MỞ ĐẦU 1. Lý do lựa chọn đề tài Năm 2019, mặt hàng rau quả nước ta tiếp tục đạt kim ngạch xuất khẩu với khoảng 3,74 tỷ USD, tương đương năm 2018, tăng 6,8% so với năm 2017 và 55,8% so với năm 2016 (Tổng cục Hải quan), vượt qua nhiều mặt hàng nông sản vốn là thế mạnh như chè, hạt tiêu, lúa gạo và trở thành một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực. Theo các chuyên gia, nhu cầu thị trường toàn cầu cho rau quả ngày càng tăng và sẽ đạt khoảng 320 tỷ USD vào năm 2020, đây là tiềm năng rất lớn cho phát triển của ngành rau quả Việt Nam. Điều kiện tự nhiên thuận lợi, người dân có trình độ canh tác cao, Việt Nam có nhiều lợi thế để phát triển ngành rau quả. Với diện tích và sản lượng rau quả không ngừng tăng qua các năm, đạt khoảng 1,8 triệu ha và 27 triệu tấn năm 2019, trong đó nhóm cây ăn quả đạt 1049,6 nghìn ha với sản lượng khoảng 10 triệu tấnnăm, tăng 5,7% so với năm 2018 (Tổng cục Thống kê, Hiệp hội rau quả Việt Nam, 2019). Tuy nhiên, do sản lượng lớn, thu hoạch tập trung, thời hạn sử dụng ngắn, tỉ lệ chế biến thấp, trên 90% rau quả được tiêu thụ ở dạng tươi trong khi công nghệ bảo quản hạn chế gây nhiều khó khăn cho người dân, doanh nghiệp trong tiêu thụ các sản phẩm rau quả, tiềm ẩn nguy cơ an toàn thực phẩm. Mặc dù nhiều biện pháp đã được áp dụng, tổn thất sau thu hoạch rau quả ở nước ta vẫn ở mức cao, 2025%. Để khai thác, phát huy tiềm năng và lợi thế của rau quả Việt Nam, ngoài việc triển khai đồng bộ các giải pháp hiện có, cần nghiên cứu ứng dụng các giải pháp công nghệ mới, tiên tiến theo chuỗi giá trị từ sản xuất đến bảo quản chế biến và tiêu thụ sản phẩm. Trong đó, việc nghiên cứu ứng dụng các các công nghệ thân thiện môi trường nhằm nâng cao giá trị, giảm tổn thất sau thu hoạch và tồn dư hóa chất độc hại trên rau quả là thực sự cần thiết. Trên thế giới, để kéo dài thời hạn sử dụng của rau quả, hạn chế tổn thất, nhiều chế phẩm sinh học và hóa học an toàn đã được nghiên cứu. Trong đó, hoạt chất aminoethoxyvinylglycine (AVG) tổng hợp từ xạ khuẩn Streptomyces sp. đã được chứng minh là an toàn và có hiệu quả cao trong kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản nhiều loại quả tươi nhờ khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylenemột phytohormon có hiệu ứng thúc đẩy quá trình chín và hư hỏng của quả trước và sau thu hoạch 30, 149. Trước những hiệu quả và tính an toàn của hoạt chất AVG, hãng Valent BioSciences Corporation (Úc) đã phát triển và sản xuất thành công sản phẩm Retain và được ứng dụng khá phổ biến hiện nay ở nhiều nước phát triển cho trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản nhiều loại quả tươi. Để tăng cường năng lực cung cấp AVG đáp ứng nhu cầu thực tiễn, một số nghiên cứu tổng hợp AVG bằng phương pháp hóa học đã được nghiên cứu. Tuy nhiên, kỹ thuật hiện tại cho thấy có quá nhiều dung môi và hóa chất độc hại phải sử dụng, quy trình tổng hợp và tinh sạch phức tạp, tốn kém cùng với hiệu suất tổng hợp còn quá thấp, 16% 93. Do đó, phương pháp sinh học vẫn là hướng nghiên cứu chính hiện nay được sử dụng để sản xuất AVG. Nhu cầu sản phẩm như Retain hiện tại là không nhỏ không chỉ ở trong nước mà cả trên thế giới, trong khi đó, nước ta có khí hậu nhiệt đới với nguồn giống vi sinh vật rất phong phú và đa dạng, rất thuận lợi cho nghiên cứu, sản xuất các sản phẩm chứa hoạt chất sinh học như AVG. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn cùng tiềm năng của Việt Nam, trên cơ sở kế thừa và phát triển hướng nghiên cứu sinh học, tôi thực hiện đề tài nghiên cứu sinh: Nghiên cứu tạo chế phẩm Aminoethoxyvinylglycine từ Streptomyces spp. có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hoãn quá trình chín quả giai đoạn cận và sau thu hoạch. 2. Mục đích của đề tài Phân lập, tuyển chọn được chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. có khả năng sinh tổng hợp AVG từ đất trồng cây ăn quả của Việt Nam và xây dựng được quy trình tạo chế phẩm AVG có độ tinh khiết cao, đạt chỉ tiêu an toàn thực phẩm. Đánh giá được khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG tạo ra, có hiệu quả trong kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) và kéo dài thời gian thu hoạch, bảo quản chuối tiêu hồng (Musa Cavendish). 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Chủng Streptomyces sp. có khả năng sinh tổng hợp AVG trong đất trồng cây ăn quả của Việt Nam. Quy trình phân lập, tuyển chọn, nuôi cấy, lên men, thu hồi và tạo chế phẩm AVG. Đánh giá khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG tạo được trong kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) và kéo dài thời gian thu hoạch, bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish). 4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH .x MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ tươi .5 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Ở Việt Nam 1.2 Đặc điểm trình sinh trưởng, phát triển, lão hóa trước sau thu hoạch 1.3 Tác động ethylene nội sinh đến trình sinh trưởng, phát triển lão hóa 1.4 Các nghiên cứu ức chế hoạt động ethylene nội sinh trước sau thu hoạch 13 1.4.1 Ức chế sinh tổng hợp 13 1.4.2 Kìm hãm thụ thể nhận biết ethylene 15 1.4.3 Loại bỏ ethylene 15 1.5 Hoạt chất AVG 18 1.5.1 Cấu tạo phân tử AVG 19 1.5.2 Tính chất hóa lý AVG 19 1.5.3 Cơ chế kìm hãm sinh tổng hợp ethylene AVG 19 1.6 Công nghệ sản xuất chế phẩm chứa hoạt chất AVG .21 1.6.1 Sản xuất AVG xạ khuẩn Streptomyces 21 1.6.2 Sản xuất AVG tổng hợp hóa học 29 1.6.3 Kỹ thuật tạo sản phẩm điều hòa sinh trưởng 30 ii 1.7 Các cơng trình nghiên cứu ứng dụng hoạt chất AVG 31 1.7.1 Giai đoạn trước thu hoạch 31 1.7.2 Giai đoạn sau thu hoạch .32 1.8 Những ý kiến rút từ tổng quan 34 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Vật liệu nghiên cứu 35 2.1.1 Vật liệu 35 2.1.2 Mơi trường, hóa chất 35 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 36 2.2 Phương pháp nghiên cứu 36 2.2.1 Các phương pháp nghiên cứu chung 36 2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu theo nội dung 37 2.2.3 Các phương pháp xử lý số liệu 53 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn Streptomyces sp có khả sinh tổng hợp hoạt chất AVG .54 3.1.1 Kết phân lập chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp AVG 54 3.1.2 Đặc điểm hình thái chủng S6 .57 3.1.2 Định tên chủng S6 .58 3.2 Ảnh hưởng điều kiện lên men đến sinh trưởng sinh tổng hợp hoạt chất AVG chủng S6 60 3.2.1 Ảnh hưởng nguồn carbon 60 3.2.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 61 3.2.3 Ảnh hưởng nguyên tố vi lượng .62 3.2.4 Ảnh hưởng nguyên tố đa lượng .63 3.2.5 Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống .64 3.2.6 Ảnh hưởng nhiệt độ .66 3.2.7 Ảnh hưởng độ oxy hòa tan (DO) 67 3.2.8 Ảnh hưởng pH môi trường 68 iii 3.2.9 Động học sinh trưởng sinh tổng hợp AVG chủng S6 .69 3.2.10 Tối ưu hóa số thơng số kỹ thuật cho lên men sinh tổng hợp AVG chủng S6 71 3.3 Làm sạch, thu hồi tạo chế phẩm AVG .77 3.3.1 Làm dịch chứa AVG li tâm 77 3.3.2 Làm dịch chứa AVG sau li tâm trao đổi ion 78 3.3.3 Cô đặc dịch sau làm trao đổi ion 86 3.3.4 Thực nghiệm lên men, làm cô đặc dịch chứa AVG quy mô lên men 100 lít/mẻ 88 3.3.5 Tạo chế phẩm AVG .90 3.3.6 Chất lượng chế phẩm AVG 93 3.3.7 Quy trình tạo chế phẩm AVG 98 3.4 Khả ứng dụng chế phẩm AVG 100 3.4.1 Khả ứng dụng chế phẩm AVG trì hỗn chín, kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) 100 3.4.2 Khả ứng dụng chế phẩm AVG trì hỗn chín, kéo dài thời gian thu hoạch bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish) 106 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .115 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO 118 PHỤ LỤC 138 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ACC ACO ACS AOAC 1-aminocyclopropane-1-carboxylic axit 1-aminocyclopropane-1-Carboxylic axit oxidase Aminocyclopropane-1-cacboxylic axit synthase Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội nhà hố AVG Bộ phân tích thống) aminoethoxyvinylglycine Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn NN&PTNT CV DTT ĐVTN EDTA EIN ERS ETR g, mg, kg GDP h HEPES HPLC l, ml, μll LD50 LeETR LSD M MES MOPS nmol o C OECD Coefficient of variation (hệ số biến động) DL-dithiothreitol Động vật thí nghiệm Ethylene diamine tetraacetic axit Ethylene insensitive (thụ thể chống nhạy cảm ethylene) Ethylene response sensor (thụ thể cảm biến phản ứng ethylene) Ethylene response (thụ thể phản ứng ethylene) Gram (gam), miligram, kilogram Gross domestic product (tổng sản phẩm quốc nội) Hour (giờ) 4-2-hydroxyetyl-1-piperazine etan sulfonic axit High performance liquid chromatography Litre (lít), mililitre, microlitre Lethal dose, 50% (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) Ethylene receptor family from tomato (họ thụ thể ethylene cà chua) Least significant difference (khác biệt nhỏ có ý nghĩa) Mole (nồng độ dung dịch, mol/lít) 2-(N-morpholino) etan sulfonic axit 3-(N-morpholino) propan sulfonic axit Nanomole (10−9 moles, phần tỷ mol) Độ Celsius (độ C) Organisation for economic co-operation and development (Tổ o F ppm sp SPE spp TAPS chức hợp tác phát triển Kinh tế) Độ Fahrenheit (độ F) Parts per million (một phần triệu) Species (một loài, chủng thuộc chi) Solid-phase extraction (chiết pha rắn) Several species (một số loài thuộc chi) 3-{[tri (hidroxymetyl) methyl] amino}propan sulfonic axit v TCVN TSS USD UV VSTP Tiêu chuẩn Việt Nam Total soluble solids (chất khơ hịa tan tổng số) United States Dollar (đơ la Mỹ) Ultra violet (tia cực tím) Vệ sinh thực phẩm vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu hình 1.1 1.2 1.3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 3.18 Tên hình Chu trình Yang Sơ đồ nguyên lý sinh tổng hợp truyền tín hiệu ethylene Cơ chế ức chế hoạt động enzyme ACS nhờ phản ứng tạo phức ketimine ACS-AVG Khả ức chế xạ khuẩn S cellulosae VTCC 41913 dịch lên men chủng S6 Khả sinh tổng hợp AVG chủng xạ khuẩn phân lập môi trường Gause II Sắc ký đồ AVG chuẩn (Sigma)-HPLC, C18 Sắc ký đồ AVG sinh tổng hợp từ chủng S6-HPLC, C18 Ảnh khuẩn lạc bào tử chủng S6 Kết nhân đoạn gen 16S rARN chủng S6 Vị trí phân loại chủng S6 lồi có họ hàng gần Ảnh hưởng nguồn carbon đến sinh tổng hợp AVG chủng S6 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh tổng hợp AVG chủng S6 Ảnh hưởng số nguyên tố khoáng đến khả sinh tổng hợp AVG chủng S6 Ảnh hưởng số nguyên tố đa lượng đến sinh tổng hợp AVG chủng S6 Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống đến sinh trưởng sinh tổng hợp AVG chủng S6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng sinh tổng hợp AVG chủng S6 Ảnh hưởng độ oxy hòa tan đến sinh trưởng sinh tổng hợp AVG chủng S6 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng sinh tổng hợp AVG chủng S6 Động học sinh trưởng sinh tổng hợp AVG chủng S6 Điểm tối ưu hàm lượng AVG chủng S6 theo mơ hình Sinh khối chủng S6 trước (CT1) sau tối ưu (CT2) Tran g 10 55 55 56 56 57 viii 3.19 3.20 3.21 3.22 3.23 3.24 3.25 Bề mặt đáp ứng thể ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng AVG Dịch tháo sau cột điều kiện pH dịch lên men khác Sắc ký đồ chuẩn AVG 100ppm, cột Amino_axit_Xbrige Sắc ký đồ dịch lên men sau li tâm, cột Amino_axit_Xbrige Sắc ký đồ dịch lên men sau trao đổi ion lần 1, cột Amino_axit_Xbrige Sắc ký đồ dịch lên men sau trao đổi ion lần 2, cột Amino_axit_Xbrige Ảnh hưởng chế phẩm AVG đến sinh tổng hợp ethylene 3.26 3.27 3.28 3.29 3.30 chuối 20oC Độ chín chuối tiêu hồng theo thời gian Sơ đồ quy trình tạo chế phẩm AVG dạng bột Khả kéo dài thời gian thu hoạch chuối Biến đổi độ tròn mẫu chuối theo thời gian Biến đổi độ cứng mẫu chuối theo thời gian 3.31 Thay đổi tỉ lệ bột/vỏ chuối theo thời gian 3.32 3.33 3.34 3.35 3.36 Biến đổi hàm lượng TSS chuối theo thời gian Tốc độ chín chuối 13±0,5oC Hơ hấp chuối q trình bảo quản Sản xuất ethylene chuối trình bảo quản Biến đổi độ cứng chuối trình bảo quản 81 85 86 86 96 97 98 106 107 108 109 111 111 112 113 MỞ ĐẦU Lý lựa chọn đề tài Năm 2019, mặt hàng rau nước ta tiếp tục đạt kim ngạch xuất với khoảng 3,74 tỷ USD, tương đương năm 2018, tăng 6,8% so với năm 2017 55,8% so với năm 2016 (Tổng cục Hải quan), vượt qua nhiều mặt hàng nông sản vốn mạnh chè, hạt tiêu, lúa gạo trở thành mặt hàng xuất chủ lực Theo chuyên gia, nhu cầu thị trường toàn cầu cho rau ngày tăng đạt khoảng 320 tỷ USD vào năm 2020, tiềm lớn cho phát triển ngành rau Việt Nam Điều kiện tự nhiên thuận lợi, người dân có trình độ canh tác cao, Việt Nam có nhiều lợi để phát triển ngành rau Với diện tích sản lượng rau không ngừng tăng qua năm, đạt khoảng 1,8 triệu 27 triệu năm 2019, nhóm ăn đạt 1049,6 nghìn với sản lượng khoảng 10 triệu tấn/năm, tăng 5,7% so với năm 2018 (Tổng cục Thống kê, Hiệp hội rau Việt Nam, 2019) Tuy nhiên, sản lượng lớn, thu hoạch tập trung, thời hạn sử dụng ngắn, tỉ lệ chế biến thấp, 90% rau tiêu thụ dạng tươi công nghệ bảo quản hạn chế gây nhiều khó khăn cho người dân, doanh nghiệp tiêu thụ sản phẩm rau quả, tiềm ẩn nguy an toàn thực phẩm Mặc dù nhiều biện pháp áp dụng, tổn thất sau thu hoạch rau nước ta mức cao, 20-25% Để khai thác, phát huy tiềm lợi rau Việt Nam, việc triển khai đồng giải pháp có, cần nghiên cứu ứng dụng giải pháp công nghệ mới, tiên tiến theo chuỗi giá trị từ sản xuất đến bảo quản chế biến tiêu thụ sản phẩm Trong đó, việc nghiên cứu ứng dụng các công nghệ thân thiện môi trường nhằm nâng cao giá trị, giảm tổn thất sau thu hoạch tồn dư hóa chất độc hại rau thực cần thiết Trên giới, để kéo dài thời hạn sử dụng rau quả, hạn chế tổn thất, nhiều chế phẩm sinh học hóa học an tồn nghiên cứu Trong đó, hoạt chất aminoethoxyvinylglycine (AVG) tổng hợp từ xạ khuẩn Streptomyces sp chứng minh an tồn có hiệu cao kéo dài thời gian thu hoạch bảo quản nhiều loại tươi nhờ khả ức chế sinh tổng hợp ethylene-một phytohormon có hiệu ứng thúc đẩy q trình chín hư hỏng trước sau thu hoạch [30], [149] Trước hiệu tính an tồn hoạt chất AVG, hãng Valent BioSciences Corporation (Úc) phát triển sản xuất thành công sản phẩm Retain ứng dụng phổ biến nhiều nước phát triển cho trì hỗn chín, kéo dài thời gian thu hoạch bảo quản nhiều loại tươi Để tăng cường lực cung cấp AVG đáp ứng nhu cầu thực tiễn, số nghiên cứu tổng hợp AVG phương pháp hóa học nghiên cứu Tuy nhiên, kỹ thuật cho thấy có q nhiều dung mơi hóa chất độc hại phải sử dụng, quy trình tổng hợp tinh phức tạp, tốn với hiệu suất tổng hợp thấp, 1-6% [93] Do đó, phương pháp sinh học hướng nghiên cứu sử dụng để sản xuất AVG Nhu cầu sản phẩm Retain không nhỏ không nước mà giới, đó, nước ta có khí hậu nhiệt đới với nguồn giống vi sinh vật phong phú đa dạng, thuận lợi cho nghiên cứu, sản xuất sản phẩm chứa hoạt chất sinh học AVG Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn tiềm Việt Nam, sở kế thừa phát triển hướng nghiên cứu sinh học, thực đề tài nghiên cứu sinh: "Nghiên cứu tạo chế phẩm Aminoethoxyvinylglycine từ Streptomyces spp có khả ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hỗn q trình chín giai đoạn cận sau thu hoạch" Mục đích đề tài Phân lập, tuyển chọn chủng xạ khuẩn Streptomyces sp có khả sinh tổng hợp AVG từ đất trồng ăn Việt Nam xây dựng quy trình tạo chế phẩm AVG có độ tinh khiết cao, đạt tiêu an toàn thực phẩm Đánh giá khả ứng dụng chế phẩm AVG tạo ra, có hiệu kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) kéo dài thời gian thu hoạch, bảo quản chuối tiêu hồng (Musa Cavendish) Đối tượng phạm vi nghiên cứu Chủng Streptomyces sp có khả sinh tổng hợp AVG đất trồng ăn Việt Nam Quy trình phân lập, tuyển chọn, nuôi cấy, lên men, thu hồi ... cứu sinh học, thực đề tài nghiên cứu sinh: "Nghiên cứu tạo chế phẩm Aminoethoxyvinylglycine từ Streptomyces spp có khả ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hỗn q trình chín giai đoạn cận sau thu... khuẩn Streptomyces sp có khả sinh tổng hợp AVG từ đất trồng ăn Việt Nam xây dựng quy trình tạo chế phẩm AVG có độ tinh khiết cao, đạt tiêu an toàn thực phẩm Đánh giá khả ứng dụng chế phẩm AVG tạo. .. thúc, lượng ethylene tạo giảm dần làm chậm q trình lão hóa quan sát q trình chín cà chua [172] Theo Barry cộng (2007) [36], ethylene đóng vai trị điều tiết q trình chín có tương tác phức tạp với