KHOA HỌC CƠNG NGHỆ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA GINSENOSIDE CHIẾT XUẤT TỪ SÂM TAM THẤT Nguyễn Trần Xuân Phương1, Nguyễn Hữu Hiếu2, 3, Hoàng Minh Nam2, 3, Đỗ Chiếm Tài1 TÓM TẮT Sâm Tam thất bắc (Panax notoginseng (Burk.) F H Chen) biết đến vị thuốc quý, cho nhiều hàm lượng hoạt chất có lợi cho sức khỏe người, đặc biệt ginsenoside Sâm Tam thất bắc trồng nhiều tỉnh vùng núi phía Bắc Việt Nam nhờ khí hậu thổ nhưỡng thích hợp Trong nghiên cứu này, điều kiện chiết xuất ginsenoside Rg3 Rb1 từ sâm Tam thất bắc hỗ trợ chế phẩm Viscozyme L thiết kế dựa theo quy hoạch thực nghiệm bề mặt đáp ứng với mơ hình cấu trúc có tâm Bốn yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất khảo sát pH, tỉ lệ enzyme/nguyên liệu, nhiệt độ thời gian thủy phân Theo mơ hình trên, pH 5,2, tỉ lệ enzyme/nguyên liệu 5,0%, nhiệt độ 51oC thủy phân 74 phút thu cao chiết có hàm lượng Rg3 Rb1 cao (lần lượt 1,54±0,04 μg/mL 42,37±0,03 μg/mL) Cao chiết thử nghiệm hoạt tính chống ung thư hai dịng tế bào ung thư biểu mơ gan phương pháp gây độc tế bào Đồng thời, khả chống đái tháo đường cao chiết thử nghiệm thông qua khả ức chế enzyme α-glucosidase Kết thử nghiệm cho thấy cao chiết nghiên cứu thể hoạt tính chống ung thư đái tháo đường, loại dược liệu tiềm việc điều trị bệnh nguy hiểm Từ khóa: Tam thất, sắc ký lỏng hiệu cao, hoạt tính sinh học ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F H Chen hay Panax notoginseng) có tên gọi khác Điền thất hay Kim bất hoán, vị thuốc quý Loại thảo dược trồng nhiều Trung Quốc, nước Đông Á Đông Nam Á Tại Việt Nam, tùy theo vùng miền trồng sâm nên chúng chia làm hai loại sâm Tam thất bắc sâm Tam thất nam [1, 2] Sâm Tam thất bắc trồng nhiều tỉnh vùng núi phía Bắc Cao Bằng, Hà Giang, Lào Cai Nhờ khí hậu thổ nhưỡng phù hợp nên loại thảo dược phát triển tốt, cho nhiều hàm lượng hoạt chất có lợi cao so với Tam thất nam Do đó, nghiên cứu này, sâm Tam thất bắc sử dụng làm đối tượng nghiên cứu Thành phần hóa học chứa sâm Tam thất nói chung phức tạp, chứa ginsenoside (tên gọi khác saponin nhân sâm), flavonoid, polyacetylen, polysaccharide, axit amin, axit béo, tinh dầu peptit; đó, ginsenoside loại dammaran (Rb1, Rg3, Rg1 Rd) chiếm 12% tổng khối lượng khô Những chất Trường Đại học Quốc tế Hồng Bàng Phòng Thí nghiệm Trọng điểm, ĐHQG TP HCM Cơng nghệ Hóa học Dầu khí (CEPP) Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG TP Hồ Chí Minh 50 hợp chất tự nhiên có chứa hoạt tính sinh học cao, nhiều cơng dụng dược lý có lợi cho sức khỏe người [1] Ginsenoside Rg3 ức chế hoạt động yếu tố phiên mã NF-κB (Nuclear Factor-kappa B) cách đáng kể, dẫn đến ức chế phát triển khối u nên phê duyệt lâm sàng điều trị ung thư [3, 4] Ginsenoside Rb1 loại nhân sâm khác (hồng sâm, sâm Cao Ly…) có khả hỗ trợ điều trị đái tháo đường Rb1 thúc đẩy q trình chuyển dịch vị trí GLUT1 (glucose transporter 1), GLUT4 (glucose transporter 4) lên thành tế bào, tạo điều kiện cho phân tử glucose dễ dàng vào nội bào thơng qua q trình photphoryl hóa thụ thể insulin-1 (IRS-1), PI3K (photphatidylinositol kinase) Akt (Protein kinase B) [5, 6] Hiện nay, nghiên cứu nước tập trung đến chế tác động ginsenoside riêng rẽ chiết xuất từ nhân sâm (Panax ginseng), chưa sâu vào hoạt tính cao tổng Bên cạnh đó, cao sản xuất phương pháp ngâm chiết dung môi sử dụng nhiều chưa mang lại hiệu cao, hàm lượng hoạt chất quý cao tương đối thấp Do đó, việc nghiên cứu sử dụng chế phẩm Viscozyme L h tr Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 10/2020 KHOA HC CễNG NGHỆ chiết xuất hoạt chất Rg3 Rb1 từ sâm Tam thất bắc cần thiết NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu hóa chất Nguyên liệu dùng để nghiên cứu sâm Tam thất bắc trồng, thu hoạch, sấy khô xay nhuyễn Lào Cai Chất chuẩn Rg3 Rb1 (độ tinh khiết > 98%) sử dụng sản xuất Công ty Trách nhiệm hữu hạn Biopurify Phytochemicals, Tứ Xuyên, Trung Quốc Các hóa chất sử dụng nghiên cứu (ethanol - EtOH, methanol - MeOH, acetonitrile ACN, dung dịch đệm, dimethyl sulfoxit - DMSO, Viscozyme L) hóa chất tinh khiết SigmaAldrich, USA sản xuất Sử dụng nước cất hai lần trình nghiên cứu 2.2 Quy trình chiết xuất Chuẩn bị 30 mL dung dịch có chứa chế phẩm Viscozyme L (0-8% (tt/kl)) điều chỉnh pH (2,5-6,5) dung dịch đệm phù hợp Cân khoảng 3,0g (chính xác đến 0,001 g) sâm Tam thất bắc cho vào dung dịch Gia nhiệt (25-65oC) khuấy thời gian (0-120 phút) Bất hoạt enzyme 85oC phút Thêm 70 mL etanol 95% vào tiếp tục khuấy hỗn hợp Lọc lấy dung dịch cô cạn áp suất thấp thu cao chiết 2.3 Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất Việc tối ưu hóa điều kiện chiết xuất thiết kế dựa theo quy hoạch thực nghiệm bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) với mơ hình cấu trúc có tâm (Central Composite Design - CCD) Bốn yếu tố tối ưu pH (A), tỉ lệ enzyme/nguyên liệu (B), nhiệt độ (C), thời gian thủy phân (D) theo năm cấp độ, -α, -1, 0, +1 +α Thiết kế điều kiện thí nghiệm thể bảng Bảng Điều kiện thí nghiệm STT STT 4,5 45 60 15 3,5 35 90 10 11 12 13 3,5 5,5 4,5 3,5 4,5 4,5 5,5 2,5 5,5 5,5 5,5 4,5 6 4 4 6 35 55 25 55 45 45 55 45 35 35 55 45 30 30 60 30 60 60 30 60 30 90 90 120 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 3,5 6,5 5,5 3,5 4,5 4,5 4,5 4,5 3,5 3,5 5,5 5,5 4 2 35 45 35 55 45 45 45 65 55 35 55 35 30 60 30 90 60 60 60 90 90 90 90 14 3,5 55 30 Ghi chú: Số liệu xử lý, phân tích thống kê phần mềm Design Expert 11.0 2.4 Định lượng Rg3 Rb1 cao chiết Ginsenoside Rg3 Rb1 cao chiết từ mục 2.2 2.3 xác định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao – HPLC (Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 250 x 4,6 cm x µm) bước sóng 202 nm, pha động MeOH ACN 2.5 Thử nghiệm hoạt tính sinh học cao chiết Chuẩn bị mẫu thử: cao chiết có hàm lượng ginsenoside Rg3 Rb1 cao theo mơ hình RSM- CCD thu hòa tan dimethyl sulfoxit 5% (DMSO 5%) nước cất vô trùng với nồng độ khác (0-256 µg/mL) để đánh giá hai hoạt tính chống ung thư đái tháo đường thơng qua phương pháp gây độc tế bào ức chế enzyme -glucosidase 2.5.1 Chống ung thư 10 µL mẫu thử 190 µL dung dịch tế bào (khoảng 3-5.104 tế bào/mL) cho vào đĩa 96 giếng, ủ điều kiện tiêu chuẩn 72 Thêm tiếp vào giếng vi 10 àL Nông nghiệp phát triển nông thôn - KỲ - TH¸NG 10/2020 51 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, diphenyl tetrazolium bromide có nồng độ mg/mL ủ Sau loại bỏ mơi trường, tinh thể formaran hịa tan 100 µL DMSO Kết thí nghiệm xác định giá trị mật độ quang đo bước sóng 540 nm máy BIOTEK 2.5.2 Chống đái tháo đường Hút 40 µL đệm photphat 100 mM pH 6,8 25 µL -glucosidase 0,2 U/mL vào đĩa 96 giếng Thêm 10 µL mẫu thử, 25µl p-nitrophenyl -Dglucopyranoside 2,5 mM Lắc đều, ủ 37oC 30 phút Dừng phản ứng 100 µL Na2CO3 100 mM Tiến hành đo mật độ quang dung dịch máy BIOTEK bước sóng 401 nm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng đơn yếu tố Ảnh hưởng pH, tỉ lệ enzyme/nguyên liệu (tt/kl), nhiệt độ thời gian thủy phân đến hàm lượng ginsenoside Rg3 Rb1 cao chiết thể hình (a) (b) (c) (d) Hình Ảnh hưởng (a) pH, (b) tỉ lệ enzyme/nguyên liệu, (c) nhiệt độ, (d) thời gian thủy phân đến hàm lượng ginsenoside cao chiết Biểu đồ hình 1a cho thấy, thay đổi pH từ 2,54,5 hàm lượng Rg3 tăng từ 1,08-1,53 μg/mL Rb1 tăng từ 33,53-44,60 μg/mL Khi pH cao 4,5 hàm lượng hai ginsenoside bắt đầu giảm Chế phẩm Viscozyme L hoạt động môi trường axit yếu, nằm ngồi khoảng pH enzyme hoạt động kém, cắt đứt lớp thành tế bào nên hoạt chất không phân tán tốt vào dung môi Vì vậy, pH 4,5 phù hợp để thực khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ enzyme/nguyên liệu khoảng biến thiên 3,5-5,5 thực khảo sát ảnh hưởng đồng thời yếu tố 52 Từ biểu đồ hình 1b cho thấy tăng lượng enzyme theo tỉ lệ 0-8% hiệu chiết xuất ginsenoside tăng Ở tỷ lệ enzyme/nguyên liệu 4% thu hàm lượng hai ginsenoside cao (1,53 μg/mL Rg3 44,60 μg/mL Rb1) Tăng từ 30-40% so với mẫu đối chứng không bổ sung enzyme hai ginsenoside Điều cho thấy Viscozyme L có tác dụng hỗ trợ chiết xuất ginsenoside từ sâm Tam thất Tuy nhiên, sử dụng lượng enzyme vượt ngưỡng xúc tác tối ưu cho trình thủy phân hiệu chiết xuất hoạt chất khơng tăng thêm gây lãng phí Vì vậy, chọn tỉ lệ enzyme/ngun liệu 4% để N«ng nghiƯp phát triển nông thôn - K - THáNG 10/2020 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ thực khảo sát yếu tố khoảng biến thiên 2-6% để khảo sát đồng thời yếu tố Khi thay đổi nhiệt độ 25-65oC hàm lượng Rg3 dao động từ 1,03-1,53 μg/mL, Rb1 dao động từ 30,7544,60 μg/mL thể biểu đồ hình 1c Khi thủy phân 45oC hàm lượng hai ginsenoside đạt cao (Rg3 Rb1 1,53 44,60 μg/mL) Thủy phân nhiệt độ cao 45oC hàm lượng Rg3 Rb1 giảm (có tăng lượng không đáng kể 65oC (42,13 μg/mL) so với 55oC (42,06 μg/mL) Rb1) Vì chuyển động nhiệt phân tử hỗn hợp phản ứng cấu trúc không gian protein enzyme nên enzyme hoạt động khoảng nhiệt độ phù hợp Ở nhiệt độ thấp, enzyme linh động, khả tiếp xúc để tạo phức hợp xúc tác Ở nhiệt độ cao, cấu hình khơng gian enzyme bị ảnh hưởng nên làm giảm khả xúc tác, từ hàm lượng ginsenoside thu thay đổi [7] Vì vậy, chọn 45oC để thực khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy phân khoảng biến thiên 35-55oC để thực khảo sát ảnh hưởng đồng thời yếu tố Biểu đồ hình 1d thể thời gian thủy phân ảnh hưởng đến hàm lượng ginsenoide Khi thời gian tăng từ 30-60 phút, hàm lượng hai ginsenoside tăng mạnh (tăng 30%) Tuy nhiên, tiếp tục kéo dài thời gian thủy phân hàm lượng hai ginsenoside giảm Ban đầu, enzyme thêm vào để phá vỡ liên kết cấu tạo nên thành tế bào, làm hoạt chất phân tán vào dung môi dễ dàng hơn; sau, lượng hoạt chất phân tán hoàn tồn vào dung mơi, khơng làm enzyme bất hoạt, enzyme công, phá vỡ liên kết hóa học hoạt chất nên hàm lượng hai ginsenoside giảm dần thời gian thủy phân kéo dài Vì vậy, khoảng thời gian thủy phân từ 30-90 phút chọn để khảo sát ảnh hưởng đồng thời yếu tố 3.2 Điều kiện chiết xuất tối ưu Hàm lượng Rg3 ( ) Rb1 ( ) thực tế dự đoán (Rg3 ( ) Rb1 ( )) cao chiết theo điều kiện thí nghiệm thể bảng Bảng Hàm lượng ginsenoside thực tế dự đoán STT STT 10 11 12 13 14 1,22 1,27 1,36 1,54 1,37 1,75 1,69 1,60 1,43 1,25 1,44 1,50 1,43 1,12 1,17 1,27 1,41 1,51 1,42 1,72 1,72 1,55 1,41 1,31 1,45 1,49 1,45 1,12 42,32 41,23 43,88 42,29 44,32 45,68 44,95 42,85 41,09 42,90 42,22 43,87 44,89 43,90 42,88 40,89 44,07 42,66 44,29 45,27 45,27 42,70 41,01 42,25 42,25 43,48 44,58 43,71 Các số liệu bảng xử lí thơng qua phần mềm Design Expert 11.0, mơ hình tốn học mơ tả mối quan hệ hàm lượng ginsenoside với 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 1,37 1,42 1,55 1,33 1,23 1,46 1,25 1,71 1,56 1,60 1,63 1,62 1,45 1,43 1,44 1,54 1,33 1,25 1,49 1,20 1,72 1,56 1,55 1,60 1,64 1,42 42,89 41,76 40,53 41,44 43,09 41,97 43,84 45,19 44,50 42,18 43,04 40,64 44,11 42,87 41,99 40,74 41,40 43,17 41,53 44,27 45,27 44,25 42,66 42,89 41,09 44,19 biến độc lập thể phương trình hồi quy (1) (2): (1) Đối với Rg3, theo phương trình (1) vùng khảo sát, phương trình hồi quy cho thấy Rg3 chịu ảnh hưởng bậc ba nhân tố A, C D, bậc (2) bốn nhân tố nghiên cứu chịu ảnh hưởng đồng thời ba cặp nhân tố pH – tỉ lệ enzyme/nguyên liệu (AB), pH t l Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 10/2020 53 KHOA HC CÔNG NGHỆ enzyme/nguyên liệu (AC) tỉ lệ enzyme/nguyên – nhiệt độ (BC) lớn 0,05 cho thấy có độ tương thích cao mơ hình với thực nghiệm Đối với Rb1, theo phương trình (2) vùng khảo sát, phương trình hồi quy cho thấy Rb1 chịu ảnh hưởng bậc hai nhân tố B C, bậc ba nhân tố A, B C chịu ảnh hưởng đồng thời ba cặp nhân tố pH - nhiệt độ (AC), tỉ lệ enzyme/nguyên liệu – thời gian thủy phân (BD) nhiệt độ – thời gian thủy phân (CD) Bảng Kết phân tích phương sai cho mơ hình đa thức bậc hai Mơ hình Lack of fit Mơ hình Giá trị Giá trị Giá trị Giá trị đa thức F p F p Rg3 21,16