Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của đơn bào histomonas meleagridis ký sinh trên gà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA ĐƠN BÀO Histomonas meleagridis KÝ SINH TRÊN GÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA ĐƠN BÀO HISTOMONAS MELEAGRIDIS KÝ SINH TRÊN GÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành Công nghệ sinh học Mã số 60420201 Quyết định giao đề tài 526/QĐ-ĐHNT ngày 17/06/2014 Quyết định thành lập HĐ Ngày bảo vệ 30/11/2015 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS NGUYỄN ĐỨC TÂN Chủ tịch Hội đồng: Khoa sau đại học: KHÁNH HÒA - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học đơn bào Histomonas meleagridis ký sinh gà” cơng trình nghiên cứu cá nhân chƣa đƣợc công bố cơng trình khoa học khác thời điểm Nha Trang, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thu Hằng iii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài, nhận đƣợc giúp đỡ quý phòng ban trƣờng Đại học Nha Trang, Viện Công nghệ sinh học Môi trƣờng điều kiện tốt cho đƣợc hoàn thành đề tài Đặc biệt hƣớng dẫn tận tình TS Nguyễn Đức Tân giúp tơi hồn thành tốt đề tài Qua đây, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giúp đỡ Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung cán Bộ môn nghiên cứu Ký sinh trùng, thầy cô Viện Công nghệ sinh học Môi trƣờng tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình làm luận văn tốt nghiệp Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình tất bạn bè giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thu Hằng iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ xi TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xiii PHẦN MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Lịch sử bệnh đơn bào Histomonas meleagridis giới Việt Nam 1.2 Đặc điểm chung Histomonas meleagridis 1.2.1 Hệ thống phân loại 1.2.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo 1.2.3 Chu trình sinh học 1.3 Đặc điểm dịch tễ 1.3.1 Vật chủ cảm nhiễm 1.3.2 Một số nghiên cứu bệnh đơn bào Histomonas meleagridis giới Việt Nam 1.3.3 Mùa nhiễm bệnh 1.3.4 Vật chủ trung gian Heterakis gallinarum 10 1.3.4.1 Đặc điểm sinh học giun kim Heterakis gallinarum 10 1.3.4.2 Cơ chế sinh bệnh 12 1.3.5 Đƣờng truyền bệnh 12 1.4 Triệu chứng lâm sàng bệnh tích bệnh đơn bào Histomonas meleagridis 13 1.4.1 Triệu chứng lâm sàng 13 1.4.2 Bệnh tích 14 1.5 Đặc điểm mô bệnh học 16 1.6 Đặc điểm miễn dịch học 17 1.6.1 Miễn dịch chủ động 17 1.6.2 Miễn dịch thụ động 17 v 1.7 Một số phƣơng pháp chẩn đoán bệnh 18 1.7.1 Chẩn đoán lâm sàng 18 1.7.2 Chẩn đoán phân biệt 18 1.7.3 Chẩn đốn phịng thí nghiệm 20 1.7.3.1 Xét nghiệm tiêu 20 1.7.3.2 Nuôi cấy 20 1.7.3.3 Kỹ thuật PCR 22 1.8 Một số biện pháp phòng trị bệnh 22 1.8.1 Phòng bệnh 22 1.8.2 Trị bệnh 23 1.9 Giới thiệu phản ứng PCR 24 1.9.1 Định nghĩa 24 1.9.2 Nguyên lý 24 1.9.3 Một số yếu tố ảnh hƣởng giải pháp tối ƣu hoá phản ứng PCR 27 1.9.3.1 DNA khuôn mẫu 28 1.9.3.2 Enzyme DNA polymerase 28 1.9.3.3 Primer nhiệt độ lai 29 1.9.3.4 Nồng độ dNTP 30 1.9.3.5 Dung dịch đệm 30 1.9.3.6 Nƣớc 31 1.9.3.7 Nhiệt độ trình ủ 31 1.9.3.8 Số lƣợng chu kỳ phản ứng 31 1.9.3.9 Thiết bị dụng cụ cho phản ứng PCR 32 1.9.4 Ƣu nhƣợc điểm kỹ thuật PCR 32 1.9.4.1 Ƣu điểm 32 1.9.4.2 Nhƣợc điểm 32 Chƣơng NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Nội dung nghiên cứu 34 2.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu 34 2.2.1 Mẫu bệnh phẩm, động vật thí nghiệm 34 2.2.2 Hóa chất- sinh phẩm 34 2.2.3 Máy móc, thiết bị 35 vi 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 35 2.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 35 2.3.2 Nghiên cứu xác định đặc điểm hình thái cấu tạo, đặc điểm sinh học Histomonas meleagridis 36 2.3.2.1 Phƣơng pháp xét nghiệm tiêu 36 2.3.2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy môi trƣờng Dwyer 36 2.3.3 Phƣơng pháp xác định vòng đời Histomonas meleagridis 37 2.3.3.1 Xác định trình phát triển Histomonas meleagridis trứng giun kim môi trƣờng bên 37 2.3.3.2 Xác định trình phát triển Histomonas meleagridis thể gà 37 2.3.4 Nghiên cứu xác định triệu chứng lâm sàng bệnh tích bệnh Histomonas meleagridis gây 38 2.3.5 Phƣơng pháp chẩn đoán Histomonas meleagridis kỹ thuật PCR 39 2.3.5.1 Chiết tách DNA 40 2.3.5.2 Quy trình PCR để phát Histomonas meleagridis 41 2.3.5.3 Chạy điện di đọc kết 43 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Kết xác định số đặc điểm hình thái cấu tạo, đặc điểm sinh học Histomonas meleagridis 45 3.1.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo Histomonas meleagridis 45 3.1.2 Đặc điểm sinh học Histomonas meleagridis 47 3.1.2.1 Đặc điểm nuôi cấy 47 3.1.2.2 Kết xác định vòng đời Histomonas meleagridis 49 3.2 Kết xác định triệu chứng lâm sàng bệnh tích bệnh Histomonas meleagridis 53 3.2.1 Kết xác định triệu chứng lâm sàng 53 3.2.2 Kết xác định bệnh tích 55 3.2.2.1 Kết xác định bệnh tích đại thể 55 3.2.2.2 Kết xác định bệnh tích vi thể 58 3.2.3 Chẩn đoán phân biệt bệnh Histomonas meleagridis với số bệnh truyền nhiễm (Newcastle Salmonella) 59 vii 3.3 Kết chẩn đoán Histomonas meleagridis kỹ thuật PCR 60 3.3.1 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà huyện Cam Ranh Ninh Hòa 60 3.3.2 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà theo phƣơng thức chăn nuôi 62 3.3.3 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis theo nhóm tuổi gà 63 3.3.4 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagiridis theo mùa vụ 64 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 66 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BAC : Bacterial artificial chromosome (Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn) DNA : Deoxyribonucleic Acid DNase : Deoxyribonuclease ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) ETS : External Transcribed Spacer (Vùng phiên mã bên ngoài) GOT : Glutamic-Oxaloacetic Transaminase GPT : Glutamic Pyruvic Transaminase HE : Haematoxilin – Eosin ITS : Internal Transcribed Spacer (Vùng phiên mã bên trong) LDH : Lactic MDH : Malic Dehydrogenase NFX : Nifurtimox PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA (Tính đa hình DNA nhân Dehydrogenase ngẫu nhiên) rDNA : ribosomal Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid RNase : Ribonuclease rRNA : ribosomal Ribonucleic Acid STS : Sequence Tagged Site TBE : Tris Acetate-EDTA ix DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 42 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo Histomonas meleagridis 43 Bảng 3.2 Số lƣợng Histomonas meleagridis môi trƣờng nuôi cấy theo thời gian 46 Bảng 3.3 Thí nghiệm xác định vòng đời Histomonas meleagridis 50 Bảng 3.4 Triệu chứng lâm sàng gà nhiễm Histomonas meleagridis 52 Bảng 3.5 Bệnh tích đại thể quan gà bị bệnh Histomonas meleagridis 54 Bảng 3.6 Đặc điểm khác biệt bệnh Histomonas meleagridis với bệnh Newcastle Salmonella gà 58 Bảng 3.7 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà huyện Cam Ranh Ninh Hòa 59 Bảng 3.8 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis theo phƣơng thức chăn nuôi 61 Bảng 3.9 Tình hình nhiễm Histomonas meleagridis theo nhóm tuổi gà 62 Bảng 3.10 Kết chẩn đoán Histomonas meleagridis theo mùa vụ 63 x manh tràng dày lên, chất chứa manh tràng dạng bã đậu Tuy nhiên, kết theo dõi chúng tơi có số phận cao thấp so với kết nghiên cứu số tác giả nhƣ: + Mc Dougald (2005) nghiên cứu gà có 67,00% nhiễm bệnh có biểu manh tràng 17,00% có biểu gan với dấu hiệu gà bị nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis + Nguyễn Hữu Nam cộng (2013) nghiên cứu gà thả vƣờn có 86,50% gà nhiễm bệnh có biểu gan 96,20% có biểu manh tràng: Manh tràng gà bị loét xuất huyết, thành manh tràng dày, chất chứa bên màng cứng, bã đậu; gan gà bị bệnh có biến đổi nhƣ gan sƣng to bình thƣờng, mềm nhũn, vết loét mặt gan hình hoa cúc, rìa mép hình cƣa * Bệnh tích quan khác: Ngoài gan manh tràng ra, mổ khám chúng tơi cịn nhận thấy bệnh tích số quan khác nhƣ: Ruột non xung huyết với tỷ lệ 35,00%; Lách sƣng to, xuất huyết chiếm tỷ lệ 16,67%; Thận sƣng, phổi tụ máu, bao tim tích nƣớc ghi nhận số ca bệnh với tỷ lệ tƣơng ứng lần lƣợt 12,50%; 20,00% 13,30% 3.2.2.2 Kết xác định bệnh tích vi thể Bên cạnh việc quan sát bệnh tích đại thể, chúng tơi tiến hành quan sát bệnh tích vi thể gan manh tràng Nghiên cứu bệnh tích vi thể nội dung quan trọng giúp cho việc đánh giá tổn thƣơng bệnh lý cấp độ mô bào Tuy nhiên bệnh gà nhiễm Histomonas meleagridis biến đổi tập trung chủ yếu gan manh tràng, tập trung làm rõ biến đổi vi thể gan manh tràng Kết bệnh tích vi thể cho thấy: - Xuất nhiều ổ viêm, hoại tử gan manh tràng; vùng tổn thƣơng thấy nhiều tế bào Lympho đại thực bào xâm nhập, chúng tạo thành u hạt mô manh tràng gan - Hồng cầu bạch cầu tập trung nhiều vùng tổn thƣơng mạch máu bị tắc bị vỡ - Xuất nhiều Histomonas meleagridis dạng hình trứng xen lẫn tế bào viêm mơ bào vùng bị tổn thƣơng (Hình 3.25, 3.26, 3.27 3.28) 58 Hình 3.25 3.26 Bệnh tích vi thể gan hoại tử có nhiều tế bào viêm Histomonas meleagridis (100X) Hình 3.27 3.28 Bệnh tích vi thể manh tràng gà bị hoại tử với vơ số nỗn nang (100X) 3.2.3 Chẩn đốn phân biệt bệnh Histomonas meleagridis với số bệnh truyền nhiễm (Newcastle Salmonella) Trong nghiên cứu, thấy triệu chứng lâm sàng, bệnh tích bệnh Histomonas meleagridis có số đặc điểm giống với bệnh Newcastle Salmonella gà Vì để chẩn đốn phân biệt đƣợc bệnh này, nghiên cứu đƣa số yếu tố khác bảng 3.6 59 Bảng 3.6 Đặc điểm khác biệt bệnh Histomonas meleagridis với bệnh Newcastle Salmonella gà Đặc điểm so sánh Histomonosis Bệnh Newcastle Salmonellosis Căn nguyên Đơn bào Virus Vi khuẩn Phần đầu Mào thâm tím, da mép da đầu xanh xám chí xanh đen Ít biến đổi Ít biến đổi Tiêu chảy, phân màu hồng lẫn máu Tiêu chảy, phân xanh, xanh trắng có mùi Tiêu chảy lúc đầu lỗng thối vàng, xanh lục (gà lớn), sau tiêu chảy trắng bạch Ít biến đổi Sƣng to có nhiều điểm hoại tử trắng lấm Ít biến đổi Viêm sƣng nhẹ Trạng thái phân Gan Manh tràng Sƣng to, mềm nhũn nhiều ổ viêm hoại tử bề mặt gan làm cho gan có hình hoa cúc Viêm sƣng to, thành manh tràng dày, ruột chứa chất cứng dạng bã đậu 3.3 Kết chẩn đoán Histomonas meleagridis kỹ thuật PCR 3.3.1 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà huyện Cam Ranh Ninh Hòa Để chẩn đốn phƣơng pháp PCR, chúng tơi tiến hành thu thập mẫu gan, manh tràng phân 130 mẫu bệnh phẩm gà nuôi sở chăn ni huyện Cam Ranh huyện Ninh Hịa (Khánh Hòa) Mẫu bệnh phẩm đƣợc thu thập theo tiêu dịch tễ nhƣ: Địa phƣơng, tuổi, mùa vụ địa phƣơng bảo quản - 20ºC Các mẫu bệnh phẩm đƣợc tiến hành phân loại, xử lý, chiết tách DNA thực phản ứng PCR với cặp mồi HIS5F HIS5R Huber cộng (2005) Kết tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà theo địa phƣơng phƣơng pháp PCR đƣợc thể bảng 3.7 60 Bảng 3.7 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà huyện Cam Ranh Ninh Hòa Tỷ lệ gà nhiễm Histomonas meleagridis TT Địa điểm n + % Cam Ranh 70 11,43 Ninh Hòa 60 15,00 Cộng 130 17 13,08 Ghi chú: n tổng số mẫu nghiên cứu Kết bảng 3.7 cho thấy tổng số 130 mẫu gà nuôi điểm huyện Cam Ranh huyện Ninh Hòa tỉnh Khánh Hòa đƣợc lấy mẫu xét nghiệm có 17 nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis, chiếm tỷ lệ 13,08% Trong đó, tỷ lệ nhiễm gà nuôi huyện Cam Ranh 11,43% huyện Ninh Hòa 15,00% Sự khác biệt tỷ lệ nhiễm huyện đề cập khơng lớn khơng có ý nghĩa mặt thống kê (p > 0,05) Nhƣ vậy, tỷ lệ gà nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis huyện Cam Ranh Ninh Hòa nằm khoảng giao động 10 - 20% Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả Mc Dougald (1998) cho biết tỷ lệ gà bị bệnh Mỹ giao động 10 – 20% 61 10 11 M 209 bp 600 bp 300 bp 100 bp Hình 3.29 Ảnh đại diện kết điện di sản phẩm PCR Ghi chú: M: Marker Giếng số 11: Đối chứng âm Giếng 3, 7: Dƣơng tính với Histomonas meleagridis có band kích thƣớc khoảng 209 bp Giếng số 1, 4, 6, 8, 10: Âm tính Hình ảnh kết chạy PCR với cặp mồi HIS5F HIS5R cho thấy mẫu bệnh phẩm thu thập cho kết dƣơng tính với đơn bào Histomonas meleagridis Đây cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen 18S rRNA Histomonas meleagridis cho sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 209 bp (Hình 3.29) 3.3.2 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà theo phƣơng thức chăn ni Ở Khánh Hịa chăn ni gà chủ yếu theo hộ gia đình nhƣng quy mô lớn từ vài trăm đến vài ngàn trại Ngồi việc chăn ni gà theo phƣơng thức chăn nuôi truyền thống (nuôi theo phƣơng thức thả vƣờn) phƣơng thức chăn ni cơng nghiệp đà phát triển Vấn đề đặt liệu yếu tố dịch tễ (phƣơng thức chăn ni) có ảnh hƣởng đến tình hình nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis hay không? Để trả lời câu hỏi này, đề tài tiến hành lấy mẫu điều tra tình hình nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis gà nuôi theo phƣơng thức tỉnh Khánh Hòa Kết đƣợc thể bảng 3.8 62 Bảng 3.8 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis theo phƣơng thức chăn nuôi Gà nuôi thả vƣờn TT Địa điểm Gà nuôi công nghiệp Giá trị p n + % n + % Cam Ranh 35 20,00 35 2,86 0,04 Ninh Hòa 30 26,67 30 3,33 0,03 Cộng 65 15 23,08 65 3,08 0,03 Theo kết trình bày bảng 3.8, gà thả vƣờn Cam Ranh nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis 20,00% gà nuôi công nghiệp 2,86% Tƣơng tự, tỷ lệ nhiễm tƣơng ứng gà thả vƣờn so với gà ni cơng nghiệp Ninh Hịa 26,67% 3,33% Tính chung cho huyện điều tra gà thả vƣờn nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis cao nhiều so với gà nuôi công nghiệp theo tỷ lệ tƣơng ứng 23,08% 3,08% Sự khác biệt tỷ lệ nhiễm đơn bào gà thả vƣờn gà nuôi công nghiệp hai huyện Cam Ranh Ninh Hịa có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Kết lý giải đơn bào Histomonas meleagridis phát triển với trứng giun kim Heterakis gallinarum sau 12 – 14 ngày gây nhiễm cho gà Đối với gà nuôi theo phƣơng thức công nghiệp, chuồng đƣợc dọn dẹp hàng ngày làm hạn chế phát triển trứng giun kim Nhƣ vậy, gà nuôi theo phƣơng thức thả vƣờn có hội tiếp xúc với mầm bệnh cao nhiều so với gà nuôi công nghiệp nên gà ni thả vƣờn có tỷ lệ nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis cao nhiều so với gà nuôi công nghiệp Kết phù hợp với nghiên cứu số tác giả cho biết gà thả vƣờn có tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis cao so với gà nuôi công nghiệp (Esquenet cộng sự, 2003; Grafl cộng sự, 2011) 3.3.3 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis theo nhóm tuổi gà Trong chăn ni gia cầm nói chung chăn ni gà nói riêng, số bệnh thƣờng xảy lứa tuổi mà gặp lứa tuổi khác Chính vậy, để có thêm thơng tin cho ngƣời dân biết cách phịng chống bệnh, chúng tơi lấy mẫu bệnh phẩm độ tuổi khác Kết đƣợc trình bày bảng 3.9 63 Bảng 3.9 Tình hình nhiễm Histomonas meleagridis theo nhóm tuổi gà < tháng Tuổi TT Địa điểm tháng n + % n + % Cam Ranh 35 8,57 35 14,29 Ninh Hòa 30 13,33 30 16,67 Cộng 65 10,77 65 10 15,38 Kết bảng 3.9 cho thấy, Cam Ranh tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà nhóm < tháng tuổi chiếm 8,57% nhóm tháng tuổi chiếm 14,29% Tƣơng tự, Ninh Hòa tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis nhóm < tháng tuổi chiếm 13,33% nhóm tháng tuổi chiếm 16,67% Tính chung cho hai huyện tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis nhóm tuổi < tháng tháng lần lƣợt 10,77% 15,3% Nhƣ vậy, kết điều tra chúng tơi cho thấy gà nhóm tuổi khác điểm tỉnh Khánh Hòa nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis sai khác tỷ lệ nhiễm nhóm tuổi khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 3.5.4 Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagiridis theo mùa vụ Khánh Hòa tỉnh vùng Duyên hải cực Nam Trung bộ; nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm chịu ảnh hƣởng khí hậu đại dƣơng Thời tiết đƣợc chia thành mùa rõ rệt: Mùa mƣa ngắn, từ tháng đến tháng 12 mùa khô từ tháng đến tháng dƣơng lịch Mùa vụ yếu tố quan trọng bệnh nói chung, có bệnh đơn bào Histomonas meleagridis gây Trên sở nắm bắt đƣợc quy luật phát sinh bệnh năm mà từ đề kế hoạch biện pháp phòng chống bệnh thích hợp Chính chúng tơi tiến hành đánh giá tình hình nhiễm Histomonas meleagridis mùa khơ mùa mƣa tỉnh Khánh Hòa Kết điều tra tình hình nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis theo mùa đƣợc trình bày bảng 3.10 64 Bảng 3.10 Kết chẩn đoán Histomonas meleagridis theo mùa vụ TT Địa điểm Mùa mƣa Mùa khô Mùa n + % n + % Giá trị p Cam Ranh 35 20,00 35 2,86 0,04 Ninh Hòa 30 26,67 30 3,33 0,03 Cộng 65 15 23,08 65 3,08 0,03 Kết bảng 3.10 cho thấy, 35 gà đƣợc điều tra huyện Cam Ranh vào mùa khơ có nhiễm Histomonas meleagridis, chiếm tỷ lệ 20,00%; vào mùa mƣa, tỷ lệ gà nhiễm Histomonas meleagridis 2,86% Tƣơng tự, huyện Ninh Hòa tỷ lệ gà nhiễm Histomonas meleagridis vào mùa khô mùa mƣa lần lƣợt chiếm tỷ lệ 23,08% 3,08% Trong tổng số 65 gà đƣợc điều tra hai huyện Cam Ranh Ninh Hòa vào mùa khơ có 15 bị nhiễm Histomonas meleagridis, chiếm tỷ lệ 23,08% Vào mùa mƣa, số 65 gà đƣợc điều tra có bị nhiễm Histomonas meleagridis, chiếm tỷ lệ 3,08% Nhƣ vậy, tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà vào mùa khô cao so với mùa mƣa sai khác có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Sở dĩ tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà vào mùa khơ cao so với mùa mƣa vào mùa khô gà thƣờng nhiễm giun kim cao so với mùa mƣa tỷ lệ nhiễm cƣờng độ nhiễm, chúng thải số lƣợng lớn trứng bên ngồi Hơn nữa, điều kiện khí hậu mùa khơ ấm áp thuận lợi để trứng giun kim phát triển từ truyền mầm bệnh Histomonas meleagridis cho gà (Phan Thế Việt, 1977) Ngƣợc lại, vào mùa mƣa đất đai ẩm ƣớt, nhiệt độ thấp ảnh hƣởng đến tồn phát triển trứng giun kim, khả gây nhiễm cho gà thấp mùa khô Kết phù hợp với kết nghiên cứu số tác giả Everette Lund (1974), Hauck cộng (2010) cho biết bệnh thƣờng xảy vào khoảng thời gian từ cuối mùa xuân đến đầu mùa thu, lúc mà thời tiết thƣờng nóng ẩm 65 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Kết luận - Nghiên cứu hình thái học cho thấy: Đơn bào Histomonas meleagridis có kích thƣớc từ - 25 µm, hình trịn oval - Về đặc điểm sinh học Histomonas meleagridis: Trong môi trƣờng nuôi cấy Dwyer, số lƣợng đơn bào đạt cực đại sau 24 ni cấy, vịng đời Histomonas meleagridis cần phát triển qua giun kim thời gian cần thiết để hồn thành vịng đời 36 – 42 ngày - Triệu chứng lâm sàng bệnh Histomonas melagridis: Gà ủ rũ, lơng xù, ỉa chảy; mào tái, thâm tím màu xanh đen; Bệnh tích đại thể bệnh: Gan xuất huyết, hoại tử hình hoa cúc; Manh tràng trƣng to, chất chứa vón thành cục dạng bã đậu Bệnh tích vi thể bệnh: Tại vùng tổn thƣơng thấy tập trung nhiều tế bào lympho, đại thực bào, hồng cầu bạch cầu - Chẩn đoán bệnh Histomonas meleagridis kỹ thuật PCR hai huyện Cam Ranh Ninh Hòa cho thấy: Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis gà giao động từ 10 – 20%, tỷ lệ gà nhiễm đơn bào gà nuôi theo phƣơng thức thả vƣờn cao gà nuôi theo phƣơng thức cơng nghiệp (23,08% so với 3,08%), khơng có sai khác tỷ lệ nhiễm đơn bào nhóm tuổi (10,77% so với 15,38%) tỷ lệ nhiễm đơn bào mùa khô cao mùa mƣa (23,08% so với 3,08%) Khuyến nghị - Phải tăng cƣờng thƣờng xuyên công tác quản lý, giám sát chặt chẽ việc chăn thả gà nhƣ gia cầm hộ chăn nuôi, khử trùng tiêu độc định kỳ, tuyên truyền cho ngƣời chăn nuôi thấy nguy hiểm bệnh đơn bào Histomonas meleagridis - Củng cố nâng cao trình độ chun mơn thú y cấp, đặc biệt mạng lƣới thú y sở việc chẩn đoán đoán lâm sàng, lấy mẫu, vận chuyển mẫu quy định phịng thí nghiệm 66 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Xn Bình, Trần Xn Hạnh, Tơ Thị Phấn, 2002, 109 Bệnh gia cầm cách phòng trị, Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội, p 219-223 Lê Thị Thúy Dung, 2013, Các kỹ thuật PCR ứng dụng Luận văn kỹ sƣ công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh Hồ Quỳnh Thùy Dƣơng, 2003, Sinh học phân tử, Nhà xuất giáo dục Hà Nội, p 196-204 Lại Hà Tố Hoa, 2006, Định danh nấm Trichoderma dựa vào trình tự ITSrDNA vùng TEF, Luận văn kỹ sƣ công nghệ sinh học, Đại học nơng lâm thành phố Hồ Chí Minh Phạm Văn Khuê, Phan Lục, 1996, Ký sinh trùng thú y, Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội, p 138-139 Phạm Sỹ Lăng, 2011, Bệnh Đầu đen gia cầm Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung, 2010, Giáo trình Cơng nghệ DNA tái tổ hợp, Nhà xuất Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, p 64-71 Nguyễn Hữu Nam, Lê Văn Năm, Nguyễn Vũ Sơn, 2013, Một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu bệnh Histomonas meleagridis gây gà thả vƣờn, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, 20(3), p 43-47 Lê Văn Năm, 2011, Bệnh đầu đen gà gà tây, Tạp chí khoa học Cơng nghệ Chăn ni 2011, 9(4), p 88-90 10 Trịnh Văn Thịnh, 1963, Ký sinh trùng thú y, Nhà xuất Nông thôn, p 173-175 11 Triệu Nguyên Trung, Huỳnh Hồng Quang, 2010, Một số ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử bệnh lý vi sinh vật ký sinh trùng 12 Phan Thế Việt, Nguyễn Thị Kỳ, Nguyễn Thị Lê, 1977, Giun sán ký sinh động vật Việt Nam Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp p 121-122 67 13 Hồng Thị Tĩnh, 2009, Tình trạng nhiễm giun, sán đƣờng tiêu hóa gà, số đặc điểm sinh học, bệnh lý học giun Ascaridia galli biện pháp phòng trừ, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Đại học nông nghiệp Hà Nội 14 Trần Quốc Thuyết, 2011, Tình hình nhiễm giun trịn đƣờng tiêu hóa gà thuộc ngoại thành Hà Nội, đặc điểm phát triển giun kim (Heterakis gallinarum) hiệu lực thuốc tây, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Đại học nông nghiệp Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh 15 Adl, SM, Simpson, AG, Farmer, MA, Andersen, RA, Anderson, OR, Barta, JR, Bowser, SS, Brugerolle, G, Fensome, RA & Fredericq, S, 2005, The new higher level classification of eukaryotes with emphasis on the taxonomy of protists, Journal of Eukaryotic Microbiology, 52, p 399–451 16 Aka, J, Hauck, R, Blankenstein, P, Balczulat, S & Hafez, HM, Reoccurrence of Histomonas in turkey beeder farm, Berl Munch Tierarztl Wochenschr, 2011, 124, p 2-7 17 Alkhalaf, AN & Mahmoud, OM, An Outbreak of Concurrent Histomonas meleagridis and Enteroccocus fecalis infection in Ducks, Asian Journal of Poultry Science, 2009, 3, p 15-18 18 Bart, A, van der Heijden, HM, Greve, S, Speijer, D, Landman, WJ & van Gool, T, Intragenomic variation in the internal transcribed spacer region of Dientamoeba fragilis as a molecular epidemiological marker, J Clin Microbiol, 2008, 46, p 32703275 19 Bleyen, N, Ons, E, De Gussem, M & Goddeeris, BM, Passive immunization against Histomonas meleagridis does not protect turkeys from an experimental infection Avian Pathol, 2009, 38, p 71-76 20 Bowen, TE, Sullivan, TW & Grace, OD, Effect of cupric sulfate on prophylactic efficacy of arsenic acid compounds against histomoniasis in young turkeys, Poultry Sci, 1971, 50, p 861-866 21 Brown, DM, Upcroft, JA, Edwards, MR & Upcroft, P, Anaerobic bacterial metabolism in the ancient eukaryote Giardia duodenalis, Int J Parasitol 1998, 28, p 149-164 22 Cepicka, I, Hampl, V & Kulda, J, Critical taxonomic revision of parabasalids with description of one new genus and three new species, Protist, 2010, 161, p 400-433 68 23 Clarkson, MJ, Immunological responses to Histomonas meleagridis in the turkeys and fowl, Immunity, 1963, 6, p 156-168 24 Desowitz, RS, Age as a factor influencing fatal infections of histomoniasis in chickens, J Com Path and Therap, 1951, 61, p 231-236 25 Dwyer, DM, An improved method for cultivating Histomonas meleagridis, J Parasitol, 1970, 56, p 191-192 26 Esquenet, C, De Herdt, P, De Bosschere, H, Ronsmans, S, Ducatelle, R & Van Erun, J, An outbreak of Histomonas in free-range layer hens, Avian Pathol, 2003, 32, p 305-308 27 Farr, M, Further observations on survival of the protozoan parasite Histomonas melelagridis and eggs of poultry nematodes in feces of infected birds, Cornell Vet, 1961, 51, p 3-13 28 Flowers, AI, Hall, CF & Grumbles, LC, Chemotherapy of histomoniasis of turkeys, I Value of 1-2-dimethyl-5-nitroimidazole intreatment, Avian Dis, 1965, 9, p 394406 29 Grafl, B, Liebhart, D, Windisch, M, Ibesich, & Hess, C, Seroprevalence of Histomonas meleagridis in pullets and laying hens determined by ELISA, Vet Rec 2011, 6, p 160-168 30 Graybill, HW, Smith, T, Production of fatal blackhead in turkeys by feeding embryonated eggs of Heterakis papillosa, J Exp Med, 1920, 31, p 647-655 31 Graybill, HW, Blackhead and other causes of loss of turkeys in California, U Cal Agri Exper Sta Circ, 1925, 291, p 1-14 32 Griffiths, HJ, A Handbook of Veterinary Parasitology: Domestic Animals of North America, USA: University of Minnesota Press, Minneapolis, USA, 1978, p 23-25 33 Grumbles, LC, Boney, WA & Turk, RD, Chemotherapy of enterohepatitis of turkeys, I The value of 2-amino-5-nitrothiazole inprevention and treatment, Am J Vet Res, 1952, 13, p 383-385 34 Hafec, HM, Hauck, R, Luschow, D & Mc Dougald, LR, Comparision of the sppecificity and sensitivity of PCR, nested PCR and realtime PCR for diagnosis of Histomonas meleagridis, Avian Dis, 2005, 49, p 366-370 35 Hauck, R, Fuller AL, Greif G & McDougald, LR, Evaluation of nifurtimox for potential use in control of histomoniasis in turkeys, Avian Dis, 2010, 54, p 28-32 69 36 Hauck R, Lotfi A & Hafez, HM, Factors influencing the activity of tiamulin against Histomonas meleagridis in vitro, Avian Dis, 2010, 54, p 936-938 37 Hess M, Grabensteiner, E & Liebhart, D, Rapid transmission of the protozoan parasite Histomonas meleagridis in turkeys and specific pathogen free chickens following cloacal infection with a mono-eukaryotic culture, Avian pathol 2006, 35, p 280-285 38 Huber, K, Chauve, C & Zenner, L, Detection of Histomonas meleagridis in turkeys cecal droppings by PCR amplification of the small subunit ribosomal DNA sequence, Vet Parasitol, 2005, 131, p 311-316 39 Dinev, I, Histomonosis, 2005 Available from: 40 Martinez Guerrero Jose, H, Pereda Solis Martin, E, Rosales Alferez Federico & Herrera Casio Hector, M, First Report of Heterakis gallinarum in Gould‟s Wild Turkey (Meleagris gallopavo mexicana) in Mexico, 2010, Available from: 41 McDougald, LR, Hansen, MF, Histomonas meleagridis: Effect on plasma enzymes in chickens and turkeys, Exp Parasitol, 1970, 27, p 235-239 42 McDougald, LR, Studies on Histomonas meleagridis and histomoiasis in chickens and turkeys, USA: The University of Georgia, 2002 43 McDougald, LR, Fuller, L, Blackhead disease in turkeys: direct transmission of Histomonas meleagridis from bird to bird in a laboratory model, Avian Dis, 2005, 49, p 328-331 44 Mc Dougald, LR, Molecular characterization of Histomonas meleagridis and other parabasalids in the united states using the 5.8S, ITS-1, and ITS-2 rRNA regions, USA: The University of Georgia, 2010 45 Milks, HJ, A preliminary report on some diseases of chickens, La Agr Exp Sta Bull, 1908, 108, p 1-17 46 Muller, M, Review article: the hydrogenosome, J Gen Microbiol, 1993, 139, p 2879-2889 70 47 Lui, W, Peng, J, Li, F, Sun, H, Ding, Y & He, J, Identification of Histomonas meleagridis by in vitro microculture and polymerase chain reaction, R Parasitol 2011, 1, p 1-6 48 Lund, EE & Chute, AM, Reciprocal transfer of Heterakis gallinarum Larvae between Ring-necked pheasants and Japanese quail: Effects on H gallinarum, Histomonas meleagridis, and Parahistomonas wenrichi, Proceedings of the Helm Soc Wash, 1974, 41, p 73-76 49 Ohara, T & Reid, WM, Histomoniasis in chickens Age of greatest susceptibility and pathogenicity studies, Avian Dis, 1961, 5, p 355-361 50 Permin, A & Hansen, JW, The Epidemiology, Diagnosis and Control of Poultry Parasites, Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, Italy, 1998 51 Smith, T, An infectious disease among turkeys caused by Protozoa (infectious entero-hepatitis), USDA Bur Anim Ind Bull 1895, 8, p 3-27 52 Smith, T & Graybill, HW, Blackhead in chickens and its experimental production by feeding embryonated eggs of Heterakis papillosa, J Exp Med, 1920, 32, p 143152 53 Tachezy, J, Sánchez, LB & Muller, Mitochondrial type iron-sulfur cluster assembly in the amitochondriate eukaryotes Trichomonas vaginalis and Giardia intestinalis, as indicated by the phylogeny of IscS, Mol Biol Evol, 2001, 18, p 1919-1928 54 Tyzzer, EE, The flagellate character and reclassification of the parasite producing “Blackhead” in turkeys – Histomonas meleagridis, J Parasitol, 1920, 6, p 31-124 55 Tyzzer, EE, Observations on the transimission of “blackhead” in turkeys, The common fowl as a source of infection, J Med Res, 1920, 41, p 219-237 56 Wilson, SG & Perie, NM, A study of the blood changes caused by Histomonas meleagridis in chickens, Tijdshr, Diergeneesk, 1967, 91, p 509-522 57 Windisch, M & Hess, M, Establishing an indirect sandwich enzyme-linkedimmunosorbent-assay (ELISA) for the detection of antibodies against Histomonas meleagridis from experimentally infected specific pathogen-free chickens and turkeys, Vet Parasitol, 2009, 161, p 25-30 71 58 Whitmore, JH, Sullivan, TW & Grace, D, Prophylactic efficacy of vitamin A and certain compounds against histomoniasis in turkeys, Poult Sci, 1968, 47, p 159164 59 Van der Heijden, HM, Stegeman, A & Landman, WJ, Development of a blocking – ELISA for the detection of antibodies against Histomonas meleagridis in chickens and turkeys, Vet Parasitol, 2010, 171, p 3-4 60 Venkataratnam, A & Clarkson, MJ, The effect of histomoniasis on the blood cells of the fowl, Res Vet Sci, 1963, 4, p 603-607 61 Zaragatzki, E, Hess, M, Grabensteiner, E, Abdel-Ghaffar, F, Al-Rasheid, KA & Mehlhorn, H, Light and transmission electron microscopic studies on the encystation of Histomonas meleagridis, Res Parasitol, 2010, 106, p 977-983 72 ... hệ đơn bào Histomonas meleagridis vật chủ tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu số đặc điểm sinh học đơn bào Histomonas meleagridis ký sinh gà? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Xác định đƣợc đặc điểm. .. TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA ĐƠN BÀO HISTOMONAS MELEAGRIDIS KÝ SINH TRÊN GÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành Công nghệ sinh học Mã số 60420201 Quyết... kết đề tài: ? ?Nghiên cứu số đặc điểm sinh học đơn bào Histomonas meleagridis ký sinh gà? ?? cơng trình nghiên cứu cá nhân chƣa đƣợc công bố cơng trình khoa học khác thời điểm Nha Trang, ngày tháng năm