Nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá mức độ đa dạng di truyền của giống tỏi (Allium sativum L.) tại huyện Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi bằng chỉ thị phân tử ISSR. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỏi Lý Sơn có vỏ tép màu trắng, số tép dao động từ 15-23 tép, đường kính vùng rễ dao động từ 1,1 đến 2,0 cm.
BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ DOI: 10.15625/vap.2020.00021 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA TỎI LÝ SƠN (Allium sativum L.) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR Nguyễn Minh Lý*, Mai Xuân Cường, Đinh Thị Thùy Trinh Tóm tắt: Nghiên cứu thực nhằm đánh giá mức độ đa dạng di truyền giống tỏi (Allium sativum L.) huyện Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi thị phân tử ISSR Kết nghiên cứu cho thấy, tỏi Lý Sơn có vỏ tép màu trắng, số tép dao động từ 15-23 tép, đường kính vùng rễ dao động từ 1,1 đến 2,0 cm Ngồi ra, tỏi Lý Sơn có khác đường kính củ tỏi hộ nơng dân canh tác khu vực có điều kiện địa lý khác Phân tích đa hình đoạn DNA nhằm đánh giá đa dạng di truyền tỏi Lý Sơn từ thị ISSR gồm: UBC808, UBC810, UBC834 cho thấy có khác biệt giống hộ củ tỏi khác kiểu hình Điều chứng tỏ đa dạng di truyền giống tỏi Lý Sơn Đây sở khoa học cho việc chọn lựa giống tỏi phù hợp với điều kiện địa lí nâng cao suất trồng Từ khóa: Allium sativum, đa dạng di truyền, thị phân tử, ISSR, tỏi, Lý Sơn MỞ ĐẦU Tỏi (Allium sativum L.) gia vị quan trọng có giá trị dinh dưỡng, giá trị dược liệu giá trị kinh tế cao Tỏi trồng nhiều tỉnh thành Việt Nam đảo Lý Sơn, huyện Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi tỉnh thành khác Hải Dương, Lâm Đồng, Khánh Hịa, Ninh Thuận Ngồi việc sử dụng dạng tươi khơ, tỏi cịn chế biến thành loại thực phẩm bổ dưỡng khác tỏi đen lên men, nước ép tỏi Sản phẩm tỏi đen lên men sử dụng việc điều trị bệnh huyết áp cao số loại bệnh tim mạch, phòng ngừa hỗ trợ tiểu đường, ngăn ngừa phát triển tế bào ung thư (Kim et al., 2012; Fossen et al., 1996) Trong số vùng trồng tỏi Việt Nam, tỏi Lý Sơn có nhiều đặc điểm khác biệt cơng nhận thương hiệu tỏi quốc gia vào năm 2009 Diện tích trồng tỏi Lý Sơn đạt khoảng 250 - 300 ha, đạt suất khoảng 70 - 80 tạ/ha Tỏi trồng chủ lực, đóng góp giá trị kinh tế cao chiếm khoảng ¾ giá trị nơng nghiệp huyện đảo Lý Sơn Theo khảo sát thực địa vào tháng 10/2018 nhóm nghiên cứu việc lưu giữ giống tỏi Lý Sơn hộ nông dân thực theo phương pháp thủ công truyền thống Tỏi bảo quản sau phơi khô nhà kho tuyển chọn giống ngẫu nhiên từ củ tỏi mùa vụ trước Điều dẫn đến thối hóa giống làm giảm chất lượng tỏi làm suất tỏi Lý Sơn không ổn định qua năm Chính vậy, việc đánh giá tính đa dạng di truyền nguồn giống tỏi Lý Sơn cung cấp sở khoa học cho việc đưa biện pháp bảo tồn nhân giống loại tỏi cách hiệu Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng *Email: nmly@ued.udn.vn PHẦN I NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 177 Trong phương pháp đánh giá tính đa dạng di truyền nguồn giống tỏi, thị phân tử sử dụng tương đối hiệu quả, đặc biệt thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) Jabbes et al (2011) sử dụng thành công thị ISSR để đánh giá tính đa dạng di truyền 31 giống tỏi địa phương phục vụ cho công tác phân loại đăng ký giống Tuy-ni-di Chen et al (2014) phân loại 39 giống tỏi Trung Quốc thị SSR 17 thị ISSR Đến năm 2018, Sharma nnk khẳng định ISSR có hiệu cao việc phân loại đánh giá đa dạng di truyền 31 giống tỏi Ấn Độ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các củ tỏi giống thu thập từ hộ nông dân thuộc xã An Hải An Vĩnh (trước đây) thuộc huyện Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi (Tọa độ: N 15o23’0.0996” E 09o6’38.5596”) Các đặc điểm hình thái củ tỏi đánh giá bao gồm: số lượng tép, kích thước đường kính củ đường kính vùng rễ (Hồ Huy Cường, 2009; Wang et al., 2014; Kumar, 2015) 10 đoạn mồi ISSR sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền tỏi Lý Sơn (Bảng 1) Bảng Trình tự mồi ISSR Tên đoạn mồi Trình tự nucleotide 5’-3’ UBC808 AGAGAGAGAGAGAGAGC UBC810 GAGAGAGAGAGAGAGAT UBC812 GAGAGAGAGAGAGAGAA UBC818 CACACACACACACACAG UBC824 TCTCTCTCTCTCTCTCG UBC828 TGTGTGTGTGTGTGTGA UBC834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT UBC842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG UBC846 CACACACACACACACART UBC 848 CACACACACACACACARG Tách chiết DNA tổng số tiến hành theo phương pháp CTAB có cải tiến từ mẫu tỏi (Doyle and Doyle, 1990) DNA tách chiết từ cá thể tỏi riêng lẻ hộ nông dân Sau đó, mẫu DNA đại điện cho hộ tạo thành trộn 10 µL dịch DNA tách chiết cá thể riêng lẻ thuộc hộ theo phương pháp BSA (Bulked segregant analysis) (Michelmore et al., 1991) Phản ứng PCR thực với thể tích phản ứng 20µL, bao gồm Master mix PCR 1X (Phu Sa Biochem); 200nM mồi ISSR; 0,125 đơn vị Taq polymerase 40ng DNA tổng số Quá trình nhân tiến hành máy ESCO Aeris - BG096 theo chu trình nhiệt sau: 95°C phút; 35 chu kỳ lặp lại với 94°C 30 giây, 38°C 30 giây 72°C 30 giây; 72°C 10 phút; cuối giữ sản phẩm 4°C Sản phẩm PCR nhuộm RedSafeTM Nucleic Acid Staining Solution điện di trên1,0% agarose gel dung dịch đệm TAE Số liệu nghiên cứu hình thái củ tỏi xử lý phần mềm IBM Statistics SPSS22 Tukeytest sử dụng để so sánh giá trị trung bình với độ tin cậy 95% Các giá 178 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM trị trung bình xem khác có ý nghĩa thống kê p≤0,05 (Hồng Trọng Chu Nguyễn Mộng Ngọc, 2008) Phần mềm Popgene ver 1.31 sử dụng để phân tích số thị ISSR (Yeh et al., 1999) Cây di truyền xây dựng phần mềm NTSYS_PC version 2.1 với hệ số NEI72 Phương pháp clustering SAHN để đánh giá mối quan hệ di truyền mẫu tỏi (Rohlf, 1998) Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) tính phần mềm PIC Calculator theo cơng thức (Roldan-Ruiz et al., 2000) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm hình thái mẫu tỏi Kết phân tích hình thái đặc trưng củ tỏi thu từ hộ nơng dân cho thấy, tỏi Lý Sơn có vỏ tép màu trắng; số tép dao động từ 15-23, đường kính rễ từ 1-2 cm (Bảng 2, Hình 1) Trong đó, đường kính củ hộ lại có khác biệt chia làm nhóm Nhóm có hộ T1 với đường kính củ dao động từ 3,0-3,2 cm Nhóm gồm: hộ T2, T3 T4 với đường kính củ dao động 2,7-3,1 cm Nhóm gồm hộ: T5, T6, T7 T8 có đường kính củ dao động 2,6-3,0 cm Sự khác biệt điều kiện trồng tỏi khác hộ Hình Đặc điểm hình thái tỏi thu thập từ hộ Lý Sơn T1 Hộ bà Đại; T2 Hộ bà Thạnh; T3 Hộ ông Quý; T4 Hộ ông Quang; T5 Hộ bà Hạnh; T6 Hộ bà Hịa; T7 Hộ ơng Phúc T8 Hộ bà Hương PHẦN I NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC STT Hộ T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 179 Bảng Kết so sánh hình thái tỏi hộ Lý Sơn Địa điểm Màu vỏ tép Số tép Đường kính củ Đường kính rễ An Hải Trắng 20,6±3,56a 3,09±0,18a 1,16±0,07a a ab An Vĩnh Trắng 19,4±3,94 2,92±0,22 1,14±0,07a An Vĩnh Trắng 20,5±4,76a 2,88±0,25ab 1,14±0,09a a ab An Hải Trắng 21,0±3,09 2,91±0,19 1,08±0,1a a b An Hải Trắng 19,5±3,06 2,81±0,18 1,09±0,07a An Hải Trắng 18,5±3,10a 2,81±0,16b 1,08±0,06a a b An Vĩnh Trắng 19,6±3,77 2,72±0,16 1,1±0,07a a b An Vĩnh Trắng 19,9±4,20 2,8±0,21 1,13±0,04a 3.2 Đa dạng alen thị ISSR 10 đoạn mồi ISSR sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền tỏi Lý Sơn Trong đó, mồi tạo vạch đa hình rõ ràng ổn định phù hợp cho việc đánh giá tính đa dạng di truyền giống tỏi (Hình 2) Tổng cộng 15 locus đa hình tổng số 20 locus phát số quần thể tỏi tỉ lệ đa hình 75% (Bảng 3) Giá trị lớn số lượng locus đa hình khuếch đại mồi UBC 808 UBC 834 (6 băng đa hình); số lượng locus đa hình tối thiểu khuếch đại mồi UBC 810 (3 băng đa hình) Số lượng alen hiệu (Ne) trung bình 1,4398, đa dạng di truyền trung bình Nei 0,2799 số Shannon trung bình 0,3950 Những số cho thấy mức độ đa dạng di truyền cao tỏi Lý Sơn Giá trị PIC trung bình cho 20 locus ISSR 0,2971 giá trị PIC nằm khoảng từ 0,2852 đến 0,2969 Các thị ISSR cho thấy khả công cụ hiệu việc đánh giá đa dạng di truyền tỏi tương tự đánh giá trước (Jabbeset al., 2011; Chen et al., 2014) Hình Kết phân tích mẫu tỏi đại diện cho hộ với thị ISSR: UBC 808; UBC 810; UBC 834 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 180 Tên Primer UBC808 UBC810 UBC834 Trung bình Bảng Đa hình phân đoạn DNA thị ISSR NPL PPL PIC Ne H 1,3073 0,2057 75 0,2930 1,6132 0,3365 75 0,2969 1,3989 0,2462 75 0,2852 15 75 0,2917 1,4398 0,2799 I 0,3288 0,4805 0,3757 0,3950 H: Sự đa dạng di truyền Nei; I: Chỉ số Shannon; Ne: Số lượng alen hiệu quả; NPL: số lượng locus đa hình; PIC: Chỉ số đa hình di truyền; PPL: tỉ lệ locus đa hình 3.3 Đa dạng di truyền giống tỏi Lý Sơn Từ kết phân tích hình ảnh điện di sản phẩm ISSR xử lí số liệu phần mềm NTSYS_PC version 2.1, mối quan hệ di truyền mẫu tỏi nghiên cứu theo hướng: mối quan hệ giống tỏi thuộc hộ nông dân; đồng giống hộ nông dân Mối quan hệ giống tỏi hộ Kết cho thấy, nguồn giống tỏi hộ nông dân chia làm hai nhóm với tương đồng di truyền 0,55 (Hình 2) Nhóm gồm hộ: T1, T4, T5 T6; hộ thuộc xã An Hải (trước đây) Trong đó, cặp hộ T1, T6 T4, T5 có đồng mặt di truyền giống tỏi (HSDT=1) Nhóm gồm hộ: T2, T3, T7, T8; hộ thuộc xã An Vĩnh (trước đây) Hai hộ T2 T8 có hệ số tương đồng di truyền 0,85 ; tiếp đến hộ T3 với hệ số di truyền với hộ 0,68 Cuối hộ T7 với hệ số di truyền 0,63 so với hộ cịn lại nhóm Điều cho thấy, nguồn giống tỏi Lý Sơn có đa dạng di truyền tương đồng với phân chia địa lí khu vực sinh sống hộ dân Các hộ thuộc xã An Hải (trước đây) có tương đồng giống cao, đó, hộ thuộc xã An Vĩnh (trước đây) có nguồn giống tỏi với mức độ đồng thấp Hình Cây quan hệ di truyền tỏi thu từ hộ nông dân Lý Sơn dựa hệ số tương đồng di truyền PHẦN I NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 181 KẾT LUẬN Nguồn giống tỏi huyện đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi có đặc điểm hình thái đặc trưng: vỏ tép màu trắng, số tép dao động từ 15-23, đường kính rễ dao động từ 1,1 đến 2,0 cm Ba thị ISSR (UBC808, UBC810, UBC834) cho phép đánh giá hiệu không đồng mặt di truyền nguồn giống tỏi huyện đảo Lý Sơn Lời cảm ơn: Đề tài thực với tài trợ Văn phòng hợp tác Hội động vật học Frankfurt Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng TÀI LIỆU THAM KHẢO Chen, S X., Chen, F X., Shen, X Q., Yang, Y T., Liu, Y and Meng, H W., 2014 Analysis of the genetic diversity of garlic (Allium sativum L.) by simple sequence repeat and inter simple sequence repeat analysis and agro-morphological traits Biochemical Systematics and Ecology 55: 260-267 Euphytica 198: 243-254 Doyle, J J and Doyle, J L., 1990 Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus 12(1): 13-15 F J Rohlf NTSYSpc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Version 2.0 User Guide Applied Biostatistics Inc., Setauket, New York 1998, 37 pp Fossen T and Andersen O.M., 1996 Malonated anthocyanins of garlic Allium sativum L Food chemistry 58(3): 215-217 Hoàng Trọng Chu Nguyễn Mộng Ngọc, 2008 Phân tích liệu nghiên cứu với SPSS Tập NXB Hồng Đức TP HCM, 295 trang Hồ Huy Cường, 2009 Nghiên cứu phục tráng giống tỏi Lý Sơn Đề tài cấp tỉnh Quảng Ngãi Mã số 05/2009/HĐ-ĐTKHCN Jabbes N., Geoffriau E., Le Clerc V., Dridi B., Hannechi C., 2011 Inter simple sequence repeat fingerprints for assess genetic diversity of Tunisian garlic populations.Journal of Agricultural Sciences, Vol 3(4): 77-85 Kim J H., Nam S H., Rico C W., Kang M Y., 2012 A comparative study on the antioxidative and anti-allergic activities of fresh and aged black garlic extracts International Journal of Food Science andTechnology 47(6):1176–1182 Kumar M., 2015 Morphological characterization of garlic (Allium sativum L.) germplasm Journal of Plant Development Sciences 7(5):473-474 Michelmore R W., Paran I., Kesseli, R V., 1991 Identification of markers linked to diseaseresistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations Proceedings of the national academy of sciences, 88(21), 9828-9832 Roldan-Ruiz I, Dendauw J, Vanbockstaele E, Depicker A, De Loose M (2000) AFLP markers reveal high polymorphic rates in ryegrasses (Lolium spp.) Mol Breed 6:125–134 Sharma R., Malik S., Kumar M., Sirohi A., 2018 Assessment of genetic diversity in garlic (Allium sativum L.) genotypes based on ISSR markers Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 7(2), 3119-3124 182 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Wang, H., Li, X., Shen, D., Oiu, Y and Song J., 2014 Diversity evaluation of morphological and allicin garlic (Allium sativum L.) from China Euphytica 198: 243-254 Yeh, F C (1999) POPGENE (version 1.3 1) Microsoft Window-Bases Freeware for Population Genetic Analysis http://www ualberta ca/~ fyeh/ ASSESSMENT OF GENETIC DIVERSITY OF LY SON GARLIC (Allium sativum L.) BY USING ISSR MARKERS Nguyen Minh Ly*, Mai Xuan Cuong, Dinh Thi Thuy Trinh Abstract The study was conducted to assess the genetic diversity of garlic variety (Allium sativum L.) in Ly Son district, Quang Ngai province using ISSR markers Samples of garlic were collected from farming households in An Vinh and An Hai communes According to the results of research, Ly Son garlic has the white shell bulb, the number of cloves ranges from 15 to 23 cloves; the root diameter ranges from 1.1 to 2.0 cm Additionally, there is a difference in the diameter of Ly Son garlic bulb cultivated in different geographical conditions Ten ISSR primers were screened; three primers (UBC808, UBC810, UBC834) detected 15 polymorphic bands A level of polymorphic loci (p) was found in Ly Son populations (75%) Garlic varieties in Ly Son have high genetic diversity among farming households and between different communes Keywords: Allium sativum, garlic, genetic diversity, ISSR, Ly Son University of Science and Education, The University of Danang *Email: nmly@ued.udn.vn ... Đa dạng alen thị ISSR 10 đoạn mồi ISSR sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền tỏi Lý Sơn Trong đó, mồi tạo vạch đa hình rõ ràng ổn định phù hợp cho việc đánh giá tính đa dạng di truyền giống tỏi. .. đánh giá tính đa dạng di truyền nguồn giống tỏi, thị phân tử sử dụng tương đối hiệu quả, đặc biệt thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) Jabbes et al (2011) sử dụng thành công thị ISSR để đánh. .. Nei; I: Chỉ số Shannon; Ne: Số lượng alen hiệu quả; NPL: số lượng locus đa hình; PIC: Chỉ số đa hình di truyền; PPL: tỉ lệ locus đa hình 3.3 Đa dạng di truyền giống tỏi Lý Sơn Từ kết phân tích