M� Đ�U Studocu is not sponsored or endorsed by any college or university FILE 20220516 150231 Tiểu luận Phương pháp PCR và ứng dụng 972830 Nhập môn khoa học xã hội nhân văn (Đại học Sư phạm Hà Nội) St[.]
lOMoARcPSD|22097652 FILE 20220516 150231 Tiểu-luận -Phương-pháp-PCR-và-ứng-dụng 972830 Nhập môn khoa học xã hội-nhân văn (Đại học Sư phạm Hà Nội) Studocu is not sponsored or endorsed by any college or university Downloaded by Nguy?n Hoàng Ph??ng (solo999xxx@gmail.com) lOMoARcPSD|22097652 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HA NỘI KHOA SINH HỌC BÀI TIỂU LUẬN PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Lý luận phương pháp dạy học Sinh học Người hướng dẫn: GS.TS Nguyễn Thành Đạt PGS.TS Đặng Hữu Lanh Sinh viên thực hiện: Cao Thị Dung Lớp: Sinh CHK24 Downloaded by Nguy?n Hoàng Ph??ng (solo999xxx@gmail.com) lOMoARcPSD|22097652 Hà Nội2015 Downloaded by Nguy?n Hoàng Ph??ng (solo999xxx@gmail.com) lOMoARcPSD|22097652 Downloaded by Nguy?n Hoàng Ph??ng (solo999xxx@gmail.com) lOMoARcPSD|22097652 Downloaded by Nguy?n Hoàng Ph??ng (solo999xxx@gmail.com) lOMoARcPSD|22097652 MỞ ĐẦU Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR) Kary Mullis phát năm 1985 Đây phương pháp invitro để nhân nhanh đoạn AND đó, có độ nhạy cao mà cần khối lượng mẫu ban đầu hạn chế Bản thân kỹ thuật mở rộng trực tiếp tính chất q trình tái AND Nhưng sử dụng theo nhiều cách khác để làm cho việc tách dòng thao tác với AND dễ dàng hiệu PCR kỹ thuật quan trọng Sinh học phân tử Việc sử dụng kỹ thuật PCR lĩnh vực AND tái tổ hợp tạo bước tiến mang tính cách mạng di truyền học phân tử nói riêng với sinh học phân tử nói chung, nhờ việc cho phép phân lập, xác định gene sâu nghiên cứu chức biểu gen trình phát triển, phản ứng gen điều kiện mơi trường Nó cho phép ta tiến hành nghiên cứu mà trước khơng có khả thực Kỹ thuật ứng dụng nhiều lĩnh vực sinh học phân tử, chẩn đoán bệnh di truyền người, di truyền quần thể, phân tích pháp y, … Việc triển khai ứng dụng sinh học phân tử thường vấp phải trở ngại số lượng vật chất di truyền cần có Các phương pháp tạo dịng invitro biết giải vấn đề số lượng lại đòi hỏi thao tác phức tạp thời gian dài Sự đời nhiều phương pháp khuếch đại invitro có chọn lọc, số tiếng phải kể đến phương pháp PCR đảo lộn nguyên tắc việc tạo dòng cổ điển, mở triển vọng ứng dụng to lớn Chính tơi định nghiên cứu đề tài “Phương pháp PCR ứng dụng” Đề tài nghiên cứu nhằm mục đích tìm hiểu rõ nguyên tắc, tiêu ảnh hưởng, ứng dụng hạn chế Downloaded by Nguy?n Hoàng Ph??ng (solo999xxx@gmail.com) lOMoARcPSD|22097652 phương pháp PCR Từ có kiến thức phục vụ cho việc nghiên cứu đề tài luận văn việc tiến hành thí nghiệm phịng thí nghiệm sau Downloaded by Nguy?n Hoàng Ph??ng (solo999xxx@gmail.com) lOMoARcPSD|22097652 Để đạt điều đó, đề tài sử dụng phương pháp nghiên cứu phương pháp thu thập, xử lý thơng tin, phương pháp phân tích, tổng hợp, hệ thống hóa thơng tin… Ngồi phần Mở đầu, Kết luận, tiểu luận bao gồm nội dung sau: Sự phát phương pháp PCR Phương pháp PCR ứng dụng Downloaded by Nguy?n Hoàng Ph??ng (solo999xxx@gmail.com) lOMoARcPSD|22097652 SỰ RA ĐỜI CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR 1.1 Khái niệm PCR chữ viết tắt cụm từ Polymerase Chain Reaction, gọi “phản ứng chuỗi trùng hợp” hay “phản ứng khuếch đại gen” PCR kỹ thuật phổ biến sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo nhiều sao) đoạn DNA mà không cần sử dụng sinh vật sống E coli hay nấm men [7] Một đoạn DNA nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần mà không cần đưa vào tế bào vi khuẩn [3] Điều xảy phản ứng tổng hợp invitro sử dụng DNA polymerase oligonucleotide (các mồi – primers) Đó kết tuyệt vời phản ứng PCR Nhờ phản ứng này, đoạn DNA vùng genome khuếch đại lên nhiều lần trình tự nucleotide hai đầu đoạn mạch DNA biết Dựa vào trình tự đó, cặp oligonucleotide tổng hợp nhân tạo, mồi oligo tạo liên kết với sợi đơn Chúng sử dụng làm mồi để tổng hợp DNA invitro nhờ enzyme DNA polymerase Đặc biệt phản ứng PCR địi hỏi lượng DNA ban đầu làm khn nhỏ (cỡ 103μg) [3] Như vậy, PCR phương pháp invitro để tổng hợp khuếch đại đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu hai mồi oligonucleotide gắn vào hai sợi đơi đoạn DNA đích với tham gia DNA polymerase 1.2 Lịch sử phương pháp PCR Vào năm 1985, đêm trăng sáng tiểu bang California, đường lái xe dọc theo bờ Downloaded by Nguy?n Hoàng Ph??ng (solo999xxx@gmail.com) lOMoARcPSD|22097652 biển, ý tưởng xuất đầu nhà sinh hóa học bình thường, làm việc phịng thí nghiệm bình thường Ý tưởng trở thành thực, thử nghiệm PCR, làm đại cách mạng sinh học phân tử đưa tác nó, K.B Mullis, đến giải Nobel danh giá giả Phương pháp chạy PCR Kary Mullis phát minh, ông đoạt giải Nobel Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, sau năm ông đưa ý tưởng Ý kiến Mullis phát triển quy trình mà DNA nhân lên nhiều lần cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ chép enzyme DNA polymerase [7] DNA polymerase có tự nhiên sinh vật sống, nơi mà thực chức nhân DNA tế bào phân chia Nó làm việc cách nối với sợi DNA tạo sợi bổ sung Theo quy trình PCR gốc Mullis, enzyme phản ứng nhân DNA thực ống nghiệm (invitro) Sợi DNA đôi bị tách thành sợi đơn đun nóng 96 °C Tuy nhiên, nhiệt độ DNA polymerase bị phá hủy cần bổ sung enzyme sau giai đoạn nung nóng chu kỳ Quy trình PCR gốc Mullis khơng có hiệu cao nhiều thời gian, cần lượng lớn DNA polymerase, phải liên tục lưu ý suốt trình PCR Sau đó, quy trình gốc phát triển cách dùng DNA Polymerase lấy từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống mạch nước phun nhiệt độ 110 °C DNA polymerase từ sinh vật thermostable (ổn định nhiệt độ cao) dùng PCR khơng bị phá vỡ hỗn hợp nung nóng để tách sợi DNA [7] Từ đó, không cần phải thêm DNApolymerase vào chu kỳ, trình chép DNA đơn giản tự động Một DNApolymerase chịu nhiệt phân lập từ Thermus aquaticus gọi Taq Taq polymerase dùng rộng rãi thực nghiệm PCR (5/2004) Nhược điểm Taq nhầm lẫn q trình chép DNA, dẫn đến đột biến chuỗi DNA, thiếu tính sửa sai exonuclease 3’5’ Các polymerase Pwo hay Pfu, Downloaded by Nguy?n Hoàng Ph??ng (solo999xxx@gmail.com) lOMoARcPSD|22097652 dung dịch đặt mẫu cịn chứa chất thị tích điện âm Chất thị di chuyển với DNA giúp cho dễ dàng ước lượng di chuyển DNA gel Chất thị thường dùng Xylene cyanol Bromophenol blue Chúng di chuyển với phân tử DNA có chiều dài tương ứng 5000bp 300bp Đệm điện di: Đệm điện di giúp ổn định điều kiện môi trường, cho phép trình di chuyển DNA ổn định suốt q trình điện di Có vài loại đệm điện di thường dùng phân tích điện di agarose như: Tris acetate EDTA (TAE), Tris/Borate/EDTA (TBE) Khả đệm dung dịch đệm TAE thấp so với TBE Tuy nhiên, TAE lại cho phép phân tách tốt đoạn DNA lớn Điều đồng nghĩa với việc phải dùng điện thấp thời gian điện di nhiều Kết thúc trình điện di, gel đặt tác động tia UV, đoạn DNA sản phẩm PCR sau phân tách theo kích thước hiển thị dạng băng vạch màu vàng sáng vị trí khác tương ứng với kích thước chiều dài chúng Hình 4: Phân tích sản phẩm sau chụp UV Ethidium brommide có sẵn gel chèn vào base nitơ phân tử DNA dẫn đến chúng bám vào phần trung tâm phân tử DNA Sự Downloaded by Nguy?n Hoàng Ph??ng (solo999xxx@gmail.com) lOMoARcPSD|22097652 phát sáng phức hợp DNAEthidium bromide phát chịu tác động tia UV 2.4 Các tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR Một phản ứng PCR điển hình bao gồm thành phần sau: + DNA (0,010,1μg) + Mồi (20pmol) + Mồi (2pmol) + TrisHCl (20Mm; Ph 8,0) + MgCl2 (2mM) + KCl (25mM) KCl (10mM) (NH4)2SO4 (10mM) + Deoxynucleotide triphosphat (50μg loại dATP, dGTP, dCTP, dTTP) + DNA polymerase chịu nhiệt (2 đơn vị) + Tổng thể tích phản ứng 50100μl 2.4.1.DNA khuôn Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy DNA tinh nhiều kỹ thuật chẩn đoán PCR đạt kết tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng có khuynh hướng giảm (1μg xuống 100ng) với việc sử dụng polymerase cho hiệu cao Hơn việc giảm lượng mẫu ban đầu hạn chế khuếch đại “ký sinh” tạo sản phẩm phụ không mong muốn Gần loại DNA nào, dù mạch thẳng, mạch vịng, DNA plasmid, DNA hệ gen, cDNA,… làm khuôn cho phản ứng PCR DNA láy từ nguồn không quan trọng, yêu cầu vị trí gắn mồi trình tự chúng cịn nguyên vẹn Đã có mẫu DNA mà tuổi đến 7000 năm sử dụng thành công phản ứng PCR 2.4.2.Mồi nhiệt độ lai Đoạn mồi đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước vài chục base (1830), bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu đoạn kết thúc chuỗi DNA đích chuỗi biens tính thành sợi đơn Trong thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trị chính: Một định nên tính đặc Downloaded by Nguy?n Hồng Ph??ng (solo999xxx@gmail.com) ...lOMoARcPSD|22097652 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HA NỘI KHOA SINH HỌC BÀI TIỂU LUẬN PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Lý luận phương pháp dạy học Sinh học Người hướng dẫn: GS.TS Nguyễn Thành Đạt... việc nghiên cứu đề tài luận văn việc tiến hành thí nghiệm phịng thí nghiệm sau Downloaded by Nguy?n Hồng Ph??ng (solo999xxx@gmail.com) lOMoARcPSD|22097652 Để đạt điều đó, đề tài sử dụng phương... phương pháp nghiên cứu phương pháp thu thập, xử lý thông tin, phương pháp phân tích, tổng hợp, hệ thống hóa thơng tin… Ngồi phần Mở đầu, Kết luận, tiểu luận bao gồm nội dung sau: Sự phát phương pháp