Bài giảng kĩ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng – ths lê thị hạnh

Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên – ĐHQG.TP.HCM Viện Tế Bào Gốc KĨ THUẬT SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG Ths Lê Thị Hạnh hanhle@sci.edu.vn 11/2018 Nội dung u Giới thiệu u Các bước tạo kháng thể đơn dòng u Ứng dụng hanhle@sci.edu.vn Kháng nguyên-kháng thể u Kháng nguyên (antigen – Ag): chất phản ứng với sản phẩm đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Bản chất protein (glycoprotein/lipoprotein), polysaccharid/lipopolysaccharid, acid nucleic lipid Kháng nguyên không phụ thuộc T (polysaccharid) Kháng nguyên phụ thuộc T (protein) u Kháng thể (antibody - Ab): protein hệ miễn dịch sử dụng để nhận diện trung hoà tác nhân xâm nhiễm ngoại lại Mỗi kháng thể nhận diện kháng ngun mục tiêu Kháng thể đơn dịng (Monoclonal antibody – mab): kháng thể xác định loại tế bào miễn dịch, bắt nguồn từ dòng tế bào Kháng thể đa dòng bắt nguồn từ nhiều dòng tế bào khác hanhle@sci.edu.vn Đáp ứng miễn dịch dịch thể hanhle@sci.edu.vn Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) u u Là kháng thể kháng môt kháng ngun tạo từ dịng tế bào B điều kiện in vitro Là kháng thể nhận diện vị trí epitope kháng nguyên hanhle@sci.edu.vn Fa b m Do n Fc Domain Kháng thể đơn dòng – đa dòng Kháng thể đa dòng Polyclonal antibodies Kháng thể đơn dòng Monoclonal antibodies Ø Dễ sản xuất Ø Tương tác kháng nguyên – kháng thể không chuyên biệt Ø Giới hạn số lượng (động vất) Ø Tiết kiệm thời gian Ø Đòi hỏi kĩ thuật cao Ø Tương tác kháng nguyên – kháng thể chuyên biệt Ø Không giới hạn số lượng (sx tế bào) Ø Cần nhiều thời gian hanhle@sci.edu.vn Nobel y học 1984 Niels K Jerne, George Kohler, César Milstein hanhle@sci.edu.vn Hybridoma technology for production of monoclonal antibodies Georges J.F Köhler, César Milstein (1975) Niels K Jerne and his theories Theory 1: Specificity is predetermined Theory 2: Reactivity against self-antigens creates diversity Theory Antibodies, anti-anti-bodies Kháng thể đa dòng kháng thể đơn dòng hanhle@sci.edu.vn Các bước tạo kháng thể đơn dòng Chọn động vật gây nghiễm, chọn kháng nguyên Gây đáp ứng miễn dịch Thu nhận tế bào miễn dịch dung hợp với tế bào myelom, tạo tế bào lai hybridoma Sàng lọc, dịng hóa hybridoma Thu nhận, tinh chế kiểm tra kháng thể đơn dòng hanhle@sci.edu.vn Kháng nguyên (antigen) u Được nhận diện kháng thể mục tiêu u Có tính gây đáp ứng miễn dịch mạnh u Có cấu trúc giống với kháng nguyên tự nhiên tốt (Hiện kháng nguyên thường tạo kĩ thuật protein tái tổ hợp) u Có thể vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, hapten phối hợp với protein, vaccine thương phẩm hay phân tử protein hanhle@sci.edu.vn Chọn kháng nguyên u Quyết định thành cơng quy trình u Quyết định hiệu ứng dụng sản phẩm tạo thành u Quyết định quy trình sản xuất sản phẩm (Mab gắn đặc hiệu với KN tiêm vào) hanhle@sci.edu.vn Chọn động vật gây nhiễm u Động vật thường sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch chuột nhắt (Mouse), chuột lớn (Rat, Hamster), thỏ… u Chuột nhắt mơ hình lý tưởng do: u • Đáp ứng miễn dịch mạnh • Thời gian ngắn tạo kháng thể dòng chuột cơng nghệ sản xuất kháng thể đơn dịng (Mab) BALB/c C57BL/6 • Lai dịng • 6-8 tuần tuổi • hanhle@sci.edu.vn Chuột • “sạch tuyệt đối” BALB/c C57BL/6 Các vị trí tiêm Ag Intraperineal (i.p.) tiêm khoang bụng Intradermal (i.d.) tiêm vào da Intramuscular (i.m.) tiêm vào Subcutaneous (s.c.) tiêm da hanhle@sci.edu.vn Intravenous (i.v.) tiêm tĩnh mạch hanhle@sci.edu.vn Gây đáp ứng miễn dịch u Phải gây đáp ứng miễn dịch khác loài (VD: động vật gây nhiễm mouse kháng ngun có nguồn gốc từ rat/hamster) Dịng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ loài với đối tượng gây đáp ứng miễn dịch (VD: tế bào lách từ mouse dịng myeloma SP2/0 X63/Ag.8654, rat chọn dịng Y3.Ag1.2.3 u Có chất bổ trợ (tá dược - adjuvant) u • CFA (Complete Freud’s Adjuvant) gồm nước, nhũ tương dầu, xác vi khuẩn Mycobacteium • IFA (incomplete Freud’s Adjuvant) gồm nước, nhũ tương dầu • ALUM (aluminum hydroxide gel) hanhle@sci.edu.vn Liều lượng sử dụng Kháng nguyên protein Kháng nguyên tế bào Ø Tiêm 10-100 µg/chuột/lần Ø Tá dược thường dùng CFA Tiêm 5x10^6 - 5x10^7 tế bào /chuột/lần Tá dược thường dùng ALUM hanhle@sci.edu.vn Quy trình gây đáp ứng miễn dịch chuột nhắt Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm Tiêm mũi CFA s.c 14 Tiêm nhắc lại lần IFA s.c 28 Tiêm nhắc lại lần IFA s.c 36 Thu serum 42 Nghỉ Tiêm nhắc lại lần IFA s.c 52 Tiêm nhắc lại lần cuối 55 Thu tế bào lách sau xác định hiệu giá Ig huyết hanhle@sci.edu.vn i.v Quy trình gây đáp ứng miễn dịch rat Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm Tiêm mũi CFA i.p 21 Tiêm nhắc lại lần IFA i.p 42 Tiêm nhắc lại lần IFA i.p 52 Thu serum kiểm tra 63 Tiêm nhắc lại lần IFA i.p 73 Thu serum kiểm tra 84 Tiêm nhắc lại lần IFA i.p 94 Thu serum kiểm tra 98 Tiêm nhắc lại lần cuối 101Thu tế bào lách 110 hanhle@sci.edu.vn i.v Xác định hiệu giá kháng thể hanhle@sci.edu.vn Dung hợp tạo tế bào lai hanhle@sci.edu.vn ... in vitro Là kháng thể nhận diện vị trí epitope kháng nguyên hanhle@sci.edu.vn Fa b m Do n Fc Domain Kháng thể đơn dòng – đa dòng Kháng thể đa dòng Polyclonal antibodies Kháng thể đơn dòng Monoclonal... ngoại lại Mỗi kháng thể nhận diện kháng nguyên mục tiêu Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody – mab): kháng thể xác định loại tế bào miễn dịch, bắt nguồn từ dòng tế bào Kháng thể đa dòng bắt nguồn... antibodies Ø Dễ sản xuất Ø Tương tác kháng nguyên – kháng thể không chuyên biệt Ø Giới hạn số lượng (động vất) Ø Tiết kiệm thời gian Ø Đòi hỏi kĩ thuật cao Ø Tương tác kháng nguyên – kháng thể chuyên