KHOA HỌC CÔNG NGHỆ N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n KỲ 1 TH¸NG 12/2020 23 ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TRONG CÁC QUẦN THỂ BA KÍCH TÍM (Morinda officinalis F C How ,) TẠI QUẢNG NAM VÀ QUẢNG NINH BẰNG[.]
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TRONG CÁC QUẦN THỂ BA KÍCH TÍM (Morinda officinalis F C How.,) TẠI QUẢNG NAM VÀ QUẢNG NINH BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR Trần Thị Hương Giang1, , Nguyễn Thị Thúy Hường1, Nguyễn Thị Thu Hiền1 , Trần Hồ Quang1, 3, Nguyễn Đức Thuận4, Phạm Bích Ngọc1, 3* TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm đánh giá đa dạng di truyền cá thể ba kích quần thể thu thập từ rừng trồng tự nhiên Tây Giang, tỉnh Quảng Nam Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh Từ 11 mồi, chọn lọc mồi ISSR cho đa hình với số alen hiệu trung bình 8,7 Kết đánh giá thị ISSR có tổng số 52 alen từ 11 thị ISSR phát tổng số 45 cá thể thuộc ba quần thể nghiên cứu Cây phân loại xây dựng phần mềm NTCYS 2.1 dựa hệ số tương đồng Jaccard, thuật toán UPGMA cho thấy 45 mẫu ba kích nghiên cứu chia thành nhóm lớn với hệ số tương đồng di truyền dao động khoảng 0,61 đến 1,0 Hệ số sai khác di truyền quần thể Nei Gst=0,3278 hệ số trao đổi gen quần thể (gene flow) Nm= 1,0253 Điều khẳng định quần thể ba kích tự nhiên thuộc Quảng Nam Quảng Ninh có đa dạng mức độ phân tử Kết hữu ích cho bảo tồn, chọn tạo ba kích tỉnh Quảng Nam Quảng Ninh Từ khóa: Ba kích tím, thị phân tử ISSR, đa dạng di truyền, Quảng Nam MỞ ĐẦU Ba kích tím (Morinda officinalis How.,) thuộc họ Cà phê (Rubiaceae), mọc hoang ven rừng, đồi, bụi bờ, bãi hoang hầu hết tỉnh phía Bắc Việt Nam như: Quảng Ninh (Hải Ninh, Hồng Quảng), Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang, Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Sơn La, Hịa Bình, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An số tỉnh miền Trung Quảng Nam Tây Nguyên Theo Nghị định số 48/2002/NĐ-CP ba kích tím nằm danh mục loài thực vật hạn chế khai thác sử dụng (nhóm 2A) Củ ba kích có tác dụng bổ thận âm, bổ thận dương, tăng cường gân cốt, tăng sức đề kháng, sức dẻo dai, khử phong thấp [Huang cs, 2007] Củ ba kích phơi khô để làm thuốc y học cổ truyền, biết đến bốn dược liệu Trung Quốc [Wu cs, 2015; Zhang cs, 2018] Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Học Viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trường Đại học Tây Bắc E.mail: thuyhuongsh76@gmail.com Dịch chiết từ củ ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh với tuyến năng, bổ trí não giúp ăn ngủ ngon [Wei cs, 2006] Nằm khu vực miền Trung phía Đơng dãy Trường Sơn, tỉnh Quảng Nam có thảm thực vật phong phú, đa dạng có nhiều dược liệu sử dụng làm thuốc chữa bệnh cho người Xã Lăng (Tây Giang, Quảng Nam) ghi nhận lồi dược liệu ba kích tím q Do cần thiết có nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền quần thể để phục vụ cho công tác bảo tồn phát triển nguồn gen ba kích tím Hiện nay, có nhiều phương pháp hiệu đánh giá đa dạng di truyền AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic), ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) SSR (Simple Sequence Repeat) [Nguyễn Đức Thành, 2014] Trong đó, thị ISSR với ưu điểm phân tích nhanh, khơng cần phải biết trước thơng tin trình tự gen nhân để thiết kế mồi sử dụng rộng rãi với đánh giá đa dạng di truyền quần thể loài [Nguyễn Đức Thành, 2014; Trần Thị Liễu cs, 2015; Đinh Thị Phịng cs, 2015] Cho tới nay, có số nghiên cứu nước đánh giá đa dạng di truyn qun th ba Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 12/2020 23 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ kích tím (M officinalis) Năm 2011, Liu cs đánh giá đa dạng di truyền ba kích tím thị ISSR Ding cs (2008) nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể ba kích trồng tỉnh Quảng Đơng – Trung Quốc sử dụng thị RAPD Tại Việt Nam, Hoàng Đăng Hiếu cs (2006) thực nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền quần thể ba kích Quảng Ninh sử dụng thị ISSR Trong nghiên cứu này, sử dụng thị ISSR để đánh giá đa dạng di truyền quần thể ba kích huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh quần thể huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam khu vực có diện tích phân bố ba kích lớn quan trọng nước ta Kết nghiên cứu đa dạng nguồn gen quần thể ba kích tím làm sở cho bảo tồn nguồn gen chọn tạo giống ba kích Việt Nam VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.2.1 Vật liệu thực vật Mẫu ba kích tím sử dụng nghiên cứu thu thập hai địa điểm thuộc huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam (50 mẫu) địa điểm Ba Chẽ, Quảng Ninh (39 mẫu) để so sánh Trong đó, mẫu ba kích tím thu Tây Giang thu từ rừng tự nhiên, người dân địa thu hái Mẫu ba kích tím Quảng Ninh thu thập Vườn bảo tồn sưu tập mẫu Hợp tác xã Toàn Dân, Thanh Lâm, Ba Chẽ, đánh giá đa dạng di truyền nghiên cứu Hoàng Đăng Hiếu cs, 2016 Mẫu ba kích tím lưu trữ tủ âm 80 độ phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật lựa chọn để so sánh 2.2.2 Vật liệu di truyền Trình tự nucleotide mồi ISSR lựa chọn, thiết kế dựa vào nghiên cứu Wang cs (2007), cung cấp Công ty Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ, Việt Nam), thơng tin trình tự mồi thể bảng Bảng Tên trình tự mồi ISSR sử dụng nghiên cứu STT 24 Tên mồi ISSR 46 ISSR 50 ISSR 51 ISSR 53 ISSR 54 Locus ISSR 46 ISSR 50 ISSR 51 ISSR 53 ISSR 54 Trình tự (5’-3’) AGAGAGAGAGAGAGAGT TTCACACACACACACACA GAGAGAGAGAGAGAGAA CACACACACACACACAA TCTCTCTCTCTCTCTCG 10 11 ISSR 57 ISSR 61 ISSR 62 ISSR 63 ISSR 64 ISSR 65 ISSR 57 ISSR 61 ISSR 62 ISSR 63 ISSR 64 ISSR 65 CTCTCTCTCTCTCTCTA ACACACACACACACACTG CTCAGAGAGAGAGAGAG CTCGAGAGAGAGAGAGA ACAGTGTTGTGTGTGTG CACTGTGTGTGTGTGTG 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phương pháp thu mẫu tách chiết DNA tổng số Nhóm nghiên cứu tiến hành thu thập 22 mẫu thôn A.Rớh – xã Lăng – huyện Tây Giang (132oĐN 15o51’8”B 107o28’3”Đ) 28 mẫu xã A Tiêng – huyện Tây Giang (358oB 15o52’49”B 107o31’24”Đ) 29 mẫu xã Thanh Lâm – huyện Ba Chẽ - tỉnh Quảng Ninh Các mẫu sử dụng nghiên cứu mẫu non bánh tẻ, mọc vị trí thứ từ đầu cành ba kích tím Mẫu đánh dấu bảo quản riêng biệt điều kiện mát suốt thời gian vận chuyển từ thực địa phịng thí nghiệm lưu giữ nhiệt độ -80oC phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học (Bảng 2) Trên sở khảo sát sơ để thu thập thông tin trạng rừng tự nhiên ba kích tím hai xã huyện Tây Giang (lịch sử, nguồn gốc, mật độ, tuổi, tình hình sinh trưởng…) tiến hành xác định khu vực điều tra bố trí lập hệ thống tiêu chuẩn điển hình tạm thời (OTC) diện tích 500 m2 (20 m x 25 m) nơi tương đối đại diện cấu trúc rừng, điều kiện địa hình thổ nhưỡng toàn khu vực đồ thực địa Tại thôn A.Rớh – xã Lăng xã A Tiêng huyện Tây Giang, có tổng số OTC 50 DNA tổng số tách chiết từ mô theo phương pháp CTAB (Doyle Doyle, 1987) tinh lần kit GeneJet Gel Extraction Kit® (Thermo Scientific) để đảm bảo độ tinh cho phản ứng PCR DNA tổng số sau kiểm tra gel agarose 1% đo hàm lượng, độ tinh máy Nanodrop (Thermo Scientific) DNA tổng số mẫu pha loãng thành nồng độ 20 ng/µl lưu giữ nhiệt độ 20oC 2.2.2 Phản ứng PCR-ISSR Thành phần phản ứng PCR-ISSR tích 25 µl bao gồm: 8,5 µl nước khử ion vơ trùng, µl DNA khn (20 ng/µl), µl mồi (10 pmol), 12,5 µl Master mix Phản ứng PCR thực sau: giai N«ng nghiƯp phát triển nông thôn - K - THáNG 12/2020 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ đoạn khởi đầu thực 94°C phút; giai đoạn khuếch đại thực 30 chu kỳ nhiệt, bao gồm biến tính 94°C 30 giây; gắn mồi 30 giây kéo dài 72°C phút Nhiệt độ gắn mồi thực cho phản ứng PCR dựa dẫn nhà tổng hợp mồi (PHUSA Biochem, Việt Nam) giai đoạn kết thúc kéo dài thực 72°C phút Sản phẩm khuếch đại phân tách gel agarose 1,5% (dùng đệm TBE 1X) hiệu điện 90V giờ, nhuộm với Ethidium bromide chụp lại ánh sáng UV (Clever Scientific®, UK) Kích thước tương đối băng DNA so sánh với kích thước băng DNA chuẩn kb (Thermo Fisher Scientific company, USA) 2.2.3 Phân tích số liệu Vị trí băng DNA điện di mã hóa số (nếu xuất băng DNA) số (nếu khơng xuất băng DNA vị trí tương đương) lưu phần mềm Microsoft Excel (Microsoft Coporation, USA) Các số liệu sau xử lý chương trình NTSYSpc version pc 2.1 (Applied Biostatistics), chương trình POPGEN (Yeh cs, 1997) để xác định số đa dạng di truyền phần trăm băng DNA đa hình (PPB), số alen quan sát (Na), số alen có ý nghĩa (Ne), STT 10 11 12 13 14 15 hệ số đa dạng di truyền Nei quần thể (h), hệ số đa dạng Shannon (I) (Nei, 1973); số đa dạng nguồn gen tổng quần thể (HT); số đa dạng ent rung bình quần thể (HS); số sai khác di truyền quần thể (Gst) số trao đổi gen quần thể (Nm); phương pháp clustering SAHN để xác định quan hệ di truyền mẫu ba kích tím thuộc quần thể nghiên cứu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết thu thập mẫu tách DNA tổng số Nhóm nghiên cứu thu thập 22 mẫu thôn A.Rớh - xã Lăng - huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam 28 mẫu xã A Tiêng - huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam Từ tập hợp 89 cá thể ba kích tím thuộc địa điểm trên, lựa chọn ngẫu nhiên 15 cá thể từ quần thể nêu để phân tích đa dạng di truyền thị phân tử ISSR: mẫu thuộc thôn A.Rớh - xã Lăng - huyện Tây Giang (quần thể 1) đánh số từ đến 15, mẫu thu xã A Tiêng - huyện Tây Giang (quần thể 2) đánh số từ 16 đến 30 Các mẫu thu xã Thanh Lâm, huyện Ba Chẽ, Quảng Ninh (quần thể 3) sử dụng để so sánh, đánh số từ 31 đến 45 (Bảng 2) Bảng Danh sách mẫu ba kích tím sử dụng nghiên cứu Tên Địa điểm Tên Địa điểm Tên Địa điểm STT STT mẫu mẫu mẫu 16 16 31 31 17 17 32 32 Quần thể Quần thể Quần thể Xã 18 18 33 33 Thôn A.Rớh – Xã A Tiêng Thanh Lâm 19 19 34 34 xã Lăng huyện Tây huyện Ba Chẽ, 20 20 35 35 huyện Tây Giang - Quảng Quảng Ninh 21 21 36 36 Giang Quảng Nam 22 22 37 37 o Nam (358 B 23 23 38 38 (132oĐN 15o52’49”B 24 24 39 39 o o 15 51’8”B 107 31’24”Đ) 10 25 25 40 40 o 107 28’3”Đ) 11 26 26 41 41 12 13 14 15 27 28 29 30 27 28 29 30 Kết điện di kiểm tra DNA tổng số gel agarose 1% cho thấy mẫu DNA tổng số thu có độ sáng đồng phần lớn xuất nhiều 42 42 43 43 44 44 45 45 đứt gãy (dải màu trắng chụp đèn UV) mẫu thu ngồi tự nhiên có chứa nhiều hợp chất thứ cấp hay chất lượng mẫu bị ảnh Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 12/2020 25 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ hưởng trình vận chuyển Các mẫu DNA tổng số tiếp tục tinh lần kit GeneJet Gel Extraction Kit® (Thermo Scientific) để đảm bảo độ tinh cho phản ứng PCR Sau tinh mẫu DNA chuyển sang đo nồng độ DNA kiểm tra tỷ lệ A260/A280 Nồng độ DNA thu dao động từ 400 ng/µl đến 1000 ng/µl Độ tinh DNA dựa số A260/A280 cho kết từ 1,8 đến 2,0 Như vậy, DNA tổng số từ 89 mẫu tách chiết thành cơng Trong số đó, 45 mẫu DNA tổng số thuộc quần thể lựa chọn ngẫu nhiên làm đại diện để đánh giá đa dạng di truyền quần thể ba kích tím (Bảng 2) 3.2 Kết khuếch đại mẫu mồi ISSR đa dạng di truyền quần thể dựa thị ISSR Sản phẩm khuếch đại PCR bao gồm băng đồng hình đa hình Trong băng đồng hình băng có mặt tất cá thể nghiên cứu băng đa hình băng xuất số cá thể định Trong nghiên cứu này, 11 mồi sử dụng, có mồi ISSR46, ISSR50, ISSR53, ISSR 62, ISSR63, ISSR65 cho băng DNA đa hình tất 45 mẫu nghiên cứu, mồi lại tạo sản phẩm PCR q nên khơng thể ghi nhận xuất băng xuất băng khơng đủ Sau đó, mồi chọn lọc sử dụng để đánh giá đa dạng 45 mẫu nghiên cứu Trong tổng số 52 alen quan sát được, alen ISSR 53-3 xuất quần thể 1, alen ISSR 50-1, ISSR 62-10 ISSR 65-1 xuất quần thể 2, alen ISSR 46-1 (Hình 1) xuất quần thể Một số alen xuất với tần số cao ISSR62-8 (0,87), ISSR65-7 (0,79)’ ISSR 63-11 (0,71), ISSR62-5 (0,62), có alen xuất với tần số thấp ISSR46-1 (0,02), ISSR50-2 (0,04) ISSR62-6 (0,04) A B C Hình Hình ảnh điện di PCR-ISSR46 với quần thể ba kích tím (A) Quần thể (B) Quần thể (C) Quần thể Tổng số mồi ISSR sử dụng để khuếch đại tạo 52 băng DNA, 51 băng đa hình chiếm 26 tỷ lệ 98% quần thể Các băng có kích thước từ 240 bp đến 3100 bp, số băng mồi tạo từ đến N«ng nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 12/2020 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ 11 băng với trung bình đạt 8,7/mồi Mồi thị ISSR62 ISSR63 cho nhiều băng đa hình với 11 băng, mồi ISSR 46 ISSR 50 cho số băng đa hình thấp với băng Mồi ISSR 65 cho băng, mồi ISSR 53 cho 10 băng Tỷ lệ đa hình với mồi ISSR nghiên cứu cao so với nghiên cứu Hoàng Đăng Hiếu cs (2016) Bảng Biến động di truyền ba quần thể ba kích dựa liệu thị ISSR Tên mồi Kích thước Tổng số băng Số băng đa Tỷ lệ băng đa băng (bp) hình hình (%) ISSR46 500-2700 83,3 ISSR50 500-1500 6 100 ISSR53 240-1600 10 10 100 ISSR62 950-3100 11 11 100 ISSR63 300-3000 11 11 100 ISSR65 560-3100 8 100 Tổng số băng 52 51 Trung bình 8,7 8,5 97,2 STT Tên quần thể QT1 QT2 QT3 NPB 37 22 36 Bảng Các số đa dạng quần thể ba kích PPB (%) NaSD NeSD hSD 71,15 1,98080,1387 1,50490,3624 0,29570,1708 42,31 1,42130,4989 1,27650,3664 0,16040,2017 69,23 1,69230,4660 1,36470,3589 0,21910,1897 ISD 0,44970,2181 0,23720,2913 0,33420,2683 Ghi chú: NPB: số phân đoạn đa hình PPB(%): Phần trăm băng DNA đa hình; Na: Số alen quan sát được; Ne: số alen có ý nghĩa; h: hệ số đa dạng di truyền Nei mẫu; I: hệ số Shannon; SD: độ lệch chuẩn Số alen quan sát (Na) quần thể QT1 cao đạt 1,9808 quần thể có số alen quan sát 1,6923 thấp quần thể 2, đạt 1,4213 Ngồi ra, số alen có ý nghĩa (Ne) biến động từ 1,2765 (quần thể 2) đến 1,5049 (quần thể 1) trung bình 1,3647 (quần thể 3) Trong nghiên cứu này, giá trị Na Ne quần thể quan sát lớn quần thể có giá trị nhỏ Điều chứng tỏ quần thể có đa dạng lớn quần thể quần thể có mức độ đa dạng Chỉ số Na Ne phân tích nghiên cứu có giá trị lớn so với nghiên cứu Hiếu cs (2016) Hệ số đa dạng di truyền Nei (h) ba quần thể khoảng từ 0,2957 đến 0,1604 Hệ số Shannon (I) khoảng từ 0,4497 đến 0,2372 Chỉ số sai khác di truyền Gst quần thể tính tốn sử dụng phần mềm POPGENE cho kết số Gst đạt 0,3278, mức độ sai khác thấp quần thể ba kích Chỉ số Gst < 0,5 kết hầu hết nghiên cứu loài thực vật phân tích ISSR (Huang cs, 2007; Yu cs, 2011; Zhang cs, 2010) Dựa giá trị Gst, giá trị Nm tính tốn đạt 1,0253 cho thấy tần số trao đổi gen thấp quần thể (Bảng 5) Chỉ số sai khác di truyền ba quần thể GST = 0,3278 chứng tỏ có 32,78% sai khác di truyền mẫu nghiên cứu Mức độ trao đổi gen thể qua hệ số trao đổi gen (Nm) ba quần thể thấp 1,0253 Hệ số trao đổi gen thấp quần thể đặc điểm chung quần thể quý, có số lượng nhỏ Ngược lại, với chọn tạo mẫu, biến động di truyền, đột biến, chọn lọc cách ly di truyền tác động đến đa dạng nguồn gen Bảng Các số đa dạng quần thể nghiên cứu Mean ± SD Các thông số Số lượng mẫu 45 0,2957±0,0292 HT 0,1988±0,0141 HS GST 0,3278 Nm 1,0253 Ghi chú: HT: Chỉ số đa dạng nguồn gen tổng quần thể; HS: Chỉ số đa dạng gen trung bình quần thể; GST: Chỉ số sai khác di truyền Nei quần thể; Nm: Chỉ số trao i gen gia cỏc qun th Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 12/2020 27 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ Nhóm tác giả tính toán hệ số tương đồng di tryền (Bảng 6) xây dựng sơ đồ quan hệ di truyền (Hình 2) thể mối quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu Bảng Hệ số tương đồng di truyền 45 ba kích nghiên cứu Hình Cây quan hệ di truyền cá thể ba quần thể ba kích tím huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam huyện ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh 28 Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 12/2020 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ Hệ số tương đồng di truyền phản ánh quan hệ di truyền cá thể ba kích khác Hai cá thể ba kích gần mặt di truyền hệ số tương đồng di truyền chúng lớn ngược lại Kết phân tích tương đồng di truyền thể bảng Hệ số tương đồng nội quần thể nằm khoảng 0,46 đến 1,00 Kết hợp với quan sát thực địa nghiên cứu Hồng Đăng hiếu cs (2016) thấy suy thối diện tích rừng ba kích ngồi tự nhiên trồng tập trung phân tán nguyên nhân dẫn đến giảm tính đa dạng di truyền quần thể So sánh tương đồng di truyền ba quần thể khảo sát cho kết tương tự Dựa vào phân loại xây dựng dựa liệu khoảng cách di truyền thấy rõ ràng phân chia thành hai nhánh lớn riêng biệt: Nhánh bao gồm cá thể thuộc quần thể 2; Nhánh bao gồm cá thể thuộc quần thể Kết phù hợp với phân bố tự nhiên quần thể nghiên cứu: quần thể quần thể có phân bố huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam, quần thể thuộc huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh hai tỉnh có vị trí địa lý phân bố xa KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Như vậy, tổng số 11 mồi ISSR sử dụng nghiên cứu có mồi tạo băng đa hình, với số alen trung bình 8,7/mồi 45 mẫu nguồn gen phân thành nhóm lớn với hệ số tương đồng di truyền dao động khoảng 0,46 đến 1,0 Trong nhóm lớn bao gồm mẫu thuộc quần thể (thôn A.Rớh - xã Lăng - huyện Tây Giang) phần lớn mẫu thuộc quần thể (xã A Tiêng huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam) nhóm lớn bao gồm mẫu thuộc huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh hai mẫu 29, 30 quần thể Dữ liệu phân tích nghiên cứu cung cấp thơng tin hữu ích việc khảo sát, phân tích trạng đa dạng quần thể ba kích tím Quảng Nam, từ góp phần chọn tạo bảo tồn ba kích tím huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam LỜI CẢM ƠN Cơng trình thực nhờ kinh phí Dự án:“Phát triển nguồn dược liệu ba kích tím Morinda officinalis Hiệp Đức, Quảng Nam phục vụ chế biến thuốc thực phẩm chức năng” mã số VAST.SXTN-06/17-19 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ding P, Liu J, Yang TC (2008) Genetic diversity of Morinda officinalis by RAPD Chin Trad Herb Drug 39:1869–1872 Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Liễu, Vũ Thị Thu Hiền, Trần Thị Liễu, Trần Thị Việt Thanh, Nguyễn Quốc Bình, Vũ Đình Duy, Nguyễn Tiến Hiệp, Phạm Hữu Nhân (2015) Đánh giá đa dạng di truyền quần thể tự nhiên loài Kim giao núi đất (Nageia wallichiana (C Presl) Kuntze) Tây Ngun thị ISSR Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(1): 131–141 Doyle J J, Doyle J J (1989) A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochemical Bulletin 19: 11-15 Hoàng Đăng Hiếu, Chu Thị Thu Hà, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Hà (2016) Sử dụng thị ISSR việc đánh giá đa dạng di truyền quần thể ba kích Quảng Ninh Tạp chí Sinh học 38(1): 89-95 Li B, Lu C, Zhou ZY, Xiang ZH (2000) Construction of silkworm RAPD molecular linkage map Yi Chuan Xue Bao 27(2):127-132 Liu Y-J, Huang Y, Rong J-D, Zhang Y, Xue YM, Zheng Y-S (2011) Genetic diversity analysis of Morinda officinalis by ISSR markers Journal of Fujian College of Forestry 31(3):203–206 Huang N-Z, Fu C-M, Zhao Z-G, Tang F-L, Li F (2007) Tissue culture and rapid proliferation of Morinda officinalis How Botany, Guangxi Zhuangzu Autonomous Region and the Chinese Academy of Sciences, Guilin 541006, China 27(1):127-131 Nguyễn Đức Thành (2014) Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật Tạp chí Sinh học 36(3): 265-294 Pillai P P, Sajan S J, Menon M K, Jayakumar P S K, Subramoniam A (2012) ISSR analysis reveals high intraspecific variation in Rauvolfia serpentina L - A high value medicinal plant Biochemical Systematics and Ecology, 40: 192197 10 Trần Thị Liễu, Vũ Thị Thu Hiền, Nguyễn Tiến Hiệp, Đinh Thị Phịng (2015) Tính đa dạng nguồn gen di truyền lồi Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte) - Lồi đặc hữu hẹp Tây Nguyên, Việt Nam thị ISSR Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 53 (2): 169179 Nông nghiệp phát triển nông thôn - KỲ - TH¸NG 12/2020 29 ... TTCACACACACACACACA GAGAGAGAGAGAGAGAA CACACACACACACACAA TCTCTCTCTCTCTCTCG 10 11 ISSR 57 ISSR 61 ISSR 62 ISSR 63 ISSR 64 ISSR 65 ISSR 57 ISSR 61 ISSR 62 ISSR 63 ISSR 64 ISSR 65 CTCTCTCTCTCTCTCTA...KHOA H? ?C CƠNG NGHỆ kích tím (M officinalis) Năm 2011, Liu cs đánh giá đa dạng di truyền ba kích tím thị ISSR Ding cs (2008) nghiên c? ??u đa dạng di truyền quần thể ba kích trồng tỉnh Quảng Đông... đánh giá đa dạng di truyền quần thể ba kích huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh quần thể huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam khu v? ?c có di? ??n tích phân bố ba kích lớn quan trọng nư? ?c ta Kết nghiên c? ??u đa dạng