Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG CẢM ỨNG TẠO CALLUS TỪ[.]
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG CẢM ỨNG TẠO CALLUS TỪ CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra glabra) TRẦN THỊ ÁNH TUYẾT Đà Nẵng, năm 2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA – SINH MÔI TRƯỜNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG CẢM ỨNG TẠO CALLUS TỪ CÂY SĨI RỪNG (Sarcandra glabra) Ngành : Cơng nghệ sinh học Khóa : 2018 - 2022 Sinh viên thực : Trần Thị Ánh Tuyết Người hướng dẫn : TS Bùi Thị Thơ Đà Nẵng, năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan liệu trình bày khóa luận đề tài “Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả cảm ứng tạo callus từ Sói rừng (sarcandra glabra)” trung thực, thực phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học nuôi cấy mô tế bào thực vật, khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng Đây kết nghiên cứu tác giả chưa cơng bố cơng trình khác trước Ngoài ra, báo cáo có sử dụng số nguồn tài liệu tham khảo trích dẫn rõ ràng phép cơng bố Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tên SV Trần Thị Ánh Tuyết i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực Khoá luận tốt nghiệp Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng, học hỏi nhiều kiến thức lý thuyết thực hành thí nghiệm phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật Để hồn thành Khố luận tốt nghiệp này, ngồi cố gắng thân, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Bùi Thị Thơ – giáo tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình tơi thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô thuộc Khoa Sinh – Môi trường truyền dạy cho nhiều kiến thức kĩ thực hành thí nghiệm q trình thực đề tài Cuối cùng, xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ tơi vật chất lẫn tinh thần để tơi đạt kết tốt Đà Nẵng, tháng năm 2022 Sinh viên thực ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Sói Rừng 1.1.1 Đặc điểm sinh thái 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.2 Giá trị Sói rừng 1.2.1 Giá trị dược liệu 1.2.2 Giá trị kinh tế 1.3 Cơ sở phương pháp nuôi cấy callus 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nước 1.4.2 Tình hình nghiên cứu giới CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.2 Phương pháp nghiên cứu CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 11 3.1 Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu in vitro Sói rừng 11 iii 3.1.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả tạo mẫu vô trùng 11 3.1.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả khử trùng mẫu hạt Sói rừng 12 3.1.3 Ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng đến khả nảy mầm hạt Sói rừng 13 3.2 Nghiên cứu khả tạo callus từ Sói rừng 14 3.2.1 Ảnh hưởng chất ĐHST 2,4-D đến khả phát sinh callus Sói rừng 14 3.2.2 Ảnh hưởng chất ĐHST KIN đến khả phát sinh callus Sói rừng 16 3.2.3 Ảnh hưởng chất ĐHST 2,4-D kết hợp KIN đến khả phát sinh callus Sói rừng 17 3.2.4 Ảnh hưởng chất ĐHST 2,4-D kết hợp BA đến khả phát sinh callus Sói rừng 18 Bảng 3.7: Ảnh hưởng chất ĐHST 2,4-D kết hợp BA đến khả phát sinh callus Sói rừng 18 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 19 Kết luận 19 Kiến nghị 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4dichlorophenoxyacetic acid KIN : Kinetin BA : 6-benzylaminopurine NAA : 1-Naphthaleneacetic acid IBA : Indole 3-butyric acid MS : Murashige Skoog (1962) ĐHST : Điều hòa sinh trưởng v DANH MỤC BẢNG Số hiệu Tên bảng bảng 3.1 3.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả tạo mẫu vô trùng Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả khử trùng mẫu hạt Sói rừng Số trang 11 12 Ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng đến khả nảy mầm 3.3 3.4 hạt Sói rừng 13 Ảnh hưởng chất ĐHST2,4-D đến khả phát sinh callus Sói rừng 14 Ảnh hưởng chất ĐHST KIN đến khả phát sinh callus 3.5 3.6 Sói rừng 16 Ảnh hưởng chất ĐHST 2,4-D kết hợp KIN đến khả phát sinh callus Sói rừng 16 Ảnh hưởng chất ĐHST 2,4-D kết hợp BA đến khả phát 3.7 sinh callus Sói rừng 17 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu Tên hình hình Số trang Quả, hoa thân ngồi tự nhiên khu bảo tồn thiên nhiên 1.1 Sơn Trà, Đà Nẵng Cây Sói rừng ngồi tự nhiên, mẫu thân và Quả Sói rừng 2.1 3.1 Hạt Sói rừng sau tuần vào mẫu 12 Hạt Sói rừng nảy mầm sau tuần vào mẫu môi trường MS + 3.2 0,5 mg/l BA 13 Mẫu Sói rừng ni cấy mơi trường MS bổ sung 2,4-D sau tuần 3.3 Các nồng độ: (A) 0,5 mg/l, (B) 1,0 mg/l, (C) 2,0 mg/l 15 Mẫu thân Sói rừng ni mơi trường MS bổ sung 2,4-D sau 3.4 tuần 15 Nồng độ 2,4-D 2,0 mg/l Mẫu Sói rừng ni cấy mơi trường MS bổ sung KIN sau tuần 3.5 Các nồng độ: (A) 0,5 mg/l, (B) 1,0 mg/l, (C) 2,0 mg/l vii 16 TĨM TẮT Cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) loại thảo mộc dược liệu có tác dụng điều trị số bệnh viêm nhiễm, gãy xương, viêm khớp xương phong thấp, ngoại thương xuất huyết, bỏng, phịng cảm mạo, vết thương lt khơng liền miệng hỗ trợ điều trị ung thư Ngoài ra, lồi giàu dược tính theo kết nghiên cứu gần đây, Sói rừng chứa năm mươi thành phần phân thành năm loại: axit hữu cơ, dẫn xuất caffeoyl, flavonoids, coumarin terpenoid Nghiên cứu nhân nhanh tạo sinh khối Sói rừng nhằm tạo nguồn nguyên liệu chứa hợp chất có dược tính phục vụ cho nhu cầu sản phẩm thuốc, thực phẩm chức trở thành xu cấp bách Kết nghiên cứu ra, khử trừng mẫu hạt Sói rừng ethanol 70% 30s, HgCl2 0,1% 10 phút để khử trùng bề mặt mẫu hạt Sói rừng đạt hiệu tốt tạo vật liệu khởi đầu in vitro từ hạt Sói rừng Hạt Sói rừng cấy vào mơi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA tỷ lệ nảy mầm hạt 100% Mẫu Sói rừng khử trùng ethanol 70% 30s HgCl2 0,1% 10 phút cho hiệu khử trùng tốt nhất, đói với mẫu thân khử trùng với ethanol 70% 30s HgCl2 0,1% 10 phút cho hiệu cao Các mẫu thân cấy MS có bổ sung 3% succrose, 0,8% agar chất điều hoà sinh trưởng (2,4-D KIN) với nồng độ 0,5 – 2,0 mg/l, kết cho thấy sau tuần nuôi mẫu khơng có cảm ứng phát sinh hình thái Tuy nhiên, mẫu có tượng chuyển thành màu nâu đen mơi trường MS có bổ sung 2,4-D Tỷ lệ mẫu thân cảm ứng phát sinh callus cao (75%) Từ khoá: in vitro, callus, Sarcandra glabra viii CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Cây Sói rừng (Sarcandra glabra) thu hái khu bảo tồn thiên nhiên Bán đảo Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng Mẫu lá, thân hạt Sói rừng thu hái ngồi tự nhiên dùng làm nguyên liệu để nuôi cấy in vitro, mẫu thu toạ độ sau: Toạ độ 1: N 16o 08.125’/ E 108o 15.104’ Toạ độ 2: N 16o 08.033’/ E 108o 15.145’ Toạ độ 3: N 16o 08.133’/ E 108o 15.103’ A B C 2.1: Cây Sói rừng tự nhiên, mẫu thân và Quả Sói rừng (A) Cây Sói rừng ngồi tự nhiên, (B) Mẫu thân (C) Quả Sói rừng 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu in vitro Sói rừng Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng thời gian đến hiệu khử trùng thân Sói rừng Mẫu thân Sói rừng rửa vịi nước chảy vịng 30 phút Sau mẫu ngâm với xà phịng pha lỗng 10 phút Tiếp tục rửa mẫu vời nước chảy cho hết bụi bẩn xà phịng, tráng mẫu với nước cất vơ trùng lần trước đem vào tủ cấy để tiếp tục khử trùng Trong tủ cấy, mẫu lắc ethanol 70% 30s, sau tráng nước cất lần Khử trùng mẫu với dung dịch HgCl2 0,1% với thời gian khác phút, phút,10 phút 15 phút để khử trùng bề mặt rửa lần với nước cất Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thời gian đến hiệu khử trùng hạt Sói rừng Quả Sói rừng sau thu hái tách bỏ phần thịt thu phần hạt Mẫu hạt Sói rừng rửa vòi nước chảy vòng 30 phút Sau mẫu ngâm với xà phịng pha loãng 10 phút Tiếp tục rửa mẫu vời nước chảy cho hết bụi bẩn xà phòng, tráng mẫu với nước cất vô trùng lần trước đem vào tủ cấy để tiếp tục khử trùng Trong tủ cấy, tiến hành tách vỏ hạt lắc ethanol 70% 30s, sau tráng nước cất lần Khử trùng mẫu với dung dịch HgCl2 0,1% với thời gian khác phút, phút,10 phút 15 phút để khử trùng bề mặt rửa lần với nước cất Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng đến khả nảy mầm hạt Sói rừng Cách tiến hành: mẫu hạt khử trùng thành cơng từ thí nghiệm cấy vào mơi trường MS có bổ sung 3% (w/v) succrose; BA với nồng độ - 2,0 mg/l Giá trị pH môi trường 5,7 - 5,8 Thời gian theo dõi mẫu: tuần sau vào mẫu Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ nảy mầm, chiều cao chồi, số lá/chồi 2.2.2 Khảo sát khả phát sinh callus thân Sói rừng ngồi tự nhiên Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng 2,4-D đến khả phát sinh callus thân Sói rừng Cách tiến hành: mẫu non 1,5 – cm khử trùng cấy vào mơi trường MS có bổ sung 3% (w/v) sucrose; 2,4-D với nồng độ 2,0 mg/l Giá trị pH môi trường 5,7 - 5,8 Thời gian theo dõi mẫu: từ – tuần sau vào mẫu Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ tạo callus, hình thái callus, kích thước callus Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng KIN đến khả phát sinh callus thân Sói rừng Cách tiến hành: mẫu non 1,5 – cm khử trùng cấy vào mơi trường MS có bổ sung 3% (w/v) succrose; KIN với nồng độ 1,0 mg/l Giá trị pH môi trường 5,7 - 5,8 Thời gian theo dõi mẫu: từ – tuần sau vào mẫu Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ tạo callus, hình thái callus, kích thước callus Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D KIN đến khả phát sinh callus thân Sói rừng Cách tiến hành: mẫu non 1,5 – cm khử trùng cấy vào mơi trường MS có bổ sung 3% (w/v) succrose; 2,4-D với nồng độ 1,5 - 2,0 mg/l KIN với nồng độ 0,25 – 0,5 mg/l Giá trị pH môi trường 5,7 - 5,8 Thời gian theo dõi mẫu: từ – tuần sau vào mẫu Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ tạo callus, hình thái callus, kích thước callus Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng kết hợp 2,4-D 6-BA đến khả phát sinh callus thân Sói rừng Cách tiến hành: mẫu non 1,5 – cm khử trùng cấy vào môi trường MS có bổ sung 3% (w/v) succrose; 2,4-D với nồng độ 2,0 mg/l 6-BA với nồng độ 0,5 – 1,5 mg/l Giá trị pH môi trường 5,7 – 5,8 Thời gian theo dõi mẫu: từ -3 tuần sau vào mẫu Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ tạo callus, hình thái callus, kích thước callus Hạt Sói rừng rửa vòi nước chảy vòng 30 phút Sau mẫu ngâm với xà phịng pha lỗng 10 phút Tiếp tục rửa mẫu vời nước chảy cho hết bụi bẩn xà phòng, tráng mẫu với nước cất vô trùng lần trước đem vào tủ cấy để tiếp tục khử trùng Trong tủ cấy, mẫu lắc ethanol 70% 30s, sau tráng nước cất lần Khử trùng mẫu với dung dịch HgCl2 0,1% với thời gian khác phút, phút, 10 phút 15 phút để khử trùng bề mặt rửa lần với nước cất Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết Cách tiến hành: hạt Sói rừng khử trùng cấy vào mơi trường MS0 MS có bổ sung 3% (w/v) succrose; BA với nồng độ 0,5-1,5 mg/l Giá trị pH môi trường 5,7 - 5,8 Thời gian theo dõi mẫu: từ tuần sau vào mẫu Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ nảy mầm (%) , chiều cao (cm), số lá/cây(lá) 2.2.5 Phương pháp xử lí số liệu Các thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, thí nghiệm lặp lại lần Kết thí nghiệm tính trung bình phân tích ANOVA với Duncan’s test (p < 0,05) 10 ... KHOA – SINH MƠI TRƯỜNG KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG CẢM ỨNG TẠO CALLUS TỪ CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra glabra). .. Sói rừng Số trang 11 12 Ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng đến khả nảy mầm 3.3 3.4 hạt Sói rừng 13 Ảnh hưởng chất ĐHST2,4-D đến khả phát sinh callus Sói rừng 14 Ảnh hưởng chất ĐHST KIN đến khả. .. ? ?Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả cảm ứng tạo callus từ Sói rừng (sarcandra glabra)? ?? trung thực, thực phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học nuôi cấy