Nghiên cứu đánh dấu kháng thể đơn dòng bevacizumab với đồng vị phóng xạ tc 99m dùng trong chụp hình các khối ung thư

Tuyển tập báo cáo Hội nghị Khoa học và Công nghệ hạt nhân toàn quốc lần thứ 14 Proceedings of Vietnam conference on nuclear science and technology VINANST 14 325 NGHIÊN CỨU ĐÁNH DẤU KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG[.]

Tuyển tập báo cáo Hội nghị Khoa học Công nghệ hạt nhân toàn quốc lần thứ 14 Proceedings of Vietnam conference on nuclear science and technology VINANST-14 NGHIÊN CỨU ĐÁNH DẤU KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG BEVACIZUMAB VỚI ĐỒNG VỊ PHĨNG XẠ Tc-99m DÙNG TRONG CHỤP HÌNH CÁC KHỐI UNG THƯ STUDY ON LABELLING OF BEVACIZUMAB ANTIBODY WITH 99MTC FOR THE RADIOIMMUNOSCINTIGRAPHY OF CANCERS GIANG NGUYEN THI KHANH, THU NGUYEN THI, NGOC NGUYEN THI, CUONG BUI VAN, BINH NGUYEN THANH, QUANG DANG HO HONG, NHAN NGUYEN THANH Nuclear Research of Institute, 01 Nguyen Tu Luc Street, district, Da Lat City Email: khanhgiang55@yahoo.com Tóm tắt: Báo cáo mơ tả quy trình đánh dấu đồng vị phóng xạ với kháng thể đơn dịng bevacizumab để điều chế dược chất phóng xạ 99mTc-bevacizumab sử dụng chụp xạ hình khối ung thư Bevacizumab kháng thể đơn dịng nhân hóa tái tổ hợp kháng yếu tố tăng sinh mạch (VEGF) nhờ có tác dụng việc ngăn chặn q trình tăng sinh mạch Kháng thể bevacizumab gắn với đồng vị phóng xạ 99mTc phương pháp đánh dấu trực tiếp dùng thiếc (II) clorua làm chất khử Các khảo sát tối ưu hóa tiến hành pH, nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ chất tham gia phản ứng Phức miễn dịch phóng xạ kiểm tra hiệu suất đánh dấu, độ tinh khiết hố phóng xạ, độ ổn định Kết cho thấy hiệu suất đánh dấu điều chế 99mTc-bevacizumab đạt 95%, độ tinh khiết hóa phóng xạ 98% Thuốc đạt tiêu độ ổn định 24 nghiên cứu Phức hợp 99mTc-bevacizumab bước đầu đạt yêu cầu dược chất phóng xạ dùng cho nghiên cứu tiền lâm sàng Từ khố: Kháng thể đơn dịng bevacizumab, đồng vị phóng xạ Tc-99m, chụp hình miễn dịch phóng xạ Abstract: This paper describes a method for the radiolabeling of monoclonal antibody bevacizumab in the production of 99mTc-bevacizumab radiopharmaceutical addresses in the radioimmunoscintigraphy of cancer Bevacizumab is a humanized monoclonal and recombinant antibody that is an anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) and is effective in block the angiogenesis Bevacizumab was labeled with radioisotope 99mTc by direct method using stannous chloride as reductant The labeling optimization was conducted such as pH, temperature, time, molar ratio The radioimmunoconjugates were tested for radiolabeling yield, radiochemical purity and stability The results of the study showed that radiolabeling yields were more than 95%, radiochemical purity reached 98% and stability for 24 hours The conjugation of 99mTc-bevacizumab met the required criteria of radiopharmaceutical for continuing preclinical evaluations Keywords: Monoclonal antibody bevacizumab, radioisotope 99mTc, radioimmunoscintigraphy MỞ ĐẦU Sự tăng sinh mạch trình tạo mạch từ mạch có trước đó, chế đảm bảo cho tồn tại, phát triển làm lành vết thương, nhiên trường hợp bất thường, tăng sinh mạch lại yếu tố có liên quan đến loạt rối loạn bao gồm viêm, ung thư Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) nghiên cứu rộng rãi họ liên quan tới trình tăng sinh mạch Đây xem mục tiêu quan trọng nghiên cứu thuốc điều trị ung thư [1, 2] Kháng thể đơn dòng bevacizumab số thuốc kháng thể FDA cấp phép sớm cho sử dụng điều trị ung thư chế gắn với yếu tố tăng sinh mạch, ức chế di khối u [3] Bevacizumab kháng thể tái tổ hợp người (đuôi -umab) sản xuất dựa công nghệ DNA sử dụng dòng tế bào CHO, bao gồm 214 amino acid trọng lượng phân tử khoảng 149.000 dalton Ngoài việc sử dụng điều trị điều trị bệnh ung thư ung thư đại tràng, ung thư phổi, u nguyên bào thần kinh ung thư biểu mơ tế bào thận, bevacizumab cịn ứng dụng nhiều nghiên cứu y, sinh học, trội nghiên cứu đánh dấu với đồng vị phóng xạ Tc-99m để chụp hình miễn dịch phóng xạ chẩn đốn khối ung thư có biểu yếu tố VEGF [1, 3] 99mTc đồng vị phóng xạ với nhiều yếu tố ưu việt sử dụng nhiều năm khoa y học hạt nhân phát xạ tia gama có lượng 140 keV chu kỳ bán rã 6,01 giờ, thích hợp để xạ hình chẩn đốn [4] Do vậy, nghiên cứu điều chế dược chất phóng xạ bevacizumab đánh dấu 99mTc hướng có tiềm sử dụng để chẩn đoán sớm ung thư đặc kỹ thuật ghi hình miễn dịch phóng xạ thơng qua chụp xạ hình SPECT NỘI DUNG 2.1 Đối tượng phương pháp a/ Đối tượng nghiên cứu 325 Tiểu ban D1: Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân y tế Section D1: Application of nuclear techniques in healthcare Kháng thể đơn dòng bevacizumab (rhuMAb- VEGF, Avastin, Genen-tech, San Franciso, Calif., USA) nồng độ 25 mg/ml Đồng vị phóng xạ 99mTc chiết tách từ máy phát 99Mo/99mTc, dạng Na99mTcO4-, nồng độ phóng xạ 150-200 mCi/ml, Polatom Giấy sắc ký mỏng TLC-SG silicaL gel 60 F254 25x25 Các hoá chất SnCl2.2H2O, NaH2PO4.2H2O, Na2HPO4.H2O hãng Merck Thiết bị sử dụng máy phóng xạ tự chụp Cyclone PlusPhosphor Scanner, B431200, PerkinElmer, máy quét phóng xạ Bioscan b/ Phương pháp nghiên cứu Phương pháp đánh dấu kháng thể bevacizumab với đồng vị phóng xạ 99mTc: Kháng thể đánh dấu với 99mTc phương pháp đánh dấu trực tiếp dùng thiếc (Sn, II) clorua làm chất khử, khử cầu disulfide (S-S) phân tử kháng thể dạng sulfhidryl (SH), để dễ dàng tạo phức với 99mTc môi trường đệm phosphat 0,5M, pH 7,4 [5] Để tối ưu hố qui trình đánh dấu, nghiên cứu khảo sát tiến hành bao gồm: Khảo sát hàm lượng clorua thiếc:Cho vào ống đánh dấu 100 g kháng thể bevacizumab, hoạt độ Tc mCi, pH 7, thời gian đánh dấu 15 phút, riêng hàm lượng clorua thiếc thay đổi từ 11, 10, 20, 30, 40 50 g Dung dịch phản ứng phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) 99m Hàm lượng kháng thể bevacizumab: Cố định hàm lượng clorua thiếc 40 g, hoạt độ 99mTc mCi, pH 7, thời gian đánh dấu 15 phút, riêng hàm lượng kháng thể thay đổi từ 1, 10, 100, 400, 600 1000 g Dung dịch phản ứng phân tích TLC Hoạt độ phóng xạ 99mTc: Cho vào ống đánh dấu 100 g kháng thể bevacizumab, 40 g thiếc (II) clorua, thay đổi hoạt độ phóng xạ khác ống, từ 0,2 mCi, mCi, mCi, 10 mCi, 20 mCi, 40 mCi Phức đánh dấu để yên 15 phút nhiệt độ phòng [6] Phân tích mẫu TLC Khảo sát pH: Cố định ống phản ứng gồm kháng thể 100 g, hoạt độ 99mTc mCi, 40 mg thiếc clorua Thay đổi pH ống đánh dấu 3, 4, 5, 6, Phản ứng đánh dấu 15 phút nhiệt độ phòng Phương pháp kiểm tra chất lượng bao gồm: Độ tinh khiết hóa phóng xạ: Kiểm tra phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC, kích thước x 10 cm Sau đánh dấu tạo phức, dùng pipet tự động hút ml mẫu chấm vị trí cm băng sắc ký, triển khai sắc ký dung môi acetone, thời gian sắc ký 15 phút, lấy để khơ tiến hành đo đếm máy phóng xạ tự chụp Cyclone, tính kết phần mềm OptiQuant 5.0 Độ bền 99mTc-bevacizumab theo thời gian: Mẫu 99mTc-bevacizumab sau đánh dấu bảo quản loại dung dịch đệm phosphat 0,5 M, pH 7,4 có thêm acid ascorbic albumin, đệm acetate 0,5 M, pH 6, NaCl 0,9% Sau khoảng thời gian 1, 3, 6, 24 giờ, 99mTc-bevacizumab phân tích TLC, triển khai dung môi aceton Thống kê hiệu suất đánh dấu điều chế 99mTc-bevacizumab tiến hành 10 mẻ nghiên cứu Xử lý số liệu: Các số liệu phân tích dùng phần mềm Prism 8.4.3 tính độ tinh khiết hóa phóng xạ phần mềm OptiQuant 5,0 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p < 0,05 2.2 Kết a/ Kết khảo sát hàm lượng chất tham gia phản ứng Thiếc (II) clorua: Để đánh dấu kháng thể bevacizumab với đồng vị phóng xạ dùng làm chất khử 99m Tc, thiếc (II) clorua Đồ thị cho thấy với hàm lượng clorua thiếc 10 g trở lên, hiệu suất đánh dấu đạt 91%, hiệu suất đánh dấu đạt cao 99% hàm lượng clorua thiếc đạt 40 g (Hình 1) Hàm lượng kháng thể bevacizumab: Hàm lượng kháng thể đổi từ 1, 10, 100, 400, 600 1000 g Dung dịch phản ứng phân tích phương pháp sắc ký TLC Hiệu suất đánh dấu tương ứng 97,95; 97,65; 98,90; 98,10; 97,75 96,80 % 326 Tuyển tập báo cáo Hội nghị Khoa học Công nghệ hạt nhân toàn quốc lần thứ 14 Proceedings of Vietnam conference on nuclear science and technology VINANST-14 Hiệu suất đánh dấu (%) 120 100 91.45 96.5 97.15 99.1 98.75 10 20 30 40 50 80 67.05 60 40 20 0 60 Hàm lượng clorua thiếc (g) Hình Khảo sát hàm lượng clorua thiếc Hoạt độ phóng xạ 99mTc: Với hoạt độ phóng xạ từ 0,2 mCi, mCi, mCi, 10 mCi, 20 mCi, 40 mCi Phức đánh dấu thời gian 15 phút nhiệt độ phòng Hiệu suất đánh dấu tương ứng 86,80; 99,15; 98,75; 98,60; 98,90 99,05 % Kết khảo sát hàm lượng kháng thể bevacizumab tham gia phản ứng đánh dấu với đồng vị phóng xạ 99mTc cho thấy hiệu suất đánh dấu đạt 95% với hàm lượng kháng thể từ g đến 1000 g Hoạt độ phóng xạ 99mTc từ mCi trở lên tham gia phản ứng đánh dấu 100 g kháng thể cho hiệu suất đạt 98% Trong miền < 1mCi, hiệu suất gắn đạt 86,8% b/ Kết khảo sát pH đánh dấu kháng thể Hiệu suất đánh dấu (%) Sau trình khảo sát, kết ảnh hưởng pH lên hiệu suất đánh dấu cho thấy pH từ 3-7 cho hiệu suất đánh dấu cao, >98% (Hình 2) Khi pH= hiệu suất đánh dấu giảm 94,55% 110 99.10 99.40 99.50 99.70 99.85 94.55 90 70 50 30 10 Giá trị pH Hình Đồ thị khảo sát pH đánh dấu c/ Kết khảo sát thời gian nhiệt độ phản ứng Thời gian phản ứng từ phút trở đi, 99mTc-bevacizumab tạo thành với hiệu suất đạt 98 % nhiệt độ ủ 40C, 240C 370C (Hình 3) Đồ thị cho thấy phản ứng đánh dấu kháng thể với 99mTc khảo sát 0C, 24 0C 37 0C cho thấy phức phóng xạ đạt hiệu suất cao dù thực đánh dấu nhiệt độ khác nhau, hiệu suất gắn trì mức 98% Thời gian tối ưu để phản ứng đạt hiệu suất cao 98% khoảng đến 20 phút 327 Độ tinh khiết hóa phóng xạ (%) Tiểu ban D1: Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân y tế Section D1: Application of nuclear techniques in healthcare 100 80 0C 60 24 0C 40 37 0C 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Hình Kết khảo sát thời gian nhiệt độ phản ứng d/ Kết kiểm tra chất lượng - Độ tinh khiết hóa phóng xạ: Kiểm tra phương pháp sắc ký lớp mỏng tính tốn cho thấy phức 99mTc-bevacizumab nằm gốc Rf = 0,1, 99mTctự ngọn, Rf = 0,9 (Hình 4) Hình Độ tinh khiết hố phóng xạ 99mTc-bevacizumab, TLC 10 x 100 mm, dung mơi aceton, chụp băng sắc ký máy phóng xạ tự chụp Cyclone Độ tinh khiết hóa phóng xạ 99mTc-bevacizumab đạt 98 % - Độ bền 99mTc-bevacizumab theo thời gian: Kết phân tích cho thấy dung dịch sản phẩm ổn định đệm phosphat chứa thêm acid ascorbic albumin (Hình 5) Phức bền mơi trường trung tính có thêm chất chống thủy phân acid ascorbic Lặp lại qui trình đánh dấu 10 mẻ nghiên cứu, hiệu suất đánh dấu trung bình điều chế 99mTcbevacizumab 98,96 ± 0,49% (n = 10) Do đó, q trình đánh dấu khơng cần thiết phải tinh qua cột sắc ký lọc gel thường thấy dùng chất khử 2-mercapto ethanol dithiothreitol dùng phương pháp đánh dấu gián tiếp với chất tạo phức trung gian MAG3 [3, 6] Bảng Hiệu suất đánh dấu điều chế 99mTc-bevacizumab (n=10) Số lần Hiệu suất (%) 10 Trung bình 98,15 99,10 98,78 99,35 99,52 99,50 98,88 99,26 98,19 99,00 98,96 ± 0,49 328 Độ tinh khiết hóa phóng xạ (%) Tuyển tập báo cáo Hội nghị Khoa học Cơng nghệ hạt nhân tồn quốc lần thứ 14 Proceedings of Vietnam conference on nuclear science and technology VINANST-14 120 Acid ascorbic 100 Albumin 80 NaCl 0,9% 60 Acetate 0,5 M 40 20 0 12 15 18 21 24 Thời gian (giờ) Hình Theo dõi độ ổn định phức 99mTc-bevacizumab theo thời gian 2.3 Bàn luận Nghiên cứu đánh dấu kháng thể đơn dịngbevacizumab với đồng vị phóng xạ Tc-99m tiến hành khảo sát điều kiện tối ưu để hồn thiện quy trình đánh dấu Các kết nghiên cứu cho thấy rằng, hiệu suất đánh dấu đạt cao > 95 %, chí với hàm lượng ion thiếc < 20 g, pH từ pH = đến pH = 7, thời gian từ phút đánh dấu trở hàm lượng kháng thể từ g, chứng tỏ trình tạo phức đồng vị phóng xạ 99mTc với kháng thể dễ dàng xảy Quy trình đánh dấu mCi 99mTc tương đương 0,945 ng (0,0095 nmol/L) 100 g kháng thể tương đương 0,66 nmol/L Tỷ lệ mol Tc-99m kháng thể 0,0143 Hiệu suất đánh dấu đạt 98%, số nhóm gắn 99mTc phân tử kháng thể 0,014, tỷ lệ thích hợp hợp chất đánh dấu dùng chụp hình chẩn đoán [4].Phức 99mTcbevacizumab gắn đạt hiệu suất cao miền pH trung tính khả ổn định gốc –SH rõ Thời gian đánh dấu nhanh khoảng đến 20 phút, thời gian khơng đủ cho phản ứng xảy hồn tồn Thời gian lâu phân tử oxy hóa làm thay đổi nhẹ hoạt tính kháng thể làm hỏng số cấu trúc kháng thể, nên thời gian thích hợp phản ứng đánh dấu với kháng thể 15 phút Sau đánh dấu, sản phẩm ổn định đệm phosphat chứa thêm acid ascorbic sau 24 độ tinh khiết hoá phóng xạ đạt 98% (Hình 6) Lựa chọn chất khử dùng nghiên cứu đánh dấu ion thiếc dựa nhiều nghiên cứu trước đây, liên kết disulphite (S-S) khử thành nhóm thiol (-SH) đánh dấu dễ dàng với đồng vị phóng xạ 99mTc, thuốc phóng xạ đánh dấu với 99mTc thương mại sử dụng an toàn lâm sàng [4] So sánh với nghiên cứu tương tự Faiza cộng gần đây, gắn bevacizumab qua phối tử p‑SCN‑Bz-TCMC [1] Camacho cộng với 99mTc(CO)3bevacizumab 99mTc-HYNIC- bevacizumab tạo sản phẩm có độ tinh khiết hóa phóng xạ cao bền nước nuối sinh lý đệm phosphat đến sau đánh dấu [6,7] KẾT LUẬN Kháng thể bevacizumab đánh dấu với đồng vị phóng xạ 99mTc Viện Nghiên cứu hạt nhân đạt hiệu suất cao, đạt tiêu độ tinh khiết hóa phóng xạ độ ổn định theo yêu cầu dược chất phóng xạ dùng chụp hình chẩn đốn khối ung thư Kỹ thuật đánh dấu kháng thể với đồng vị phóng xạ 99mTc, 111In, 124I, 18F dùng chụp hình chẩn đốn phát triển sử dụng lâm sàng để chụp hình ung thư ung thư trực tràng (satumomab pendetic, arcitumomab), ung thư tuyến tiền liệt (capromab pendetide), u lympho không Hodgkin, ung thư gan, nhồi máu tim (imciromab penlefate) nhiễm trùng viêm (sulesomab, fanolesomab) [5] ứng dụng ba thập kỉ qua Nghiên cứu đánh dấu Tc-99m với kháng thể bevacizumab bước đầu đạt kết tối ưu qui trình đánh dấu Để sử dụng 99mTc-bevacizumab lâm sàng, cần có nghiên cứu sâu đánh giá tiền lâm sàng hoạt tính miễn dịch, phân bố động vật, đánh giá liều lượng hiệu chụp hình phóng xạ miễn dịch 329 Tiểu ban D1: Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân y tế Section D1: Application of nuclear techniques in healthcare TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bibi Faiza, Syed Qaiser Shah, “Synthesis of 99mTc‑p‑SCN‑Bzl‑TCMC‑bevacizumab for vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor imaging using ovarian cancer model”, J Radioanal and Nucl Chem, 2020 [2] Katarzyna Masłowska, Paweł Krzysztof Halik, Dagmara Tymecka, Aleksandra Misicka and Ewa Gniazdowska, “The Role of VEGF Receptors as Molecular Target in Nuclear Medicine for Cancer Diagnosis and Combination Therapy”, Cancers (Basel) 13(5),1072, 2021 [3] Rahmathulla G, Hovey EJ, Hashemi-Sadraei N, Ahluwalia MS, “Bevacizumab in high-grade gliomas: a review of its uses, toxicity assessment, and future treatment challenges”, Onco Targets Ther 6, 371–389, 2013 [4] Muhammad U A., Muhammad R.A., Aqeela S., Sajid M 2016 “A review on evaluation of technetium-99m labeled radiopharmaceuticals” JRadioanal and Nucl Chem, 310(2), 2016 [5] David M G., Robert M S., Jacques B., Jean F C., “Radioactive Antibodies: Selective Targeting and Treatment of Cancer and other Diseases”, Appl Rad, 6(4),10-29, 2007 [6] Camacho X., García M.F., Calzada V., Fernández M., Chabalgoity J.A., Moreno M., de Aguiar R.B., Alonso O., Gambini J.P., Chammas R., et al., “[99mTc(CO)3]-Radiolabeled Bevacizumab: In vitro and in vivo Evaluation in a Melanoma Model”, Oncology, 84:200–209, 2013 [7] Hui Tan, Jun Zhou, Xiangdong Yang, Dengfeng Cheng et al., “ 99mTc-labeled bevacizumab for detecting atherosclerotic plaque linked to plaque neovascularization and monitoring antiangiogenic effects of atorvastatin treatment in ApoE−/− mic”, Sci Rep, 7, 3504, 2017 330 ... máy quét phóng xạ Bioscan b/ Phương pháp nghiên cứu Phương pháp đánh dấu kháng thể bevacizumab với đồng vị phóng xạ 99mTc: Kháng thể đánh dấu với 99mTc phương pháp đánh dấu trực tiếp dùng thiếc... khiết hóa phóng xạ độ ổn định theo yêu cầu dược chất phóng xạ dùng chụp hình chẩn đoán khối ung thư Kỹ thuật đánh dấu kháng thể với đồng vị phóng xạ 99mTc, 111In, 124I, 18F dùng chụp hình chẩn... lượng kháng thể bevacizumab tham gia phản ứng đánh dấu với đồng vị phóng xạ 99mTc cho thấy hiệu suất đánh dấu đạt 95% với hàm lượng kháng thể từ g đến 1000 g Hoạt độ phóng xạ 99mTc từ mCi trở