bạch đàn khô bổ sung nước gia nhiệt hỗn hợp sôi, nước tạo thành lôi tinh dầu lên 40 g bột bạch đàn khô bổ sung nước cất với tỷ lệ 1/5, 1/6, 1/7, 1/8 1/9 (bột bạch đàn: nước cất) gia nhiệt nhiệt độ 100-1400C thời gian 2,5-5 Hỗn hợp lỏng tiếp tục vào hệ thống làm nguội ngưng tụ tạo thành dung dịch tinh dầu thô Dung dịch bổ sung muối khan Na2SO4 với hàm lượng 5% khối lượng/thể tích tinh dầu để tách, ly tâm thu tinh dầu tinh chế 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn Các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus DHM03.18, V parahaemolyticus DHM-04.19 cấy đĩa thạch TCBS tủ ấm 290 C/24 để chọn 86 khuẩn lạc đơn điển hình Khuẩn lạc đơn ni cấy lắc bình tam giác với mơi trường NB có bổ sung 2% NaCl đặt tủ ấm lắc 290C, tốc độ lắc 200 vòng/phút 15 Mật độ vi khuẩn sau nuôi cấy môi trường NB xác định theo phương pháp đo mật độ quang (OD) bước sóng = 600 nm Mật độ vi khuẩn sử dụng để định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) mẫu tinh dầu là 108 cfu/ml 2.2.3 Phương pháp thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Xác định MIC (Minimum Inhibitory Concentration) xác định theo phương pháp hịa tan mơi trường lỏng TSB Pha dung dịch đối chứng tinh dầu thành dãy nồng độ cần thử Dãy nồng độ tinh dầu cần thử ppm, 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm, 160 ppm, 320 ppm, 640 ppm, 1280 ppm, 2560 ppm Dùng micro pipette hút tinh dầu pha loãng theo dãy nồng độ thử dung dịch đối chứng (DMSO) vào ống nghiệm chuẩn bị sẵn môi trường Lắc cho tinh dầu dung dịch đối chứng hịa tan vào mơi trường Dùng micro pipette hút 20 µl dịch vi khuẩn chuẩn bị đưa vào ống nghiệm Nuôi 290C/24 Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Đọc kết quả, tìm MIC tinh dầu cho loại vi khuẩn 2.2.4 Phương pháp bào chế nano nhũ tương - Pha nước: nước, glycerin, dung dịch đệm phosphat pH 7,4 đun nóng 70 - 750C - Pha dầu: Tween 80, tinh dầu, Transcutol HP: đun nóng 65-700C - Kết hợp pha, siêu âm phút; lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm 2.2.5 Xác định hình thái, kích thước hạt nano nhũ tương Dữ liệu chụp hình trợ giúp máy TEM (Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương) 2.2.6 Phương pháp thử nghiệm động vật thí nghiệm Tơm chân trắng (Litopenaeus vannamei) giai đoạn PL15 mua từ Tập đoàn Việt Úc, tơm trước thí nghiệm xác định âm tính với V parahaemolyticus kỹ thuật PCR, sau tôm dưỡng độ mặn 15‰ 15 ngày Tôm chân trắng ăn thức ăn bổ sung tinh dầu bạch đàn nhũ tương tinh dầu bạch đàn sau 30 Nông nghiệp phát triển nông thôn - KỲ - TH¸NG 10/2020 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ ngày gây nhiễm với sinh khối 02 chủng vi khuẩn V parahaemolyticus DHM-03.18, V parahaemolyticus DHM-04.19 có mật độ vi khuẩn 108CFU/ml phương pháp ngâm (Loc et al., 2013) Cụ thể, thí nghiệm gây nhiễm gồm cơng thức thí nghiệm lặp lại lần, cụ thể 1) công thức đối chứng dương: không bổ sung cao chiết gây nhiễm V parahaemolyticus; 2) cơng thức thí nghiệm 0,5%: tinh dầu bạch đàn nhũ tương tinh dầu bạch đàn mức 0,5% gây nhiễm V parahaemolyticus; 3) cơng thức thí nghiệm 1,0%: tinh dầu bạch đàn nhũ tương tinh dầu bạch đàn 1,0% gây nhiễm V parahaemolyticus; 4) cơng thức thí nghiệm 1,5%: tinh dầu bạch đàn nhũ tương tinh dầu bạch đàn 1,5% gây nhiễm V parahaemolyticus; 5) công thức đối chứng âm: Không bổ sung cao chiết không nhiễm V parahaemolyticus Tơm bố trí bể kính tích 50 lít, độ mặn 15‰ sục khí liên tục với số lượng 20 con/bể Tơm chết sau gây nhiễm ghi nhận dấu hiệu bệnh lý tái định danh lại vi khuẩn gây nhiễm kỹ thuật PCR Tỷ lệ sống (%) = (Tổng số tơm thí nghiệm - Tổng số tơm thí nghiệm chết) × 100 2.2.7 Xử lý số liệu Các thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên lặp lại lần Số liệu xử lý thống kê sinh học sử dụng Paired t-test với sai khác có ý nghĩa P < 0,05 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nghiên cứu điều kiện trích ly tinh dầu bạch đàn trắng 3.1.1 Xác định tỷ lệ nước bổ sung vào mẫu trích ly Trong q trình trích ly phương pháp lôi nước, nước bổ sung vào mẫu bột bạch đàn gia nhiệt thẩm thấu vào lớp tế bào, gây phá vỡ túi tinh dầu lôi tinh dầu theo nước trình chưng cất Nếu lượng nước q khơng đủ hịa tan chất keo, muối bao bọc xung quanh túi tinh dầu, làm tinh dầu khơng Sử dụng nhiều dung mơi để trích ly khả khuếch tán tinh dầu vào dung môi lớn (Đặng Thị Lụa, 2015) Tuy nhiên, giới hạn định lượng tinh dầu thu hồi tăng lên không đáng kể dù tăng lượng dung mơi Bên cạnh đó, lượng nước nhiều làm giảm hiệu kinh tế trình chưng cất tốn lượng cấp nhiệt, tăng thể tích thiết bị Do vậy, xác định tỉ lệ ngun liệu/dung mơi thích hợp cho q trình trích ly để đạt hiệu kinh tế cao cần thiết Trong thí nghiệm cố định bột bạch đàn 40 g thay đổi lượng nước thêm vào để đạt tỷ lệ nguyên liệu/dung môi từ 1/5 đến 1/9 Hình Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến lượng tinh dầu bạch đàn Kết nghiên cứu số liệu hình cho thấy lượng tinh dầu thu có xu hướng tăng tỷ lệ thuận với lượng dung môi sử dụng Với mẫu tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, lượng tinh dầu thu tương ứng 0,51; 0,57; 0,69; 0,69 0,66 ml Quy luật biến thiên phù hợp với công bố trước Nguyễn Hoàng Lan cộng (2014) nghiên cứu cơng nghệ trích ly tinh dầu từ tía tô Từ kết nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu/nước 1/7 cho thí nghiệm 3.1.2 Xác định nhiệt độ trích ly Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến q trình trích ly tinh dầu Kết khảo sát ảnh hưởng mức nhiệt độ khác (100 - 1400 C) đến lượng thu hồi tinh dầu bạch đàn trình bày hình Hình Sự biến thiên lượng tinh dầu bạch đàn theo nhiệt độ trích ly Kết nghiên cứu cho thấy lượng tinh dầu thu nhận tăng dần theo mức nhiệt độ 100, 110, 120, 130, 1400C đạt giá trị cao 1400C với giá N«ng nghiƯp phát triển nông thôn - K - THáNG 10/2020 87 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ trị tương ứng 0,88; 0,94; 1,12, 1,58; 1,60 ml Với kết thu xác định nhiệt độ chưng cất 1400C Kết nghiên cứu công bố trước Nguyễn Thị Hoàng Lan cộng (2014) nghiên cứu cơng nghệ trích ly tinh dầu từ tía tơ cho thấy nhiệt độ trích lý tinh dầu mức nhiệt độ: 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC hiệu suất thu nhận tinh dầu tăng hiệu suất thu nhận tinh dầu đạt cao (92,11%) Tăng nhiệt độ lên 70oC, hiệu suất thu nhận lại giảm (89,91%) Do đó, nhiệt độ 60oC thích hợp cho q trình trích ly tinh dầu tía tơ So sách kết nghiên cứu với nghiên cứu Nguyễn Hoàng Lan cộng (2014) nghiên cứu cơng nghệ trích ly tinh dầu từ tía tơ có khác biệt mức nhiệt độ trích lý lồi bạch đàn trắng tía tơ 3.1.3 Xác định thời gian trích ly Thời gian trích ly phụ thuộc vào yếu tố: nguyên liệu, dung mơi, nhiệt độ, bên cạnh đó, ngun tắc thời gian trích ly dài hàm lượng tinh dầu thu hồi cao (Đặng Thị Lụa, 2015) Tuy nhiên, kéo dài thời gian đến giới hạn định lượng tinh dầu thu khơng tăng nữa, đồng thời ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm Do vậy, cần xác định thời gian trích ly thích hợp Thời gian trích ly khảo sát từ 35 Hình Sự biến thiên lượng tinh dầu bạch đàn theo thời gian trích ly Số liệu hình cho thấy: lượng tinh dầu thu hồi có xu hướng tăng theo thời gian trích ly Cụ thể lượng tinh dầu từ mẫu thí nghiệm chưng cất 3; 3,5; thu tương ứng là: 0,87; 1,08; 1,15; 1,18 ml Tuy nhiên, mẫu chưng cất lượng tinh dầu thu hồi tương đương với lượng tinh dầu thu hồi sau trích ly Kết phù hợp với quy luật biến thiên lượng sản phẩm 88 thu tách chiết tinh dầu riềng theo công bố Võ Kim Thành cộng (2010) Mặt khác, thời gian trích ly kéo dài làm tiêu hao nhiều lượng cho trình cấp nhiệt Nguyễn Hồng Lan cộng (2014) nghiên cứu cơng nghệ trích ly tinh dầu từ tía tơ thời gian trích ly khảo sát 10, 11,12, 13, 14 giờ, kết nghiên cứu cho thấy thời gian trích ly dài hiệu suất thu nhận tinh dầu cao Tuy nhiên, thời gian tăng lên 13 14 hiệu suất thu nhận tinh dầu có tăng khơng đáng kể Vì vậy, thời gian thích hợp để trích ly tinh dầu bạch đàn phương pháp chưng cất lôi nước 4,5 3.2 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn tinh dầu bạch đàn Tác dụng diệt khuẩn tinh dầu bạch đàn vi khuẩn gây AHPNS Khả diệt vi khuẩn gây AHPNS tinh dầu bạch đàn thể bảng hình Kết cho thấy tinh dầu bạch đàn có khả ức chế chủng vi khuẩn Vibrio gây AHPNS, đường kính vịng vơ khuẩn bình quân tăng dần theo lượng tinh dầu bạch đàn sử dụng Bảng Tác dụng tiêu diệt vi khuẩn gây AHPNS tinh dầu bạch đàn in vitro Lượng Đường kính vịng vơ khuẩn (mm)/các tinh chủng vi khuẩn dầu sử dụng V parahaemolyticus V parahaemolyticus DHM-03.18 DHM-04.19 (µl) 9,35 ± 0,05 13,06 ± 0,13 25 12,71 ± 0,18 13,40 ± 0,07 50 13,52 ± 0,25 13,90 ± 0,10 75 23,54 ± 0,51 23,55 ± 0,19 100 Kết thử nghiệm cho thấy khả ức chế chủng vi khuẩn Vibrio gây AHPNS dịch chiết tương đối tốt, tác dụng chủng vi khuẩn V parahaemolyticus DHM-04.19 cao so với chủng V parahaemolyticus DHM-03.18 (Hình 4) Khả ức chế vi khuẩn tỷ lệ thuận với lượng tinh dầu bổ sung, chủng V parahaemolyticus DHM03.18, đường kính vịng vơ khuẩn thu thấp 9,35 mm ứng với lượng tinh dầu 25 µl đường kính vịng vơ khuẩn thu cao 23,54 mm ứng với nồng độ thảo dược 100 µl Tương tự chủng vi khun V parahaemolyticus DHM-04.19 Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 10/2020 KHOA HC CễNG NGHỆ đường kính vịng vơ khuẩn thu thấp 13,06 mm cao 23,55 mm Đặc biệt, sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Hình Khả kháng vi khuẩn gây AHPNS tinh dầu bạch đàn Kết nghiên cứu phù hợp với kết công bố số nhóm nghiên cứu trước khả kháng khuẩn dịch chiết từ thực vật Nghiên cứu khả kháng khuẩn dịch chiết thảo dược vi khuẩn Vibrio spp gây AHPNS, Đặng Thị Lụa công (2015) bước đầu cho thấy tiềm kháng vi khuẩn gây AHPNS dịch chiết trầu khơng ổi với đường kính vịng vô khuẩn tương ứng dao động từ 15 - 17,3 mm 14,6 – 20 mm So sánh với kết trên, khả kháng khuẩn tinh dầu bạch đàn cao so với dịch chiết trầu không dịch chiết ổi Kết nghiên cứu cho biết tinh dầu bạch đàn có tiềm phát triển thành chế phẩm thảo dược phòng trị AHPNS tôm Hơn nữa, bạch đàn loại phổ biến nước ta, việc thu hái phương pháp miêu tả đơn giản, dễ làm dễ áp dụng điều kiện thuận lợi để có nguồn vật liệu để sản xuất chế phẩm với số lượng lớn 3.3 Nghiên cứu điều kiện tạo nhũ tương tinh dầu bạch đàn trắng Trên thực tế, việc phịng điều trị bệnh cho tơm chủ yếu sử dụng kháng sinh Nguyên nhân chủ yếu hiệu phòng trị bệnh chế phẩm thảo dược chưa cao, lượng sử dụng nhiều, thời gian sử dụng kéo dài Trong thực tế, phần lớn hoạt chất kháng sinh, kháng nấm thực vật thu nhận phương pháp truyền thống, độ ổn định chưa cao, với hoạt chất khơng hịa tan nước dẫn đến khó áp dụng nuôi trồng thủy sản Các hoạt chất khơng tách chiết khó phát huy tác dụng khó kiểm sốt liều thực tế hoạt chất khơng xác định liều phịng bệnh hay trị bệnh hiệu Bên cạnh đó, loại chế phẩm dạng tinh dầu, mức độ phân tán thẩm thấu hạn chế dẫn tới hiệu xuất sử dụng làm giảm hiệu điều trị Việc bào chế chế phẩm nhũ tương dạng nano với kích thước 100-400 nm làm giảm sức căng bề mặt, xác định hàm lượng hoạt chất liều điều trị hiệu quả, giúp phân tán chế phẩm môi trường, tăng cường hấp thu, thẩm thấu chế phẩm thể vật chủ để điều trị hiệu Bảng Thành phần dịch nhũ tương tinh dầu bạch đàn Thành phần Khoảng biến thiên Nồng độ Span 80 Loại chất diện hoạt thân nước (Tween 80/Cremophor EL) Tinh dầu bạch đàn Loại dung môi dầu (Labrafac PG, Isopropyl mirista) Transcutol HP Loại dung dịch đệm (Borat, Phosphate, Citrate) pH 0,5 - 1,5 (%) 1% 3-5 (%) 3-5(%) 1-2(%) 0,1 - 0,2 M (vừa đủ 100%) 6,5 - 7,5 Trong nghiên cứu này, chế phẩm kháng sinh dạng nhũ tương nano từ bạch đàn dùng để phòng điều trị bệnh cho tôm nuôi bào chế thông qua hai bước: i) tách chiết tinh dầu phương pháp lôi nước ii) nhũ hóa phương pháp siêu âm để sản xuất chế phẩm dạng nhũ tương nano từ thực vật phòng điều trị bệnh AHPNS cho tơm ni Việc nhũ tương hóa tinh dầu bạch đàn tập trung hoạt chất với nồng độ cao, giữ nguyên vẹn hoạt tính sinh học, không gây ô nhiễm môi trường so với dạng thơ, giảm gây thất hoạt chất so với dạng cao đặc, giảm thiểu thất thoát hoạt chất so với dạng tinh dầu Các chế phẩm nhũ tương dạng nano với ưu điểm bật so với phương pháp truyền thống kích thước nm, bổ sung chất hoạt động bề mặt giúp tăng độ hòa tan nước có tính ổn định nhiệt động học cao, dễ dàng thẩm thấu vào tế bào giúp tăng độ hấp thụ động vật thủy sản, qua ú cú th Nông nghiệp phát triển nông thôn - KỲ - TH¸NG 10/2020 89 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ ứng dụng tốt điều trị bệnh cho tôm nuôi công nghiệp tăng độ nhớt nano nhũ tương nên làm chậm tốc độ khuếch tán dược chất khỏi hệ Trong nghiên cứu này, công thức nhũ hóa tinh dầu bạch đàn thực theo bảng với thành phần sau: tinh dầu, glycerin (5%) Tween 80 (hoặc Cremophor EL, Tween 80/Cremophor EL (1/1)), Span 80, Labrafac PG (hoặc isopropyl myristat), Transcutol HP, đệm borat (phosphat, citrat) (vừa đủ 100% kl/kl) 3.3.2 Xác định hình thái, kích thước hạt nano nhũ tương (TEM) 3.3.1 Ảnh hưởng thành phần loại thành phần tới giải phóng hạt nhũ tương Cấu trúc nano nhũ tương có tinh dầu bạch đàn qua chụp TEM cho thấy có phân bố giọt đồng kích thước hạt nằm khoảng từ 20 - 250 nm Điều cho thấy tinh dầu vừa chứa hoạt chất vừa chất diện hoạt yếu, giúp phân tách hạt nano nhũ tương nhờ lực đẩy ion hạt tách rời hẳn có kích thước đồng Về ảnh hưởng Tween 80 isopropyl myristat tới mức độ giải phóng dược chất từ nano nhũ tương, kết hình cho thấy loại dung môi pha dầu isopropyl myristat tăng lượng Tween 80 giảm làm tăng mức độ giải phóng Hình Ảnh chụp TEM nano nhũ tương chứa tinh dầu bạch đàn 3.4 Nghiên cứu tác dụng phịng bệnh hoại tử gan tụy tơm nhũ tương tinh dầu Hình Ảnh hưởng isopropyl myristat Tween 80 tới mức độ giải phóng dược chất từ nano nhũ tương (Span 80 = 1,0%, Transcutol HP = 1,5%, đệm phosphat 0,15 M, pH = 7,0) Tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung nhũ tương tinh dầu bạch đàn tinh dầu sau 30 ngày gây nhiễm với chủng vi khuẩn V parahaemolyticus DHM-03.18, theo dõi biểu lâm sàng tỷ lệ sống tôm sau 14 ngày gây nhiễm Hình Ảnh hưởng lượng tinh dầu Span 80 tới phần trăm giải phóng dược chất sau (isopropyl myristat = 4,0%, Transcutol HP = 1,5%, đệm citrat 0,15 M, pH = 7,0) Kết nghiên cứu hình lượng tinh dầu giảm lượng Span 80 giảm phần trăm dược chất giải phóng sau tăng Điều thấy với hoạt chất dạng nhũ tương có độ tan pha nước lớn tinh dầu Bên cạnh đó, tinh dầu, thân chất diện hoạt yếu giúp cho hình thành nano nhũ tương cách dễ dàng tăng tỉ lệ Tween 80, Span 80 làm 90 Hình Tỷ lệ sống sót tơm thí nghiệm sau 14 ngày thí nghiệm (%) Kết nghiên cứu trình bày hình cho thấy: bể đối chứng âm không xuất tôm chết, tỷ lệ sống đạt 100% kết thúc thí nghiệm, tơm hoạt động bình thường, gan tụy sẫm màu, ruột đầy thức ăn Ở bể đối chứng dương, tôm bắt đầu chết vào ngày thứ sau gây nhiễm v Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 10/2020 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ giảm mạnh ngày thứ 3-9, tỷ lệ sống bể đối chứng dương 15% sau ngày gây nhiễm Ở cơng thức thí nghiệm bổ sung tinh dầu với hàm lượng 1,5% bổ sung nhũ tương tinh dầu với hàm lượng 0,5-1% tơm ngừng chết sau ngày thí nghiệm, riêng cơng thức thí nghiệm bổ sung 0,5% tinh dầu tơm ngừng chết sau ngày thí nghiệm So sánh tác dụng điều trị bệnh vi khuẩn V parahaemolyticus gây tôm tinh dầu nhũ tương tinh dầu bạch đàn cho thấy, tỷ lệ sống tôm bể sử dụng nhũ tương tinh dầu bạch đàn đạt cao so với bể sử dụng tinh dầu hàm lượng, cụ thể: tất bể thí nghiệm với hàm lượng nhũ tương tinh dầu, tỷ lệ tơm sống đạt 95% sau ngày thí nghiệm trì đến ngày thứ 14 bể thí nghiệm với hàm lượng tinh dầu 0,5%, tỷ lệ tôm sống đạt 75% sau ngày thí nghiệm, cịn bể thí nghiệm với hàm lượng tinh dầu 1,5% tỷ lệ tơm sống đạt 85% sau ngày thí nghiệm Bên cạnh đó, quan sát dấu hiệu lâm sàng tơm sau gây nhiễm nhận thấy: sau 12 - 15 gây nhiễm cơng thức thí nghiệm bổ sung tinh dầu với hàm lượng 0,5; 1,5% tơm có dấu hiệu giảm hoạt động, đặc biệt bể đối chứng dương, sau 24 gây nhiễm, tôm có dấu hiệu bơi lờ đờ hoạt động, bỏ ăn, ruột rỗng, gan tụy nhạt màu teo (Hình 9), dấu hiệu bệnh lý tương tự với mơ tả Lightner et al (2013) A B Hình Tơm chân trắng thí nghiệm gây nhiễm với vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp A: Tơm bình thường có ruột đầy gan tụy màu sắc bình thường; B: Tơm nhiễm bệnh nhạt màu ruột rỗng, gan tụy teo Nghiên cứu Jayanthi et al (2013) cho rằng, chiết xuất ethanol đậu dầu (Pongamia pinnata) giúp tăng tỉ lệ sống tôm sú (Penaeus monodon) gây nhiễm với WSSV Tỷ lệ sống tôm bổ sung chiết xuất mức 200 300 µg/g khối lượng thân tương ứng 40% 80% Nghiên cứu Immanuel et al (2004) sử dụng chiết xuất thầu dầu làm thức ăn cho tôm Peneaus indicus (PL30) liên tục 30 ngày Kết ghi nhận tỷ lệ sống tôm cơng thức thí nghiệm bổ sung cao chiết thầu dầu (58,88%) cao cơng thức thí nghiệm đối chứng (24,44%); ra, loại thảo dược khác sử dụng thí nghiệm mang lại kết tương tự Balasubramanian et al (2008) nghiên cứu hoạt tính kháng virus (WSSV) tôm sú (P monodon) chiết xuất cỏ gà (Cynodon dactylon) Kết nghiên cứu cho thấy chiết xuất C dactylon có hiệu cao việc phịng bệnh WSSV; khơng có tơm chết cơng thức thí nghiệm bổ sung 2% chiết xuất so với tỷ lệ chết 40% cơng thức thí nghiệm bổ sung 1% chiết xuất Tôm chân trắng bổ sung cao chiết Gynura bicolor ngày gây nhiễm với V alginolyticus Kết cho thấy tỷ lệ sống tôm ăn thức ăn bổ sung G bicolor nồng độ 0,5; 1,0 g/kg thức ăn (36,7; 43,3 56,7%) cao đáng kể (p