Untitled 3460(10) 10 2018 Khoa học Kỹ thuật và Công nghệ Đặt vấn đề Các amino axit mạch nhánh (BCAA) bao gồm L valine (Val), L leucine (Leu) và L isoleucine (Ile) là các amino axit thiết yếu của cơ[.]
Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Ứng dụng phương pháp điện di mao quản kiểm soát chất lượng thực phẩm bổ sung amino axit mạch nhánh Nguyễn Thanh Đàm, Vũ Minh Tuấn, Nguyễn Mạnh Huy, Dương Hồng Anh, Phạm Hùng Việt* Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ phân tích phục vụ Kiểm định mơi trường An toàn thực phẩm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngày nhận 28/6/2018; ngày chuyển phản biện 3/7/2018; ngày nhận phản biện 30/7/2018; ngày chấp nhận đăng 6/8/2018 Tóm tắt: Các amino axit mạch nhánh (BCAA) gồm L-valine (Val), L-leucine (Leu) L-isoleucine (Ile) amino axit thiết yếu, đóng vai trò quan trọng việc phát triển bắp nên thường được bổ sung loại thực phẩm dùng cho vận động viên, người tập thể hình Nghiên cứu trình bày việc ứng dụng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) kết hợp với thiết kế thí nghiệm theo phương pháp mặt mục tiêu sử dụng mơ hình lặp tâm (RSM-CCD) nhằm tối ưu hóa quy trình phân tích BCAA thực phẩm bổ sung Các điều kiện tối ưu được xác định bao gồm dung dịch điện ly (BGE) dung dịch axit citric 1,11M, bổ sung polyethylene glycol (PEG) 2,32%, điện tách -16,9 kV thời gian bơm mẫu 45 giây Quá trình thẩm định quy trình được thực thơng qua việc xác định loạt thông số giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), hệ số tương quan đường chuẩn (R2), độ độ chụm Quy trình sau được áp dụng để phân tích mẫu thật, kết cho thấy phù hợp tương đối tốt hàm lượng BCAA đo được CE-C4D với thông tin đưa từ nhà sản xuất Từ khóa: amino axit mạch nhánh, dinh dưỡng thể chất, điện di mao quản, kế hoạch hóa thực nghiệm Chỉ số phân loại: 2.4 Đặt vấn đề Các amino axit mạch nhánh (BCAA) bao gồm L-valine (Val), L-leucine (Leu) L-isoleucine (Ile) amino axit thiết yếu thể, thường sử dụng nhiều sản xuất dược phẩm [1] Trong lĩnh vực thực phẩm, BCAA sử dụng rộng rãi đồ uống thể thao thực phẩm dinh dưỡng, bao gồm thực phẩm bổ sung dùng cho vận động viên [2] Trong thời gian gần đây, nước ta, xu hướng tập thể hình nhằm nâng cao sức khoẻ cải thiện vóc dáng phát triển, đặc biệt giới trẻ Với lợi ích việc trì xây dựng bắp, loại thực phẩm bổ sung BCAA ưu chuộng người tập thể hình Rất nhiều sản phẩm bổ sung BCAA có mặt thị trường, bao gồm dạng viên nén, viên nang, dạng bột… Cùng với phát triển thị trường tiêu thụ, loại hàng giả, hàng nhái bắt đầu xuất Bên cạnh đó, lực người tiêu dùng nước chưa thật cao, công tác quản lý thị trường chưa thật tốt Thực trạng đặt yêu cầu cần thiết phải có biện pháp nhằm kiểm soát chất lượng * mặt hàng Việc xác minh hàng giả, hàng nhái, biện pháp quản lý cịn thực thông qua xác định hàm lượng thành phần sản phẩm (như hàm lượng Val, Leu Ile) Tuy vậy, nước chưa có cơng bố xác định hàm lượng BCAA thực phẩm Trên giới có số nghiên cứu xác định hàm lượng amino axit thực phẩm nói chung thực phẩm bổ sung nói riêng Omar cộng (2017) dùng thiết bị điện di mao quản (CE) kết hợp detector UV (CE-UV) để xác định amino axit tự (alanine, asparagine, glutamine, proline, serine valine) thực phẩm với khoảng tuyến tính 2,5-40 mg/l [3] Shigeki Akamatsu cộng (2013) phân tích đồng thời 16 amino axit tự (bao gồm valine, tổng leucine isoleucine) thực phẩm chức sữa ong chúa với LOD từ 0,61-10,5 µg/g CE ghép nối khối phổ (CEMS) [4] Dazhong Shen cộng (2013) sử dụng CE kết hợp detector độ dẫn không tiếp xúc cộng hưởng vi phân (CE-DRC4D) để phân tích 10 amino axit (bao gồm Tác giả liên hệ: Email: vietph@vnu.edu.vn 60(10) 10.2018 34 Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Application of capillary electrophoresis in quality control of branched-chain amino acid supplements Thanh Dam Nguyen, Minh Tuan Vu, Manh Huy Nguyen, Hong Anh Duong, Hung Viet Pham* VNU Key Laboratory of Analytical Technology for Environmental Quality and Food Safety Control (KLATEFOS), VNU University of Science, Vietnam National University (VNU), Hanoi Received 28 June 2018; accepted August 2018 Abstract: Branched-chain amino acids (BCAAs) including L-valine (Val), L-leucine (Leu) and L-isoleucine (Ile) are essential amino acids, which play an important role in muscle development, and are often added in food for athletes or bodybuilders This study presents the application of capillary electrophoresis using a contactless conductivity detector (CE-C4D) combined with the experimental design using the response surface methodology with central composite design (RSM-CCD) to optimize the analytical process of BCAAs in food supplements The optimum conditions to be determined include the background electrolyte (BGE) as 1.11M citric acid solution added with 2.32% of PEG (m/v), -16.9 kV of applied voltage, and 45 seconds of injection time Method validation is performed by defining limit of detection (LOD), limit of quantitation (LOQ), linearity (R2), trueness, and precision The procedure was used to analyse four of real samples, which showed a quite good fit between the BCAAs content measured with CE-C4D and the information provided by the manufacturers Keywords: branched-chain amino acids, capillary electrophoresis, design of experiments, physical nutrition Classification number: 2.4 60(10) 10.2018 valine leucine) với LOD từ 0,1-0,4 µM [5] Trong nghiên cứu trên, nghiên cứu Akamatsu bao gồm amino axit mạch ngắn, khơng phân biệt leucine isoleucine, kết đưa dạng hàm lượng tổng amino axit Để tách biệt leucine isoleucine, Ting Wang cộng (2015) thực dẫn xuất hoá n-propyl clorofomat sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối khối phổ lần (HPLC-MS/ MS) [6] Đây biện pháp tốn khó thực hiện, yêu cầu trang thiết bị đắt tiền kỹ thuật cao Bên cạnh phương pháp sắc ký truyền thống vốn có chi phí cao, CE với ưu điểm “xanh” (ít sử dụng dung mơi hữu độc hại), chi phí thấp phương pháp nhiều tiềm phân tích thực phẩm nói chung kiểm sốt chất lượng thực phẩm bổ sung BCAA nói riêng Ứng dụng CE phân tích hàm lượng BCAA, thơng qua kiểm sốt chất lượng mặt hàng thực phẩm bổ sung BCAA hướng mới, thiết thực khả thi Bài báo trình bày kết đạt sử dụng CE-C4D kết hợp với kế hoạch hóa thực nghiệm theo phương pháp mặt mục tiêu sử dụng mơ hình lặp tâm (RSM-CCD) để phát triển quy trình phân tích kiểm định hàm lượng BCAA thực phẩm bổ sung Vật liệu phương pháp nghiên cứu Hóa chất Tất hóa chất sử dụng nghiên cứu có độ tinh khiết phân tích đặt mua từ Sigma-Aldrich, Đức Tokyo Chemiscal Industry, Nhật Bản, ngoại trừ axit lactic (Lac) từ Guangdong, Trung Quốc Dung dịch chuẩn gốc riêng lẻ nồng độ 1000 mg/l L-Valine (Val), L-Leucine (Leu) L-Isoleucine (Ile) sử dụng để pha chế dung dịch chuẩn hỗn hợp chất phân tích Các hóa chất sử dụng để chuẩn bị dung dịch điện ly (BGE) bao gồm: axit acetic, axit lactic, axit citric, axit succinic polyethylene glycol (PEG) 10000 Thiết bị Hệ điện di mao quản kênh vận hành tay sử dụng tất thí nghiệm Thiết bị bao gồm nguồn cao ±30 kV (Spellman, Anh), ghi liệu e-corder (eDAQ, Úc) detector C4D (eDAQ, Úc) Mao quản sử dụng thiết bị mao quản silica nóng chảy (BGB Analytik AG, Switzerland) có đường kính 25 µm, chiều dài tổng 60 cm chiều dài hiệu dụng 49 cm Trước sử dụng lần đầu có thay đổi BGE, mao quản xử lý cách đẩy dung dịch NaOH 1M qua 10 phút, sau tới nước deion cuối dung dịch BGE Nước deion tạo từ thiết bị Simplicity UV (Millipore, USA) sử dụng để pha chế dung dịch pha loãng mẫu 35 Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Lấy mẫu xử lý mẫu Trong nghiên cứu này, sản phẩm thực phẩm bổ sung BCAA dạng bột thu thập từ cửa hàng chuyên cung cấp sản phẩm cho người tập gym địa bàn thành phố Hà Nội Các sản phẩm ký hiệu sau: M1 (Xtend BCAA 30 servings), M2 (Xtend Go BCAA 30 servings), M3 (On-Gold Standard BCAA 30 servings) M4 (USN BCAA 30 servings) Từ sản phẩm này, lấy xác 0,5 gam mẫu, chuyển vào bình định mức 50 ml, thêm nước deion đến vạch lắc kỹ Pha loãng (125 lần) dung dịch thu với nước deion lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,2 µm Sau đó, ml dung dịch sau lọc sử dụng để bơm vào hệ CE-C4D Để tránh sai số mắc phải trộn lẫn không đồng sản phẩm (khối lượng sản phẩm lớn, khối lượng lấy mẫu tương đối nhỏ), sản phẩm lấy mẫu lần, lần phân tích lặp lần, kết thu giá trị trung bình lần lặp khác Dung dịch sau hòa tan (nhưng chưa pha loãng) lần lấy mẫu sản phẩm (ký hiệu M1.1, M2.1, M3.1 M4.1 tương ứng) phân tích đồng thời phương pháp CE-C4D HPLC-DAD Khảo sát điều kiện phân tích ban đầu Trước tiến hành tối ưu hóa mơ hình RSMCCD, khảo sát ban đầu thực cách tối ưu nhân tố đơn lẻ nhằm xác định điểm tâm mơ khoảng biến thiên yếu tố cho phù hợp Các điều kiện khảo sát bao gồm: thành phần BGE, nồng độ BGE, điện tách thời gian bơm mẫu Đối với thành phần BGE, dung dịch axit hai nồng độ 0,5M 1,0M khảo sát, bao gồm: axit lactic, axit succinic axit citric, dung dịch axit bổ sung PEG nồng độ 2% (m/v) nhằm loại bỏ tương tác nhóm silanol (-Si-OH) thành mao quản với amino axit Sau lựa chọn thành phần BGE phù hợp, yếu tố nồng độ axit (0,1÷1,5M), nồng độ chất bổ trợ PEG (1÷4%), điện tách (-12÷-18 kV) thời gian bơm mẫu (10÷60 giây) khảo sát nhằm tìm điều kiện phân tích tối ưu ban đầu Các thông số sử dụng để đánh giá điều kiện phân tích bao gồm diện tích peak độ phân giải hai peak cạnh Ile Leu Tối ưu hóa điều kiện phân tích dựa RSM-CCD Điều kiện phân tích tối ưu xác định cách xác cách sử dụng mơ hình RSM-CCD với điểm tâm điều kiện ban đầu tìm Mơ hình xem xét ảnh hưởng bốn yếu tố ảnh hưởng: nồng độ BGE (0,5÷1,5M), nồng độ PEG (1÷3%), điện tách 60(10) 10.2018 (-14÷-18 kV) thời gian bơm mẫu (40÷60 giây); yếu tố chia làm mức độ (-2, -1, 0, +1, +2) Theo đó, có tất 30 thí nghiệm cần tiến hành, bao gồm 16 thí nghiệm thuộc thiết kế yếu tố tồn phần, thí nghiệm trục thí nghiệm tâm Hàm mục tiêu lựa chọn độ phân giải hai peak Ile Leu với kỳ vọng độ phân giải lớn tốt Bên cạnh đó, thời gian phân tích (tính theo thời gian xuất peak cuối cùng, Leu) sử dụng hàm mục tiêu thứ hai (tầm quan trọng thấp hơn) với yêu cầu thời gian di chuyển Leu nằm khoảng 900-1200 giây Kết thu từ mơ hình đánh giá thông qua p-value F-value kiểm định F-test Lack of fit test, đồng thời giá trị hàm mục tiêu điều kiện phân tích tối ưu mà mơ hình dự đốn kiểm tra để đảm bảo dự đoán mơ hình phù hợp với thực tế Thẩm định phương pháp Phương pháp phân tích đánh giá thông qua loạt thông số: giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ tuyến tính (R2), khoảng tuyến tính, độ độ chụm Độ tuyến tính khoảng tuyến tính đánh giá thơng qua đường chuẩn thu phân tích lặp lại ba lần ba chất phân tích mức nồng độ 5; 10; 15; 20 25 mg/l Độ chụm xác định độ lặp lại (trong ngày) độ tái lặp (giữa ngày khác nhau) dạng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện tích peak thời gian di chuyển Độ lặp lại (n=10) thu từ kết phân tích ngày điều kiện tối ưu, sử dụng dung dịch chuẩn nồng độ 10 mg/l chất phân tích Độ tái lặp xác định với dung dịch thực 10 ngày liên tiếp Độ xác định thông qua hiệu suất thu hồi (trên nước deion mẫu thật) hai mức nồng độ 7,5 17,5 mg/l, đồng thời so sánh kết phân tích số mẫu CE-C4D với phương pháp HPLC-DAD Các mẫu chuẩn bị đề cập phần xử lý mẫu Kết bàn luận Kết khảo sát điều kiện phân tích ban đầu Kết khảo sát thành phần BGE: Trong dung dịch trung tính, BCAA (có điểm đẳng điện pI~6,0) tồn chủ yếu dạng muối nội khơng mang điện Để phân tích CE-C4D, điều kiện tiên cần chuyển BCAA dạng cation (pHpKa2~9,6) Tuy nhiên, việc phân tích điều kiện pH cao gặp nhiều khó khăn dịng điện di thẩm thấu (EOF) lớn, 36 Khoa học Kỹ thuật Công nghệ làm cản trở di chuyển anion cần phân tích Vì vậy, nghiên cứu này, BGE có mơi trường axit sử dụng, bao gồm axit lactic, axit succinic axit citric, loại BGE khảo sát hai nồng độ 0,5M 1,0M Để hạn chế tương tác amino axit với nhóm silanol (-Si-OH) bề mặt thành mao quản, dung dịch axit bổ sung PEG nồng độ 2% (m/v) Các điều kiện phân tích khác giữ cố định, bao gồm: điện tách -15 kV, thời gian bơm mẫu 30 giây Hình Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ BGE tới diện tích peak độ phân giải Ký hiệu hình: S_Val, S_Ile, S_Leu diện tích peak Valine, Isoleucine Leucine; Rs_Ile/Leu độ phân giải hai peak Isoleucine Leucine Kết khảo sát nồng độ PEG: Hình Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng thành phần BGE tới phân tách các chất phân tích Kết thu cho thấy, việc sử dụng BGE có mơi trường axit thích hợp tất dung dịch axit khảo sát cho tín hiệu ba đối tượng phân tích (hình 1) BGE với thành phần axit lactic cho diện tích peak lớn độ phân giải hai peak Ile Leu lại nhỏ Trong hai axit lại, axit citric cho độ phân giải Ile/Leu lớn hai nồng độ, đó, axit citric lựa chọn làm BGE để phân tích BCAA Kết khảo sát nồng độ BGE: Nồng độ axit citric BGE sau tiến hành khảo sát khoảng 0,1-1,5M nhằm xác định nồng độ BGE thích hợp Các điều kiện khác giữ cố định thí nghiệm khảo sát thành phần BGE Hình thể biến đổi diện tích peak chất phân tích độ phân giải Ile/Leu thay đổi nồng độ axit citric Ở nồng độ citric cao hơn, tách chất diễn tốt độ phân giải Ile/Leu tăng lên, thay đổi không lớn Ngược lại, tăng nồng độ axit citric, diện tích peak có xu hướng giảm dần giảm nhanh nồng độ thay đổi từ 1,0M tới 1,5M Lý biến đổi nồng độ lớn, độ dẫn BGE cao, làm cho chênh lệch tín hiệu chất phân tích giảm xuống Vì vậy, nồng độ 1,0M axit citric lựa chọn điều kiện thích hợp điều kiện này, diện tích peak (4 mV.s) độ phân giải tốt (1,4) so với điều kiện lại 60(10) 10.2018 Các amino axit nói chung BCAA nói riêng có khả tạo liên kết hydro với nhóm -Si-OH tự thành mao quản, làm cản trở khả tách chất CE Nghiên cứu sử dụng PEG nhằm loại bỏ ảnh hưởng nêu nhóm silanol Nồng độ PEG (m/v) khảo sát khoảng 1-4 %, điều kiện phân tích khác giữ khơng đổi khảo sát nồng độ BGE Kết hình cho thấy, nồng độ PEG ảnh hưởng tới độ lớn diện tích peak lẫn độ phân giải Ile/Leu Diện tích peak ba chất tăng tăng nồng độ PEG từ 1% lên 2%, sau giảm dần tiếp tục tăng PEG Xu hướng diễn độ Hình Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ PEG tới diện tích peak độ phân giải Ký hiệu hình: S_Val, S_Ile, S_Leu diện tích peak Valine, Isoleucine Leucine; Rs_Ile/Leu độ phân giải hai peak Isoleucine Leucine 37 Khoa học Kỹ thuật Công nghệ phân giải Ile/Leu Bên cạnh đó, có mặt PEG cịn làm tăng độ nhớt BGE làm giảm cường độ dòng EOF, dẫn đến thời gian di chuyển chất phân tích tăng lên Tương tự với thí nghiệm khảo sát nồng độ axit citric, điều kiện PEG 2% lựa chọn đáp ứng diện tích peak độ phân giải, đồng thời thời gian phân tích khơng q dài Kết khảo sát điện thế tách: Điện tách thời gian bơm mẫu hai thơng số hoạt động thiết bị đóng vai trò quan trọng phân tách chất CE cần khảo sát cách đầy đủ Ở điện tách có độ lớn 12 kV, thời gian phân tích thường dài, đó, độ lớn điện tách cao 18 kV thiếu ổn định gây nhiễu lớn Trong nghiên cứu này, điện tách khảo sát khoảng -12 kV tới -18 kV nhằm hạn chế ảnh hưởng trên, điều kiện khác giữ cố định Theo xu hướng chung, tăng điện tách, độ linh động ion lớn hơn, chúng di chuyển nhanh hơn, kéo theo thời gian di chuyển ngắn hơn, diện tích peak giảm xuống độ phân giải tăng lên Các biến đổi thấy hình Mặc dù điện -18 kV có độ phân giải lớn hai peak cạnh Ile Leu, điều kiện -16 kV lựa chọn có độ phân giải tốt (1,4) đồng thời đường ổn định tính Giữa thời gian bơm mẫu 50 giây 60 giây, thay đổi diện tích peak độ phân giải Ile/ Leu không nhiều, cho thấy lượng mẫu bơm vào mao quản gần bão hịa Vì vậy, giá trị 50 giây lựa chọn làm điều kiện thời gian bơm mẫu Kết từ kế hoạch hóa thực nghiệm Sau xác định điều kiện phân tích ban đầu, việc tối ưu hóa tiến hành kế hoạch hóa thực nghiệm với mơ hình RSM-CCD nhằm đạt điều kiện phân tích xác Điều kiện phân tích tìm thấy ban đầu (BGE axit citric 1,0M bổ sung PEG 2%, điện tách -16 kV thời gian bơm mẫu 50 giây) sử dụng làm tâm mơ hình Đồng thời, qua khảo sát trên, khoảng biến đổi yếu tố ảnh hưởng xác định: nồng độ axit citric (X1) 0,5÷1,5M; nồng độ PEG (X2) 1,0÷3,0%; điện tách (X3) -14÷-18 kV thời gian bơm mẫu (X4) 40÷60 giây Mục tiêu lựa chọn độ phân giải hai peak gần Ile Leu (Y1) với kỳ vọng giá trị Y1 lớn tốt Ngoài ra, để đáp ứng nhu cầu phân tích thực tế, thời gian phân tích khơng nên q dài (