KHOA HỌC CÔNG NGHỆ N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n KỲ 1 TH¸NG 12/2020 17 ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỒNG NHẤT CỦA MẪU GIỐNG BẠCH CHỈ (Argelica dahurica) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR Nguyễn Văn Khiêm1*, Trần Ngọc[.]
KHOA HỌC CƠNG NGHỆ ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỒNG NHẤT CỦA MẪU GIỐNG BẠCH CHỈ (Argelica dahurica) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR Nguyễn Văn Khiêm1*, Trần Ngọc Thanh1, Nguyễn Minh Tuyên1, Đinh Thanh Giảng1, Dương Thị Ngọc Anh1, Dương Thị Phúc Hậu1, Trần Danh Việt1, Trần Thị Kim Dung1 TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, tính đồng mẫu giống bạch (Argelica dahurica) chọn lọc hệ F4 đánh giá thị phân tử ISSR Tổng cộng mồi ISSR sử dụng phản ứng PCR để khuếch đại DNA 20 bạch hệ F4 Tổng cộng 44 băng DNA tạo ra, có kích thước từ 0,1 kb -2,0 kb, trung bình tạo 4,89 băng/mồi Số băng đồng hình thu 1,67 băng/mồi, chiếm 34,09%, số băng đa hình thu 3,22 băng/mồi, chiếm 65,91% Hệ số tương đồng di truyền 20 dao động từ 0,52-1,00 Chỉ số PIC thu 0,339 Kết phân tích cho thấy BC6 khác dạng so với 19 lại 19 tổng số 20 giống có hệ số di truyền từ 0,80-1,0, chứng tỏ mẫu giống bạch chọn lọc hệ F4 đồng cao di truyền, sử dụng để sản xuất hạt giống Từ khóa: Bạch chỉ, tính đồng di truyền, hệ số di truyền, Angelica dahurica, ISSR MỞ ĐẦU Bạch (Angelica dahurica Benth et Hook) lồi thuốc q, có nguồn gốc từ Trung Quốc, nhập nội trồng nước ta Dược liệu bạch sử dụng thuốc y học cổ truyền điều trị giảm đau, kháng viêm, giải độc, tác dụng đến trung khu thần kinh, hô hấp tim mạch làm tăng huyết áp, mạch chậm (Đỗ Huy Bích cộng sự, 2004) Giống tốt nhân tố quan trọng để tạo suất chất lượng dược liệu cao ổn định Năm 2013, Viện Dược liệu nhập nội mẫu giống BC9, tiến hành chọn lọc giống theo sơ đồ chọn giống giao phấn chéo Vũ Đình Hịa cộng (2005) Hạt giống thệ F3 sử dụng để tiến hành khảo nghiệm VCU DUS năm 2018-2019 Kết đánh giá đồng di truyền giống bạch dựa vào đặc điểm hình thái theo quy phạm khảo nghiệm DUS cho thấy tỷ lệ khác dạng hệ F4 1/30 cây, chứng tỏ mẫu giống đồng hình thái Tuy nhiên, đặc điểm hình thái thay đổi theo mơi trường sinh thái khó phát tính trạng chưa biểu rõ ràng Vì vậy, đánh giá đồng giống bạch sau chọn lọc qua kiểu gen cần thiết Hiện thị phân tử DNA áp dụng để đánh giá đa dạng di truyền, tính đồng tính ổn định nhiều giống trồng Bùi Văn Thế Vinh (2015) sử dụng thị RAPD để đánh giá ổn định di truyền giống cấy mô sâm Ngọc linh (Panax vietnamesis Ha et Grushv.) Mei et al (2015) đánh gia đa dạng di truyền giống Đương quy (Angelica sinensis) số loài khác chi Angelica thu thập từ vùng khác Trung Quốc thị ISSR RAPD Yousefiazarkhanian et al (2016) đánh giá đa dạng di truyền loài chi Salvia thị ISSR RAPD Huan et al (2009) xác định ổn định di truyền Platanus acerifolia nuôi cấy mơ trì năm thị ISSR Hệ số di truyền 20 sau năm trì điều kiện in vitro 91% Guo et al (2009) đánh giá đa dạng di truyền 20 nguồn gen giống bạch chỉ thị ISSR Tổng cộng 97 băng ISSR tạo từ khuếch đại mồi, có 37 băng đa hình 20 quần thể nguồn gen chia làm nhóm lớn Hệ số đồng dạng di truyền từ 0,752 đến 0,835 Kết nghiên cứu cho cho thấy sử dụng thị phân tử DNA để đánh giá tính đồng quần thể giống trồng, góp phần định hướng chọn giống nhanh xác Trong báo này, thơng báo kết đánh giá tính đồng di truyền mẫu giống bạch BC9 hệ F4 thị phân tử ISSR Viện Dược liệu *Email: ngvankhiem@yahoo.com Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 12/2020 17 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Lá non 20 bạch hệ F4 thu thập ngẫu nhiên từ ruộng thí nghiệm khảo nghiệm DUS Mộc Châu, tỉnh Sơn La năm 2019 Mẫu bảo quản túi ni lông, sau rửa sạch, thấm khơ, tách chiết DNA tổng số bước 4; 72oC - 10 phút Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% hiệu điện 70 V, 60 phút sử dụng dung dịch đệm TAE, chứa Ethidium Bromid Sản phẩm PCR chụp ảnh phân tích gel Gel DocIt2 Hãng UVP (Hoa Kỳ) Bảng Tên mồi ISSR, trình tự mồi nhiệt độ gắn mồi phản ứng PCR TT Tên mồi 2.2 Phương pháp 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số Mẫu non nghiền ni tơ lỏng đến bột mịn Sau chuyển 100 mg vào ống ml để tách chiết DNA tổng số theo phương pháp Doyle & Doyle (1987) có cải tiến DNA tổng số sau thu được, xử lý nhúng vào dung dịch Ammonium acetat (3M) thời gian 30 giây, rửa cồn 70o hòa tan nước cất vô trùng DNA tổng số loại bỏ RNA cách ủ với RNAse I 37oC Độ tinh DNA kiểm tra điện di gel agarose 0,8% Nồng độ DNA tổng số đo máy quang phổ trước tiến hành PCR 2.2.2 Phản ứng ISSR-PCR Mồi ISSR (Inter simple sequence repeat) chu trình phản ứng PCR sử dụng nghiên cứu theo Guo et al (2009) Mồi ISSR cung cấp hãng IDT (Hoa Kỳ) Phản ứng PCR thực thể tích 25 µl Mỗi phản ứng gồm 30 ng DNA, mồi (1 µM), 100 mM loại dNTP, đệm PCR U enzym Taq polymerse Phản ứng PCR tiến hành máy PCR với chu trình nhiệt: 94oC - phút; 94oC – 30 giây; 48-56oC phụ thuộc vào mồi (Bảng 1) – 45 giây; 72oC- phút; lặp lại 39 lần từ bước đến UBC815 UBC834 UBC841 UBC853 UBC857 UBC862 UBC864 UBC868 UBC900 Trình tự mồi Nhiệt độ gắn mồi (oC) CTC T CT CTC TCT CTC TG 50 AG A GAG A GA GAG A GA GYT 56 GAG AGA GA G AGA G AG AYC 54 TCT CT C TCT CTC TCT CRT 50 ACA CAC ACA CA C A CA CYG 54 AG C AG C AG C A GC A GC A GC 56 ATG ATG ATG A TG ATG A TG 48 GA A GAA G AA GA A GA A GAA 48 ACT TCC CA A CAG GTT AA C A CA 56 Ghi chú: Y: base C T; R base A G 2.2.3 Ghi nhận liệu phân tích thống kê Các băng DNA có mặt ghi nhận (1), vắng mặt ghi nhận (0) mồi sở kích thước băng Ma trận 1/0 sử dụng để ước tính mức độ khác di truyền tương đồng di truyền Hàm lượng thơng tin đa hình tính theo phương pháp Weir (1996) Xác định hệ số tương đồng di truyền Jaccard, xây dựng sơ đồ hình quan hệ di truyền 20 bạch dựa theo phương pháp UPGMA NTsys-pc (Rohlf, 1998) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết DNA tổng số Hình Ảnh điện di DNA tổng số Giếng 1-20 tương ứng mẫu BC1 đến BC20 DNA tổng số tách chiết từ tươi dòng kiểm tra điện di gel agarose 0,8% (Hình 1) Nồng độ DNA xác định phương pháp đo quang phổ hấp phụ Nồng độ DNA tổng số mẫu dao động từ 632-899 ng/µl (Bảng 2) Hình ảnh điện di DNA tổng số hình số A260/A280 mẫu dao động từ 1,85-1,99 bảng cho thấy mẫu DNA tổng số loại bỏ hồn tồn RNA, sử dụng cho phản ứng PCR 18 Bảng Nồng độ DNA tổng số BC1 đến BC20 TT Tên mẫu Chỉ số Nồng độ DNA A260/280 (ng/µl) BC1 1,89 740 BC2 1,86 670 BC3 1,85 860 BC4 1,97 840 BC5 1,89 830 BC6 1,87 632 Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 12/2020 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 BC7 BC8 BC9 BC10 BC11 BC12 BC13 BC14 BC15 BC16 BC17 BC18 BC19 BC20 1,93 1,89 1,88 1,95 1,86 1,98 1,97 1,93 1,95 1,85 1,96 1,89 1,99 1,90 848 775 742 866 848 772 899 840 648 847 759 748 798 728 Ghi chú: Nơi thu mẫu: huyện Mộc Châu, tỉnh Sơn La 3.2 Đáng giá đồng di truyền bạch chỉ thị ISSR Tổng cộng 44 băng DNA tạo ghi nhận từ sản phẩm khuếch đại PCR 20 mẫu bạch (BC1 đến BC20) sử dụng mồi, băng lớn có kích thước khoảng 2,0 kb băng có kích thước nhỏ khoảng 0,1 kb (Bảng 3) Trung bình thu 4,89 băng/mồi Số băng đồng hình thu 1,67 băng/mồi, chiếm 34,09%, số băng đa hình trung bình thu 3,22 băng/mồi, chiếm 65,91% Mức độ đa hình băng DNA thu phản ánh khác cấu trúc DNA hệ gen Chỉ số PIC thu trung bình 0,339 Ảnh điện di sản phẩm PCR 20 mẫu thể hình Mẫu BC6 có khác biệt so với mẫu khác khuếch đại mồi U815, U834, U841, U853, U868 Hình Ảnh điện di sản phẩm ISSR-PCR với mồi khác M: thang chuẩn DNA (100 bp) Giếng 1-20: tương ứng mẫu BC1 đến BC20 Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 12/2020 19 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ Bảng Kết khuếch đại PCR 20 mẫu bạch (BC1 đến BC20) mồi ISSR Kích thước Tên mồi Số băng Số băng Tỷ lệ băng Số băng Tỷ lệ băng Chỉ số PIC băng (kb) đa hình đa hình thu đồng hình đồng hình (%) (%) UBC815 11,11 88,89 0,336 0,25-1,0 UBC834 50,00 50,00 0,281 0,20-1,1 UBC841 0 100 0,638 0,3-0,55 UBC853 16,67 83,33 0,660 0,3-0,7 UBC857 3 100 0 0,000 0,2-0,40 UBC862 3 100 0 0,000 0,1-0,35 UBC864 2 100 0 0,000 0,4- 0,5 UBC868 0 100 0,698 0,4-0,7 UBC900 28,57 71,43 0,438 0,2-2,0 Tổng số băng 44 15 29 0,1 -2,0 kb Trung bình 4,89 1,67 34,09 3,22 65,91 0,339 TT Bảng Hệ số tương đồng 20 bạch (BC1 đến BC20) Hình Sơ đồ quan hệ di truyền 20 bạch BC1 đến BC20 Số liệu thu sau thực phản ứng thiết lập, thể qua sơ đồ quan hệ di PCR thống kê phân tích qua phần mềm truyền (Hình 3) Hệ số tương đồng di truyền trung NTSYS2.1 thiết lập bảng hệ số tương đồng di truyền bình 20 dao động từ 0,52 đến 1,0, trung bình (Bảng 4) Trên sở hệ số tương đồng 0,66 Quan hệ di truyền 20 chia làm di truyền 20 cây, mối quan hệ chúng nhóm lớn: Nhóm thứ gồm BC6; Nhóm th 20 Nông nghiệp phát triển nông thôn - KỲ - TH¸NG 12/2020 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ gồm 19 lại BC1, BC2, BC3, BC4, BC5, BC7, BC8, BC9, BC10, BC11, BC12, BC13, BC14, BC15, BC16, BC17, BC18, BC19, BC20 Khi loại bỏ BC6, hệ số tương đồng di truyền 19 lại dao động từ 0,80 đến 1,0 Theo George (20004), đánh giá tính đồng di truyền ngơ (Zea mays), lồi sinh sản giao phấn chéo phân tích thị SSR, tác giả loại bỏ mẫu có hệ số sai khác di truyền 0,20 hay hệ số tương đồng di truyền 0,80 Điều có nghĩa có hệ số tương đồng di truyền ≥ 0,80 coi đồng di truyền giống giao phấn chéo Bạch giống trồng sinh sản theo hình thức giao phấn chéo Như vậy, nghiên cứu này, tổng số 20 bạch từ thí nghiệm khảo nghiệm DUS, loại bỏ BC6 19 bạch cịn lại thu hạt giống Như vậy, sử dụng thị phân tử ISSR xác nhận khác dạng số 20 nghiên cứu Theo quy phạm khảo nghiệm DUS số trồng, áp dụng quần thể chuẩn với tỷ lệ khác dạng tối đa 1% với xác suất chấp nhận tối thiểu 95% Đối với giống mướp đắng (Momordica charantia L) lai vào tỷ lệ khác dạng tổng số thí nghiệm, trường hợp độ lớn mẫu 40 cây, số khác dạng cho phép (QCVN 01-153: 2014/BNNPTNT) Rau dền thuộc chi Amaranthus L số quan sát 60 (cả lần nhắc lại), số khác dạng tối đa cho phép (QCVN 01-156: 2014/BNNPTNT) Bông (Gossypium L.) tổng số đánh giá 200 số khác dạng tối đa cho phép (CVN 01123:2013/BNNPTNT); Gừng (Zingiber officinale Rosc.), trường hợp độ lớn mẫu 30 cây, số khác dạng tối đa chấp nhận (International Union for the Protection of New Varieties of Plants, 1996) Đối với khoai tây (Solanum tuberosum (L.), số quan sát 100 (trong lần nhắc lại) số khác dạng tối đa cho phép (QCVN 01-69: 2011/BNNPTNT) Mẫu giống bạch BC9 nhập nội sau hệ chọn lọc từ năm 2012- 2018 theo sơ đồ chọn lọc giống giao phấn chéo Vũ Đình Hịa cộng (2005) Hạt giống thệ F3 thu tiến hành khảo nghiệm VCU DUS năm 2017-2018 cho hệ F4 Kết đánh giá đồng di truyền giống dựa vào đặc điểm hình thái theo quy phạm khảo nghiệm DUS (theo kiểu hình) cho thấy tỷ lệ khác dạng hệ F4 số 30 theo dõi, chứng tỏ mẫu giống đồng hình thái Trong nghiên cứu này, kết đánh giá tính đồng di truyền thị ISSR tương ứng với kết đánh giá tính đồng kiểu hình ghi nhận qua đặc điểm hình thái bảng mơ tả giống bạch Quy phạm khảo nghiệm giống bạch sở Viện Dược liệu ban hành KẾT LUẬN Tổng cộng 44 băng DNA có kích thước từ 0,1 kb -2,0 kb tạo từ khuếch đại 20 mẫu bạch sử dụng mồi ISSR Trung bình thu 4,89/mồi Số băng đồng hình 1,67 băng/mồi, chiếm 34,09%, số băng đa hình 3,22 băng/mồi, chiếm 65,91% Hệ số tương đồng di truyền 20 mẫu dao động từ 0,52-1,00 Chỉ số PIC trung bình thu trung bình 0,339 Cây BC6 khác dạng so với 19 khác 19 tổng số 20 cịn lại có hệ số di truyền cao 0,80, chứng tỏ mẫu giống bạch sau hệ F4 có tính đồng nhất, sử dụng để sản xuất hạt giống TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Huy Bích cộng (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam Tập II, NXB Khoa học Kỹ thuật Vũ Đình Hịa, Vũ Văn Liết, Vũ Văn Hoan (2005) Giáo trình chọn giống trồng Đại học Nơng nghiệp Hà Nội Bùi Văn Thế Vinh, Vũ Thị Thủy, Hoàng Thanh Tùng, Vũ Thị Hiền, Trần Xuân Tình, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhật (2015) Đáng giá ổn định di truyền sâm Ngọc Linh (Panax vietnamesis Ha et Grushv thị RAPD Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 13(1):63-73 Doyle JJ and Doyle JL (1987) A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochemical Bulletin, 19:11-15 George MLC (2004) Protocols for Maize Genotyping using SSR Markers and Data Analysis Laboratory Handbook, Ambionet Service Laboratory, International Maize and Wheat Improvement Center (CIMMYT) Guo D-y, Ma Y-y, Tang L, Chen Y-z, Qiang L (2009) Genetic diversity of Radix Angelicae Dahuricae germplasmic resource based on ISSR analysis Chinese Traditional and Herbal Drugs,40(10):1627-1630 Huang WJ, Ning GG, Liu GF and Bao MZ (2009) Determination of genetic stability of longterm micropropagated plantlets of Platanus acerifolia Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 12/2020 21 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ using ISSR markers Biologia Plantarum 53 (1): 159163 International Union for the Protection of New Varieties of Plants (1996) Guidelines For the Conduct of Test for Distinctiveness, Uniformity and Stability On Ginger (Zingiber officinale Rosc.) Meia Z, hang C, Khana A, Zhu Y, Taniaa M, Luo P, Fu J (2015) Efficiency of improved RAPD and ISSR markers in assessing genetic diversity and relationships in Angelica sinensis (Oliv.) Diels varieties of China, Electronic Journal of Biotechnology, 18(2): 96-102 10 Nei M and Li WH (1979) Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases Proc Natl Acad Sci 76:5269–5273 11 Rohlf FJ (1998) 12 NTSyS-p.c Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System (Version 2.0) Exeter Software Publishers Ltd., Setauket 13 Yousefiazarkhanian M, Asghari A, Ahmadi J, Asghari B, Jafari AA (2016) Genetic Diversity of Salvia Species Assessed by ISSR and RAPD Markers Not Bot Horti Agrobo, 44(2):431-436 14 Weir BS (1996) Genetic Data Analysis II: Methods for Discrete Population Genetic Data Sinauer Associates, Inc., Sunderland EVALUATION OF GENETIC UNIFORMITY OF Argelica dahurica USING ISSR MARKER Nguyen Van Khiem1*, Tran Ngoc Thanh 1, Nguyen Minh Tuyen1 , Dinh Thanh Giang1, Duong Thi Ngoc Anh1, Duong Thi Phuc Hau1, Tran Danh Viet1, Tran Thi Kim Dung1 National Institute of Medicinal Mterials * Email: ngvankhiem@yahoo.com Summary In the present study, genetic uniformity of Argelica dahurica at F4 generation was evaluated using ISSR marker Total of 20 plants collected randomly in DUS test experiment in Moc Chau – Son La province in 2019 Nine primers were used in the PCR reactions producing 44 bands, sizing 0.1 – 2.0 kb An average of 4.89 bands/primer was obtained The rate of polymorphic band was 3.22/primer (65.91%) The coefficient of genetic similarity between 20 plants ranged from 0.52 to 1.00 PIC coefficient was 0.339 BC6 was off-type plant The coeffect of genetic similarity of remaining 19 plants (except BC6 plant) ranged from 0.80-1.0 Thus, 19 these plants could be used for seed production due to high genetic uniformity Keywords: Genetic Uniformity, genetic Similarity, Argelica dahurica, ISSR Người phản biện: PGS.TS Nguyễn Văn Đồng Ngày nhận bài: 6/7/2020 Ngày thông qua phản biện: 6/8/2020 Ngày duyệt ng: 13/8/2020 22 Nông nghiệp phát triển nông thôn - KỲ - TH¸NG 12/2020 ... cứu này, kết đánh giá tính đồng di truyền thị ISSR tương ứng với kết đánh giá tính đồng kiểu hình ghi nhận qua đặc điểm hình thái bảng mô tả giống bạch Quy phạm khảo nghiệm giống bạch sở Viện... 728 Ghi chú: Nơi thu mẫu: huyện Mộc Châu, tỉnh Sơn La 3.2 Đáng giá đồng di truyền bạch chỉ thị ISSR Tổng cộng 44 băng DNA tạo ghi nhận từ sản phẩm khuếch đại PCR 20 mẫu bạch (BC1 đến BC20) sử... số tương đồng di truyền 19 lại dao động từ 0,80 đến 1,0 Theo George (20004), đánh giá tính đồng di truyền ngơ (Zea mays), lồi sinh sản giao phấn chéo phân tích thị SSR, tác giả loại bỏ mẫu có hệ