Đang tải... (xem toàn văn)
44 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHẤT TƯƠNG ĐỒNG CURCUMIN CHỨA DỊ VÒNG 1H PYRAZOLE Đoàn Quốc Hoài[.]
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHẤT TƯƠNG ĐỒNG CURCUMIN CHỨA DỊ VỊNG 1H-PYRAZOLE Đồn Quốc Hồi Nam*, Dương Bằng Vũ, Trần Thị Khánh Ngân, Ngô Lan Phương, Ngơ Hồng Việt, Phan Cảnh Trình, Đỗ Thị Hồng Tươi, Trương Ngọc Tuyền Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: namdoanqhh1996@gmail.com TĨM TẮT Nghiên cứu tổng hợp chất tương đồng curcumin kiểu monocarbonyl (Monocarbonyl Analogues of Curcumin-MACs) khắc phục hạn chế mà cịn thể hoạt tính sinh học tốt so với curcumin Mặt khác, dị vòng 1H-pyrazole thành phần diện cấu trúc nhiều dược chất Theo đó, nghiên cứu thực với mục tiêu tổng hợp MACs chứa dị vòng 1H-pyrazole; đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật hoạt tính độc tế bào in vitro MACs tổng hợp Theo đó, tổng hợp 25 MACs Một số MACs có khả kháng MSSA/MRSA hay độc tế bào tốt curcumin, cho thấy tiềm MACs Từ khóa: Curcumin, 1H-pyrazole, MACs, kháng ung thư, kháng vi sinh vật, Vilsmeier-Haack SYNTHESIS AND BIOACTIVITY EVALUATION OF CURCUMIN ANALOGUES CONTAINING 1H-PYRAZOLE Doan Quoc Hoai Nam*, Duong Bang Vu, Tran Thi Khanh Ngan, Ngo Lan Phuong, Ngo Hoang Viet Phan Canh Trinh, Do Thi Hong Tuoi, Truong Ngoc Tuyen University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh City * Corresponding author: namdoanqhh1996@gmail.com ABSTRACT Researching and synthesizing Monocarbonyl Analogues of Curcumin (MACs), which not only overcome limitations but also exhibit better biological activity than curcumin 1H-pyrazole heterocyclic is a component present in the structure of many active pharmaceutical ingredients Accordingly, the study was conducted to synthesize MACs containing 1H-pyrazolee, to evaluate the anti-bacterial and cytotoxic activity in vitro of synthesized MACs Thus, 25 MACs were synthesized Some MACs demonstrated better anti-microbial activity on MSSA/MRSA or cytotoxic activity than curcumin, thus proving the potential of these MACs Keywords: Curcumin, MACs, 1H-pyrazole, Vilsmeier-Haack, anti-microbial, anti-cancer curcumin kiểu monocarbonyl (Mono Carbonyl Analogues-MACs) (Al-Hujaily et al., 2011) Mặt khác, dị vòng 1H-pyrazole diện cấu trúc nhiều dược chất, số thể hoạt tính kháng khuẩn (Bekhit et al.) hay kháng ung thư (Abadi et al., 2003) Nghiên cứu đề với mục tiêu tổng hợp MACs chứa dị vòng 1H-pyrazole đối xứng khơng đối xứng; đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật độc tế bào MACs tổng hợp, với hy vọng phát hoạt chất có hoạt tính vượt trội ĐẶT VẤN ĐỀ Curcumin (diferuloylmethane) hợp chất polyphenol tự nhiên, có chủ yếu củ nghệ (Curcuma longa Linn.); với ba vùng cấu trúc chức gồm khung vịng thơm kiểu catechol, khung 1,3-diketone khung liên kết olefin đóng góp nhiều vai trị khác vào hoạt tính sinh học curcumin (Gupta et al.) Tính đa dạng cao cấu trúc khiến curcumin thể nhiều hoạt tính sinh học đáng ý, phải kể đến hoạt tính kháng nấm (Martins et al., 2008) hay kháng ung thư (Kuttan et al.) Tuy nhiên, curcumin tồn hạn chế để phát triển thành thuốc tính khơng ổn định hóa học, tính tan nước, sinh khả dụng thấp bị chuyển hóa nhanh (Anand et al., 2007) Điều dẫn đến hình thành nhóm chất tương đồng ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 44 PHÁP Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học (cloro, carboxyl); (B) vịng phenyl gắn nhóm đẩy electron chứa oxy, hình thành liên kết hydro (hydroxy, methoxy, ethoxy); (C) dây nối đơn vị (hetero)ary với cấu trúc kỵ nước kiểu penta-1,4-dien-3-on (Hình 1) Dựa nghiên cứu liên quan cấu trúc-tác dụng trước (Kumar et al.; Xu et al.), cấu trúc MACs thiết kế với (A) dị vịng 1Hpyrazole gắn nhóm cồng kềnh (phenyl, 3nitrophenyl) nhóm hút electron Hình Định hướng cấu trúc MACs nghiên cứu mẫu thử paclitaxel (chứng dương) Hóa chất, dung mơi thiết bị Hóa chất, dung mơi từ Merck, Sigma-Aldrich, nồng độ xác định, DMSO (chứng âm) Sau Fischer Scientific AK Scientific Sắc ký lớp 72 giờ, loại bỏ môi trường nuôi cấy ủ với mỏng sử dụng nhôm silica gel 60 F254, độ môi trường không huyết chứa MTT dày 0,2 mm từ Merck Điểm chảy đo 37oC Hòa tan tinh thể formazan máy Sanyo-Gallenkamp; phổ hồng isopropanol, đo độ hấp thu 570 nm ngoại đo máy IRAffinity-1S máy đọc microplate Multiskan TM Tính Shimadzu Phổ khối đo máy sắc ký tỷ lệ ức chế tăng trưởng, từ xác định giá trị lỏng-khối phổ LC-MS Shimadzu, Viện Kiểm IC50 (Van Meerloo et al., 2011) nghiệm TP HCM Phổ 1H-NMR 13C-NMR đo máy cộng hưởng từ hạt nhân KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Bruker Avance II 500-125 MHz, Viện Hàn Tổng hợp lâm Khoa học-Công nghệ, TP Hà Nội Tổng hợp chất trung gian A (A.1-A.4): Hiệu suất giai đoạn giai đoạn Vi sinh vật dòng tế bào S aureus nhạy cảm methicillin (MSSA, ATCC 81-92% 55-95% Hiệu suất tổng cộng 4525923); S aureus đề kháng với methicillin 87% (MRSA, ATCC 33591); E coli (ATCC Tổng hợp chất trung gian B (B.1-B.6): Hiệu 25922); P aeruginosa (ATCC 27853); C suất 57-87% albicans (ATCC 10231); dòng tế bào ung thư Tổng hợp 21 MACs không đối xứng vú người (MDA-MB-231) ung thư biểu mô (CUR.1.1-CUR.4.6): Hiệu suất 35-54% gan người (Hep-G2) từ American Type Tổng hợp MACs đối xứng (CURSYM.1Culture Collection (ATCC, Mỹ); hoạt CURSYM.4): Hiệu suất 60-69% hóa, ni cấy lưu Bộ môn Vi-Ký sinh, Phản ứng tổng hợp chất trung gian A (A.1ĐH Y Dược TP.HCM Viện Pasteur A.4) xảy hoàn toàn Cấu trúc TG.1 TG.2 cho thấy tồn đồng phân hỗ biến với TP.HCM Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật tín hiệu khoảng 3300 cm-1 (OH) 3100 cm1 Xác định MIC phương pháp pha loãng (=CH) phổ IR; phổ 1H-NMR (DMSOtrong môi trường lỏng phiến 96 giếng với d6) với tín hiệu 12,0-11,0 ppm (singlet, OH) thị resazurin 0,015% Mật độ vi sinh vật tín hiệu khoảng 5,4 ppm (singlet, =CH) khoảng 1-2 x 105 CFU/mL (vi khuẩn) 1- Phổ IR TG.3 TG.4 cho thấy giảm x 103 CFU/mL (vi nấm) nồng độ mẫu thử cường độ tín hiệu NH (3300-3200 cm-1) dãy giếng 1024-2 g/mL Đọc kết tín hiệu CO sau ủ 37 oC 24 (Choi, nguyên liệu tương ứng Đối với A.1 A.2, có Jiang, 2014) chuyển dịch tín hiệu từ vùng 1668-1624 Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào cm-1 (CON(Ph)) sang vùng 1674-1668 cmo Tế bào nuôi cấy ủ 37 C, 5% CO2 đến (CHO) xuất thêm tín hiệu vùng độ phủ 70 80% Thu đếm tế bào sống với 761-736 cm-1 (CCl) phổ 1H-NMR trypan blue (Sigma-Aldrich, Mỹ), chia vào đĩa (DMSO-d6) tín hiệu hỗ biến, ni cấy 96 giếng với mật độ thích hợp Ủ 24 thay tín hiệu khoảng 9,9 ppm 37 oC, 5% CO2 xử lý tế bào với (CHO); phổ 13C-NMR có thay tín hiệu 45 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học khơng có vai trị đáng kể Bên cạnh đó, MACs với nhóm methoxy vị trí số thể hoạt tính khác biệt rõ rệt so với vị trí số hay 4, cho thấy thay vị trí vịng phenyl quan trọng đến hoạt tính (Hình 2a) Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào Trên dịng tế bào ung thư vú người MDA-MB231: Có 15 MACs cho hoạt tính độc tế bào (IC50 3,29-19,90 M) mạnh curcumin (IC50 20,65 M); MACs (IC50 3,29-7,71 M) cho hoạt tính độc tế bào mạnh MACs (IC50 12,26-13,49 M) cho hoạt tính độc tế bào tương đương với paclitaxel chứng dương (IC50 8,79 M) Trên dịng tế bào ung thư gan người Hep-G2: Có MACs cho hoạt tính độc tế bào (IC50 6,74-18,32 M) mạnh curcumin (IC50 23,45 M); MACs (IC50 6,74-11,55 M) cho hoạt tính độc tế bào mạnh MACs (IC50 13,18-14,20 M) cho hoạt tính độc tế bào tương đương với paclitaxel chứng dương (IC50 12,00 M) MACs thử nghiệm cho thấy hoạt tính độc tế bào ưu dịng MDA-MB-231 Trong đó, CUR.1.1, CUR.1.3, CUR.1.4, CUR.1.5, CUR.2.1, CUR.2.2, CUR.4.3, CUR.4.4 CUR.4.5 cho hoạt tính độc tế bào tốt dịng tế bào (Phụ lục 3) MACs khơng đối xứng nói chung cho hoạt tính độc tế bào mạnh MACs đối xứng Đối với dị vòng 1H-pyrazole, cấu trúc 5-cloro3-methyl-1-phenyl/(3-nitrophenyl)-1Hpyrazole-4-yl cho thấy hoạt tính tốt so với 3-carboxy-1-phenyl-1H-pyrazole-4-yl-chỉ tương đối tốt dòng MDA-MB-231 Cấu trúc 1,3-diphenyl-1H-pyrazole-4-yl cho thấy hoạt tính tốt MACs chứa OH phenol, gợi ý vị trí số 1, nên thay nhóm thân dầu, cần có cân hợp lý cấu trúc với thành phần thân nước; khẳng định vai trò vòng phenyl thuộc dây nối kiểu penta-1,4-dien-3-on Đối với vòng phenyl thuộc dây nối kiểu penta-1,4dien-3-on, ảnh hưởng nhóm OCH3 tốt OCH2CH3, với vị trí 3, tốt vị trí 2, Hoạt tính tăng mạnh chứa OH phenol vị trí số vị trí số Đối với dây nối kiểu penta-1,4-dien-3-on, nhìn chung 4-methylcyclohexanon cho kết tốt số MACs đối xứng hai dòng tế bào, bên cạnh cyclohexanon với hoạt tính tốt dịng MDA-MB-231 khoảng 171 ppm (CON(Ph)) tín hiệu khoảng 184 ppm (CHO) Cấu trúc A.3’ A.4 đặc trưng tín hiệu khoảng 3100 1670 cm-1 phổ IR, khoảng 10,0 9,3 ppm phổ 1H-NMR (DMSO-d6) tương ứng –CHO =CH vịng 1H-pyrazole; có gia tăng hai tín hiệu carbon so với TG.3 TG.4 tương ứng phổ 13C-NMR, với tín hiệu khoảng 184 ppm (CHO) Phản ứng tổng hợp chất trung gian B (B.1B.6) xảy hoàn toàn Sản phẩm đặc trưng cặp tín hiệu proton alken cấu hình E (CH=CH, J = 16 Hz), tín hiệu khoảng 2,3 ppm 27 ppm phổ 1H 13C-NMR (MeOD-d4) (CO)CH3 Phản ứng tổng hợp MACs đối xứng không đối xứng xảy nhanh hoàn toàn Phổ 1H 13C-NMR (DMSO-d6) CUR.1.1-CUR.4.6 có tín hiệu CHO (CO)CH3 đặc trưng chất trung gian A B tương ứng, xuất thêm cặp tín hiệu proton alken cấu hình E (CH=CH, J = 16 Hz) Phổ 1H 13C-NMR (DMSO-d6) CURSYM.1-CURSYM.4 có tín hiệu nhóm CHO A.1 (9,9 184 ppm) thay tín hiệu =CH alken (khoảng 7,5-7,4 130-126 ppm) Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật Trên S aureus (MSSA MRSA): Có 10 MACs cho thấy nhạy cảm MSSA, có MACs với MIC 32 g/mL MACs cho thấy nhạy cảm MRSA với MIC 512 g/mL Trên E coli, P aeruginosa, C albicans: Khơng có MACs cho thấy nhạy cảm nồng độ cao chủng vi sinh vật MACs khơng đối xứng nói chung cho hoạt tính kháng MSSA/MRSA mạnh MACs đối xứng Đối với dị vịng 1H-pyrazole, nhóm COOH C6H5 vị trí cho thấy vai trị quan trọng, với ảnh hưởng nhóm COOH lớn hơn, MSSA MRSA MACs với nhóm 3-nitrophenyl vị trí số xác nhận đóng góp nhóm NO2 nhóm Cl vị trí số khơng cho thấy vai trị rõ ràng hoạt tính Đối với vịng phenyl thuộc dây nối kiểu penta-1,4-dien-3-on, nhóm OH phenol vị trí số đóng góp hoạt tính MSSA OH phenol vị trí số lại 46 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học Hình Tóm tắt liên quan cấu trúc-tác dụng (a) kháng MSSA/MRSA (b) độc tế bào tác dụng ghi nhận Bên cạnh đó, nghiên cứu tiếp tục thử nghiệm độc tế bào dòng tế bào sarcoma vân RD dòng tế bào biểu mơ ống thận bình thường LLC-PK1, nhằm đánh giá tính chọn lọc MACs có hoạt tính Bên cạnh đó, tiếp tục mở rộng cấu trúc MACs khơng đối xứng chứa dị vịng 1H-pyrazole; làm rõ chế độc tế bào MACs chứa dị vòng 1H-pyrazole tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư khác Từ việc mở rộng cấu trúc MACs mở rộng liệu thử nghiệm hoạt tính, tiến hành sàng lọc ảo tối ưu hóa để thu cấu trúc MACs chứa dị vịng 1Hpyrazole cho hoạt tính sinh học tốt KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Nghiên cứu tổng hợp xác định cấu trúc thành công 25 MACs với 21 MACs chất tổng hợp mới, chưa công bố nghiên cứu khoa học khác (Theo SciFinder, 10/11/2019) Trong số 25 MACs này, MACs khơng đối xứng nói chung cho hoạt tính sinh học tốt MACs đối xứng Một số MACs cho thấy hoạt tính kháng MSSA/MRSA CUR.2.2 CUR.3.2 tốt MSSA hay CUR.3.2 CUR.3.6 nhạy cảm MRSA; số MACs khác thể hoạt tính độc tế bào mạnh dòng tế bào thử nghiệm CUR.1.1, CUR.1.3, CUR.1.4, CUR.1.5, CUR.2.1, CUR2.2, CUR.4.3, CUR.4.4 CUR.4.5 Các nhận xét liên quan cấu trúc- TÀI LIỆU THAM KHẢO ANAND, P., ET AL 2007 "Bioavailability of curcumin: problems and promises" Mol Pharm (6): pp 807-818 BEKHIT, A A., ET AL 2008 "Synthesis and biological evaluation of some thiazolyl and thiadiazolyl derivatives of 1H-pyrazolee as anti-inflammatory antimicrobial agents" Eur J Med Chem 43 (3): pp 456-463 KUMAR, D., ET AL 2013 "Synthesis, molecular docking and in vitro antimicrobial studies of new hexahydroindazole derivatives of curcumin" Lett Drug Des Discov 10 (2): pp 119-128 47 ... LLC-PK1, nhằm đánh giá tính chọn lọc MACs có hoạt tính Bên cạnh đó, tiếp tục mở rộng cấu trúc MACs không đối xứng chứa dị vòng 1H- pyrazole; làm rõ chế độc tế bào MACs chứa dị vòng 1H- pyrazole tiến... cho hoạt tính độc tế bào mạnh MACs đối xứng Đối với dị vịng 1H- pyrazole, cấu trúc 5-cloro3-methyl-1-phenyl/(3-nitrophenyl)-1Hpyrazole-4-yl cho thấy hoạt tính tốt so với 3-carboxy-1-phenyl -1H- pyrazole- 4-yl-chỉ... nghiệm hoạt tính kháng ung thư khác Từ việc mở rộng cấu trúc MACs mở rộng liệu thử nghiệm hoạt tính, tiến hành sàng lọc ảo tối ưu hóa để thu cấu trúc MACs chứa dị vịng 1Hpyrazole cho hoạt tính sinh