Chương 2: KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT docx

Nuơi cấy mơ tissue culture là một nhánh của sinh học, trong đĩ, mơ hay tế bào được nuơi cấy nhân tạo trong một mơi trường cĩ kiểm sốt.. Ý NGHĨA CỦA VÔ TRÙNG TRONG VI NHÂN GIỐNG THỰC V

Chương 2:

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

THỰC VẬT

Nuơi cấy mơ (tissue

culture) là một nhánh của sinh

học, trong đĩ, mơ hay tế bào

được nuơi cấy nhân tạo trong

một mơi trường cĩ kiểm sốt

Nhân giống in vitro thực

vật hay vi nhân giống thực vật

(micropropagation) là phương

thức nuôi cấy tế bào, cơ quan

thực vật trong ống nghiệm, bình

nuơi cấy, ở điều kiện vô trùng,

nhằm mục đích nhân nhanh

giống, mang lại hiệu quả kinh tế

cao

KHÁI NIỆM

Gồm 05 điểm nổi bật:

- Nhân nhanh các giống cây: hệ số nhân giống cao

- Cây giống sau khi nuôi cấy có sự đồng nhất về mặt

di truyền

- Loại sạch bệnh cây, đảm bảo các cây giống khỏe mạnh, có sức tăng trưởng nhanh

- Chủ động nguồn giống cây trồng cho sản xuất

- Trẻ hóa vật liệu giống

ƯU ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP

VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT

Các yếu tố đảm bảo sự thành công trong nuôi

cấy mô thực vật là gì?

2.1 Bảo đảm điều kiện vô trùng

2.2 Chọn đúng môi trường và chuẩn bị

2.3 Chọn mô cấy thích hợp, xử lý mô

cấy thích hợp trước và sau khi cấy

2.1 BẢO ĐẢM ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG

Ý NGHĨA CỦA VÔ TRÙNG TRONG VI

NHÂN GIỐNG THỰC VẬT

Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin, là môi trường thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển

Tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật Nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thí nghiệm chắc chắn phải loại bỏ

Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy, đòi hỏi chúng ta

phải thực hiện các yêu cầu:

- Vô trùng mô cấy

- Vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy

- Trong thao tác nuôi cấy cần tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi trường

VÔ TRÙNG MÔ CẤY

Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài

mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm

Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, diệt khuẩn Hiệu lực diệt nấm, diệt khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập trên bề mặt mô cấy

Tác nhân vô trùng Nồng độ (%)Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả

Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt

nấm, diệt khuẩn có thể dùng để xử lý mô cấy:

Lưu ý:

Trong quá trình xử lý mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt nấm, khuẩn

Với các bộ phận có bám nhiều cát, bụi trước khi

xử lý cần rửa sạch bằng xà phòng và nước máy

Sau khi xử lý xong, mô cấy được rửa sạch nhiều lần bằng nước cất vô trùng và loại bỏ những phần bị hoại tử trước khi đặt mô cấy lên môi trường

Quy trình khử trùng mẫu thực sinh:

Mẫu thực sinh Rửa kĩ bằng xà phòng và nước máy

Cho vào bình tam giác

Rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần

Tiếp tục ngâm trong dung dịch diệt khuẩn (khoảng 15 - 20 phút) với 05 giọt Tween 80

Rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần Cắt bỏ những phần mô bị tác nhân vô trùng làm hoại tử (trắng)

Đặt lên môi trường nuôi cấy

VÔ TRÙNG DỤNG CỤ THỦY TINH,

MÔI TRƯỜNG VÀ NÚT ĐẬY

Dụng cụ thủy tinh, môi

trường và nút đậy của chai lọ

hay dụng cụ thủy tinh được vô

trùng bằng cách hấp khử trùng ở

nhiệt độ 1210C, áp suất 1atm

trong thời gian 15 – 20 phút

oC oF Tác động đến vi sinh vật

121 250 Nhiệt hơi nước tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật và bào tử (15 – 20 phút)

116 240 Nhiệt hơi nước tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật và bào tử (30 – 40 phút)

110 230 Nhiệt hơi nước tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật và bào tử (60 – 80 phút)

100 212 Nhiệt độ sôi của nước có khả năng tiêu diệt tế bào dinh dưỡng nhưng không tiêu diệt được bào tử

82 – 93 179 – 200 Tiêu diệt hoàn toàn tế bào đang phát triển vi khuẩn, nấm men, nấm mốc

62 – 82 151 – 180 Các vi sinh vật ưa nhiệt vẫn phát triển được

60 – 77 140 – 171 Pasteur hóa, tiêu diệt phần lớn vi sinh vật gây bệnh trong sữa, nước quả, trừ bào tử của chúng

16 – 38 61 – 100 Các loài nấm men, nấm sợi, vi khuẩn phát triển mạnh

10 – 16 50 – 61 Các loài ưa lạnh phát triển mạnh

0 32 Các loài vi sinh vật ngừng phát triển

– 18 0 Vi khuẩn ở trạng thái chết

– 251 – 420 Rất nhiều loài vi sinh vật không bị chết trong hydrogen lỏng

Buồng cấy: là buồng có diện tích nhỏ, có hai lớp cửa Buồng cấy cần lát gạch tráng men, tường sơn có thể lau rửa được Trước mỗi lần sử dụng, buồng cấy cần được xử lý vơ trùng sơ bộ

Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều cần phải được khử trùng: áo chồng, mũ, khẩu trang, dao kéo, kẹp, giấy bọc, bông, ống nghiệm, v.v

Tủ cấy: là loại tủ có thiết bị thổi không khí vô trùng vào vị trí thao tác cấy

KỸ THUẬT CẤY VƠ TRÙNG

• Vô trùng dụng cụ trong nuôi cấy

• Rữa tay bằng xà phòng và nước trước khi cấy

• Lau cồn mặt bàn tủ cấy vô trùng

• Dùng ngọn lửa đèn cồn để vô trùng pince, dao cấy, kéo,

• Tránh quơ tay ngang qua các dụng cụ vô trùng trong

2.2 CHỌN ĐÚNG MÔI TRƯỜNG VÀ CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG ĐÚNG CÁCH

Thành phần của môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan nuôi cấy

Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trường sử dụng cũng khác nhau

Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có hàng trăm loại môi trường khác nhau Tuy nhiên có thể chia chúng thành 3 nhóm:

- Môi trường nghèo dinh dưỡng: điển hình là môi trường Knop, môi trường Knudson C;

- Môi trường trung bình: điển hình là môi trường môi trường White; môi trườnng B5 của Gamborg;

- Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình là môi trường Murashige – Skoog (môi trường MS)

PHÂN LOẠI MƠI TRƯỜNG NUƠI CẤY

Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy:

• Khoáng đa lượng và vi lượng

KHỐNG ĐA LƯỢNG

Nguồn nitơ: gồm các dạng: amon, nitrat và amino acid (canxi nitrat, kali nitrat, natri nitrat hay amon nitrat (NH4NO3), amon sulphat)

Nguồn phospho: thường dùng nhất là NaH2PO4.7H2O và KH2PO4 Nồng độ phospho trong môi trường biến thiên từ 0,15 đến 4,00mM, thường dùng khoảng 1,00mM

Nguồn kali: kali nitrat, kali chlorua, kali phosphat Nồng độ K+ trong môi trường biến thiên từ 2 đến 25 mM, trung bình khoảng 10mM

KHỐNG ĐA LƯỢNG

Nguồn canxi: muối canxi nitrat, canxi chlorua Nồng độ Ca2+ trong môi trường từ 1,0 đến 3,5mM, trung bình là 2,0mM

Nguồn magiê: magiê sunphat, với nồng độ trong môi trường khoảng 0,5 – 3,0mM

Nguồn sắt: Những môi trường cổ điển dùng sắt ở dạng chlorua sắt FeCl2 sulphat sắt, citrat sắt Fe(C4H4O6) Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với

Na2-ethylen diamintetraacetat (EDTA)

Hai dạng đường thường sử dụng nhất là saccharose và glucose

Tùy theo mục đích nuôi cấy, loại mẫu cấy và giai đoạn sinh trưởng của mẫu cấy, nồng độ saccharose biến đổi từ 1-6% (w/v), thông dụng nhất là 2%, tương ứng với 58,4mM

NGUỒN CACBON – ĐƯỜNG

Tên vitamin Nồng độ sử dụng (mg/l)

CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG

Tên phytohormone Nồng độ sử dụng (mg/l)

2,4D (Dichlorophenoxyacetic acid 0,2 – 5,0

α- NAA (α- Naphtylacetic acid) 0,1 - 5,0

β-IAA (β-Indolacetic acid) 5 – 20

IBA (Indolbutyric acid) 1 – 5

Nước dừa: trong nước dừa đã cĩ chứa myo-inozitol và một số amino acid Lượng nước dừa dùng trong môi trường nuôi cấy thường từ 5 - 20% thể tích môi trường

Nước chiết: nước chiết nấm men, malt, là

các chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật, đã được tiêu chuẩn hóa và bán dưới dạng thương phẩm, thường dùng là 1 gam cho 1 lít môi trường

CÁC CHẤT BỔ SUNG

Tác nhân tạo gel quyết định

trạng thái vật lý của môi trường nuôi

cấy (agar, phytagel, )

Agar là polysaccharide có

khả năng làm đông môi trường, được

lấy từ rong biển, hòa tan hình thành

chất keo kết dính với nước và hấp thụ

hóa chất

Hàm lượng sử dụng agar là

0,5 – 10% (w/v) tùy theo chất lượng

của chúng và loại môi trường nuôi

cấy

TÁC NHÂN LÀM THAY ĐỔI TRẠNG

THÁI VẬT LÝ MÔI TRƯỜNG

Môi trường MS

PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MƠI TRƯỜNG

Mơi trường nuơi cấy mơ thực vật cĩ thành phần rất phức tạp, cĩ sự hiện diện của rất nhiều loại hố chất với hàm lượng rất nhỏ

Các mơi trường nuơi cấy hay mơi trường làm việc

sẽ được pha trước các dung dịch đậm đặc (cân hố chất mỗi lần pha với độ đậm đặc từ X10 – X100 - dung dịch mẹ (stock))

Dung dịch đậm đặc sau đó sẽ được pha loãng khi sử dụng Các dung dịch đậm đặc được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu

Thơng thường pha các dung dịch mẹ: stock đa lượng, stock vi lượng, Fe – EDTA, stock vitamin, stock chất sinh trưởng, và các stock cần thiết khác.

Ví Dụ: Pha 1 lít môi trường MS có công thức:

MS + Suc (30g/l) + Agar (8g/l), pH=5,8

Bước 1: Chọn môi trường cần pha

Bước 2: Chuẩn bị, kiểm tra đầy đủ hóa chất – trang

thiết bị - dụng cụ

Bước 3: Pha chế các dung dịch mẹ (stock)

3.1 Pha stock khoáng đa lượng nồng độ đậm đặc

20 lần (x20) 3.2 Pha stock khoáng vi lượng nồng độ đậm đặc

100 lần (x100) 3.3 Pha stock vitamin nồng độ đậm đặc 100 lần

(x100) 3.4 Pha stock Fe-EDTA nồng độ đậm đặc 100

lần (x100) 3.5 Pha stock các hormon điều hòa sinh trưởng

thực vật

Bước 4: Pha môi trường làm việc: tiến hành tuần tự

- Dùng ống đong, đong khoảng 500 ml nước cất vào becher

- Bổ sung 30 g đường sucrose vào, khuấy tan hoàn toàn

- Bổ sung 50 ml dung dịch stock đa lượng x20, khuấy đều

- Bổ sung 10 ml dung dịch stock vi lượng x100, khuấy đều

- Bổ sung 10 ml dung dịch stock Fe-EDTA x100, khuấy đều

- Bổ sung 10 ml dung dịch stock vitamin x100, khuấy đều

- Bổ sung stock điều hòa sinh trưởng thực vật với lượng tùy mục đích nuôi cấy

- Chuyển tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất chuẩn lại cho đủ 1000 ml

- Chỉnh pH của dung dịch bằng NaOH 1N hay HCl 1N về pH=5,8

- Bổ sung 8g agar

- Đun sôi cho tan agar, khuấy đều Chia hỗn hợp môi trường vào các bình nuôi cấy Hấp khử trùng bằng autoclave ở 121 0 C, 1atm, 30phút Môi trường sau khi hấp được bảo quản ở 25 0 C

2.3 CHỌN MÔ CẤY VÀ XỬ LÝ MÔ CẤY

Các mơ cĩ sức phát triển

mạnh: mơ phân sinh ngọn, tượng

tầng, đầu rễ, lá non, cuống hoa, chồi

bên, , thường được dùng làm mơ

cấy

Các mô khác nhau trên cùng

một cây có thể cho các loại mô

sẹo hoàn toàn khác nhau với khả

năng tái sinh rất khác nhau

Sau khi cấy, mơ cấy thường

được đặt trong các điều kiện ổn

định về nhiệt độ, ánh sáng, ẩm

độ, ,

CHỌN MƠ CẤY VÀ XỬ LÝ MƠ CẤY

CÁC THIẾT BỊ CƠ BẢN CỦA PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY

MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

PHÒNG RỬA VÀ NƯỚC CẤT

• Máy nước cất một lần

• Máy nước cất hai lần

• Máy sản xuất nước khử ion

• Bồn rửa dụng cụ

PHÒNG SẤY VÀ HẤP

• Tủ sấy

• Nồi hấp tuyệt trùng

PHÒNG CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG

• Máy đo pH (độ chính xác 0.1 đơn vị)

• Cân phân tích – cân kỹ thuật (độ chính xác 0.1 mg)

PHÒNG CẤY VÔ TRÙNG

• Đèn tử ngoại treo trần hay treo tường

• Tủ cấy Lamine

• Thiết bị lọc không khí

PHÒNG KÍNH HIỂN VI - PHÒNG ẢNH

• Kính hiển vi quang học

• Kính hiển vi điện tử

• Kính hiển vi soi nổi

• Thiết bị chụp ảnh trên kính hiển vi

Kính hiển vi đầu tiên

Anton Van Leeuwenhoek

Kính hiển vi quỳnh quang

Kính hiển vi điện tử

Chương 3:

CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG

THỰC VẬT

Đị nh nghĩa:

Hormon là một chất hữu cơ do tế bào của một bộ phận cơ thể tạo ra và được chuyển đến một bộ phận khác, ở đó, với nồng độ rất thấp, chất đĩ gây ra một phản ứng sinh lý

Phân loại:

- Auxin: thường được tổng hợp trong sơ khởi lá, lá non,

hạt đang phát triển

- Gibberellin: thường được tổng hợp trong mơ non của

chồi, hạt đang phát triển, rễ cây

- Cytokinin: thường được tổng hợp trong hạt đang phát triển,

ngọn rễ cây

- Acid abscisic: tổng hợp trong rễ, lá trưởng thành

- Ethylen: tổng hợp trong các mơ chịu stress, mơ lão

suy và chín trái

CÁC HORMON TĂNG TRƯỞNG CỦA THỰC VẬT

N H

CH2COOH

COOH

O H

Sự vận chuyển của các hormon tăng trưởng:

- Auxin: di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác,

trong libe

- Gibberellin: vận chuyển trong mộc và libe

- Cytokinin: vận chuyển trong mộc (rễ đến chồi)

- Acid abscisic: tổng hợp ở rễ, vận chuyển trong

mộc; tổng hợp ở lá, vận chuyển trong libe

- Ethylen: khuếch tán từ nơi tổng hợp ra khắp nơi CÁC HORMON TĂNG TRƯỞNG CỦA THỰC VẬT

Vai trị sinh lý:

- Auxin: tác dụng kéo dài, phân chia tế bào, có tính hướng

động và ưu thế ngọn, gây lão suy, rụng, đậu và tăng trưởng trái, chín trái, quy định tính cái của hoa

- Gibberellin: tác dụng kéo dài lóng thân, giúp hạt nảy mầm,

đậu và tăng trưởng trái, quy định tính đực của hoa

- Cytokinin: phân chia tế bào, tạo chồi trong trong nuôi cấy

mô, tăng trưởng nụ nách, tăng rộng lá, chậm lão suy

- Acid abscisic: đóng khí khẩu, cản tăng trưởng chồi, cảm ứng

tổng hợp protein hạt, cảm ứng và duy trì sự ngủ

- Ethylen: Gỡ hưu miên, tăng trưởng và phân hóa chồi, rễ,

tạo rễ bất định, gây rụng lá và trái, quy định tính cái của hoa, lão suy hoa, trái, chín trái.

CÁC HORMON TĂNG TRƯỞNG CỦA THỰC VẬT

AUXIN

Lịch sử phát hiện:

Auxin được Darwin phát hiện vào năm 1880 khi khảo sát tính hướng sáng của thực vật Sau đó, tính chất và ảnh hưởng của Auxin lên thực vật lần lượt được các nhà khoa học làm rõ với các thí nghiệm: Boysen - Jensen (1913), Paal (1919), Sodid (1925)…

Went (1926) chứng minh được vai trò kích thích sinh trưởng và định lượng được nồng độ Auxin

Kogl và Haagen-Smith đã tách được Auxin B từ nước tiểu người năm 1931 và năm 1934 đã tách được IAA

từ men bia

Năm 1946 Haagen-Smith và cộng sự đã phân lập được IAA từ nội nhũ của ngô

AUXIN

Auxin

Là những hợp chất có nhân indol, được tổng hợp từ tryptophan trong mô phân sinh (ngọn, lóng) và lá non Sau

đó, auxin sẽ di chuyễn đến rễ và tích tụ trong rễ

Acid indoleacetic (AIA) Tryptophan (Trp)

Một số chất điển hình của Auxin

Tính chất sinh lý của Auxin

Vai trò trong sự kéo dài tế bào:

Khi tế bào được cung cấp

auxin, auxin sẽ hoạt hóa bơm

ion H+ trên màng sinh chất Ion

H+ được vận chuyển tích cực từ

tế bào chất vào trong vách Sự

gia tăng đó làm hoạt hóa enzim

giúp bẻ gảy một số liên kết

chéo giữa các đường đa cấu tạo

vách và vách trở nên mềm dẻo

hơn Vì vậy, nước vào tế bào và

không bào càng lúc càng nhiều

vách sẽ bị căng ra

Tính chất sinh lý của Auxin

Vai trò trong quang hướng động của cây:

Auxin khuếch tán từ phần ngọn diệp tiêu vào khối agar và khi đặt khối agar này lên phần diệp tiêu còn lại thì chất này được di chuyển xuống và kích thích sự tăng dài (Went, 1926)

Khi ánh sáng tác động từ một phía ngọn cây, ánh sáng làm giảm sự cung cấp auxin cho cây ở phía ánh sáng và tăng ở phía ở trong tối Kết quả là bên phía được chiếu sáng cây tăng trưởng chậm hơn phía bên tối, và sự tăng trưởng bất xứng này làm cho cây mọc cong về phía sáng