Untitled Tạp chí Khoa học Công nghệ và Thực phẩm 20 (3) (2020) 80 93 80 NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CỦA CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma longifolia) TỪ CÁC NGUỒN MÔ KHÁC NHAU DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒ[.]
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thực phẩm 20 (3) (2020) 80-93 NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CỦA CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma longifolia) TỪ CÁC NGUỒN MÔ KHÁC NHAU DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT Trần Trọng Tuấn1*, Nguyễn Lệ Hoa Tiên1, Nguyễn Thị Dược1, Nguyễn Thị Huyền Trang1, Đỗ Đăng Giáp1, Trịnh Thị Hương2 Viện Sinh học Nhiệt đới Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM *Email: trantrongtuan.com@gmail.com Ngày nhận bài: 14/4/2020; Ngày chấp nhận đăng: 05/8/2020 TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm khảo sát ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng thực vật loại mẫu cấy đến trình phát sinh hình thái bá bệnh Kết thu cho thấy, mẫu cấy tử diệp, tỷ lệ hình thành mô sẹo khối lượng tươi đạt cao nhất, 96,3% 258 mg nuôi cấy mơi trường MS có bổ sung 3,0 mg/L NAA kết hợp với 0,5 mg/L BA; mô sẹo thu có màu vàng, xốp Đối với mẫu cấy non, tỷ lệ hình thành mơ sẹo khối lượng tươi đạt cao nhất, 100% 99 mg ni cấy mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L NAA kết hợp với 0,5 mg/L BA; mô sẹo thu có màu trắng, xốp Đối với mẫu cấy cuống non, tỷ lệ hình thành mơ sẹo khối lượng tươi đạt cao nhất, 100% 56 mg nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L NAA kết hợp với 2,0 mg/L BA; mơ sẹo thu có màu trắng, xốp Sự phát sinh hình thái mơ sẹo loại mẫu mơi trường ni cấy có bổ sung 6-benzylaminopurine (BA) kết hợp với thidiazuron (TDZ) cho hiệu thấp so với sử dụng BA kết hợp với NAA Mơ sẹo thu có hình thái màu sắc khác nhau, nguồn nguyên liệu phục vụ cho nhiều hướng nghiên cứu như: nuôi cấy phát sinh phôi, nuôi cấy huyền phù thu nhận hợp chất thứ cấp… Trong nghiên cứu phát sinh rễ bất định mẫu in vitro, NAA thích hợp cho hình thành rễ bất định Eurycoma longifolia Kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mẫu hình thành rễ, số rễ/mẫu chiều rễ trung bình đạt cao nhất, 80%, 2,5 rễ/mẫu, 23,8 mm, tỷ lệ mẫu tạo rễ 80,0% nghiệm thức sử dụng 1,0 mg/L NAA Khơng có hình thành rễ mẫu ex vitro tất nghiệm thức Từ khoá: BA, bá bệnh, cuống lá, lá, mô sẹo, NAA, TDZ, tử diệp MỞ ĐẦU Cây bá bệnh loại dược liệu thuộc họ Thanh thất có tên khoa học Eurycoma longifolia, phân bố khu vực Đông Nam Á Malaysia, Việt Nam, Lào, Indonesia, Thái Lan, Myanma, Cambodia [1] Cây bá bệnh sử dụng làm dược liệu y học cổ truyền, bên cạnh chức điều trị bệnh sốt rét tăng cường sinh lý [2], bá bệnh cịn có nhiều cơng dụng khác sử dụng để trị ngứa, dùng để điều trị kiết lị [3], vỏ sử dụng loại thuốc xổ giun, rễ dùng làm thuốc điều trị huyết áp cao, vỏ rễ điều trị tiêu chảy sốt [4] Các chiết xuất từ rễ dùng để điều trị bệnh rối loạn chức tình dục, lão hóa, ung thư, sốt rét, tiểu đường, lo âu, căng thẳng, táo bón, đau nhức, bệnh bạch cầu, loãng xương, giang mai, sưng tuyến; chúng sử dụng thuốc kháng sinh, dùng kích thích thèm ăn, bồi bổ sức khỏe giúp phục hồi thể lực [5] 80 Nghiên cứu phát sinh hình thái bá bệnh (Eurycoma longifolia) từ nguồn mô Cho đến nay, nước ta nước khác có nhiều nghiên cứu tác dụng dược lý, hoạt tính sinh học, nhân giống đặc điểm sinh thái loài Tại Việt Nam từ năm 1968 nhà khoa học thuộc nhóm nghiên cứu Lê Văn Thời Nguyễn Ngọc Sương nghiên cứu chiết xuất hoạt chất sinh học bá bệnh Trong nghiên cứu này, từ vỏ bá bệnh chiết xuất hợp chất β-sistosterol, campesterol, 2,6-dimethoxybezoquinone, eurycomalacton, dihydroeurycomalacton A, laurylaton, laurylaton B [6] Năm 2016, Phạm Bích Ngọc cộng tìm chất thuộc nhóm alkaloid từ rễ tóc bá bệnh (Eurycoma longifolia) β-carboline alkaloid 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid [7] Bên cạnh nghiên cứu phương pháp tách chiết chất có hoạt tính thử nghiệm hoạt tính sinh học, ni cấy mơ loại nghiên cứu Năm 2010, Mahmood cộng nghiên cứu cảm ứng mô sẹo từ quan bá bệnh Nguồn mẫu sử dụng lá, cuống lá, cuống, thân, rễ chính, rễ xơ, mầm ni cấy mơi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng khác 2,4-D, IAA (axit β-indolyaxetic), NAA, picloram, dicamba [8] Năm 2012, Hussein cộng công bố ảnh hưởng auxin, nồng độ đường nguồn carbohydrate lên khả hình thành rễ bất định từ nuôi cấy mẫu bá bệnh [9] Năm 2015, Zawawi cộng công bố nghiên cứu cảm ứng tạo phôi trực tiếp từ mẫu tử diệp sử dụng TDZ (thidiazuron) Kết cho thấy môi trường MS bổ sung 0,1 mg/L zeatin 0,2 mg/L IBA 15% mẫu cấy hình thành phơi bổ sung thêm 0,12 mg/L TDZ tỷ lệ hình thành phơi tăng 20% Trong nghiên cứu này, phơi thứ cấp cảm ứng hình thành mơi trường MS bổ sung 2,0 mg/L IBA 0,075 mg/L TDZ với tỷ lệ 20% Phôi tái sinh trực tiếp sử dụng tiếp tục tái sinh nhằm nhân giống bá bệnh [10] VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Vật liệu ex vitro: Hạt, non (14 ngày tuổi), (60 ngày tuổi), cuống non bá bệnh thu hái vườn ươm Viện Sinh học Nhiệt đới sử dụng làm nguồn nguyên liệu nghiên cứu Các nguồn mẫu ex vitro rửa vòi nước Sau đó, mẫu khử trùng với cồn 70o 30 giây Tiếp theo, nguồn mẫu khử trùng với dung dịch HgCl 0,1% thời gian 15, 6, 10 phút tương ứng với mẫu hạt, non, cuống non Cuối cùng, mẫu rửa lại với nước cất vô trùng loại bỏ hết dung dịch khử trùng Nguồn mẫu sau khử trùng nuôi cấy môi trường MS để theo dõi tỷ lệ nhiễm tỷ lệ sống mẫu Sau tuần nuôi cấy, mẫu sống không nhiễm sử dụng làm nguồn vật liệu cho nghiên cứu nội dung Mẫu thu nhận từ bá bệnh in vitro có nguồn gốc từ hạt sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho nội dung 2.2 Môi trường nuôi cấy Mơi trường Murashige Skoog (MS) có bổ sung 30 g/L sucrose, g/L agar chất điều hoà sinh trưởng thực vật bổ sung khác theo thí nghiệm [11] Mơi trường điều chỉnh pH 5,8 trước hấp khử trùng 121 °C, atm 15 phút 2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.3.1 Nội dung Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên phát sinh hình thái từ nguồn mẫu ex vitro Chuẩn bị mẫu cấy 81 Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Lệ Hoa Tiên, Nguyễn Thị Dược, Nguyễn Thị Huyền Trang,… Mẫu hạt sau khử trùng loại bỏ lớp vỏ cứng bên ngồi, thu lấy phần tử diệp Sau đó, mẫu tử diệp cắt với kích thước × mm (ngang × dọc) Mẫu non cuống non sau khử trùng loại bỏ phần hư hại bên khử trùng Tiếp theo mẫu cuống cắt với kích thước tương ứng × mm × mm (ngang × dọc) Mẫu sau khử trùng loại bỏ phần hư hại bên khử trùng Tiếp theo mẫu cắt với kích thước 10 × mm (ngang × dọc) Khảo sát ảnh hưởng BA NAA lên phát sinh hình thái mẫu cấy tử diệp, non, cuống non Các mẫu cấy lớp mỏng tử diệp, non cuống non nuôi cấy môi trường MS có bổ sung BA (với nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/L) kết hợp với NAA (với nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 mg/L) Mỗi nghiệm thức cấy 10 bình bình mẫu Khảo sát ảnh hưởng BA TDZ lên phát sinh hình thái mẫu tử diệp, non, cuống non Các mẫu cấy lớp mỏng tử diệp, non, cuống non nuôi cấy mơi trường MS có bổ sung BA (với nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/L) kết hợp với TDZ (với nồng độ 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/L) Mỗi nghiệm thức cấy 10 bình bình mẫu Khảo sát ảnh hưởng IAA, IBA, NAA riêng lẻ với nồng độ khác lên khả phát sinh rễ bất định từ ex vitro bá bệnh Mẫu bá bệnh sau khử trùng nuôi cấy môi trường MS bổ sung 30 g/L sucrose, 8,0 g/L agar IAA, IBA, NAA riêng lẻ với nồng độ thay đổi khác 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/L Mỗi nghiệm thức cấy 10 bình bình mẫu 2.3.2 Nội dung Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên phát sinh hình thái từ nguồn mẫu in vitro Mẫu in vitro cắt thành mẫu có kích thước 10 x mm, sau ni cấy mơi trường MS bổ sung 30,0 g/L sucrose, 8,0 g/L agar IAA, IBA, NAA riêng lẻ với nồng độ thay đổi khác 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 Mỗi nghiệm thức cấy 10 bình bình mẫu 2.3.3 Điều kiện ni cấy Các thí nghiệm thực điều kiện nhiệt độ: 24 ± °C; độ ẩm: 55-60%; thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng: 40 ± µmol m s -2 -1 2.3.4 Chỉ tiêu theo dõi phương pháp xử lý số liệu Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên Số liệu ghi nhận xử lý phần mềm thống kê SPSS 16.0 phần mềm MicroSoft Excel ® 2007, theo phương pháp Duncan [12] với độ tin cậy 95% 82 Nghiên cứu phát sinh hình thái bá bệnh (Eurycoma longifolia) từ nguồn mô KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nội dung 1: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên phát sinh hình thái từ nguồn mẫu ex vitro 3.1.1 Ảnh hưởng BA NAA lên phát sinh hình thái mẫu lớp mỏng tử diệp Quá trình phát sinh hình thái ni cấy in vitro kết q trình biệt hóa phản biệt hóa Q trình phụ thuộc nhiều vào tỷ lệ hai nhóm chất điều hồ sinh trưởng thực vật (CĐHSTTV) auxin cytokinin, nhiều trường hợp, trình phát sinh hình thái thường bắt đầu việc cảm ứng tạo mơ sẹo Trong thí nghiệm này, kết thu cho thấy, nghiệm thức khơng có bổ sung CĐHSTTV, mẫu cấy có màu xanh phồng lên mà khơng có cảm ứng hình thành mơ sẹo Kết tương tự thu nghiệm thức bổ sung BA riêng lẻ (không bổ sung NAA) Ngược lại, thí nghiệm sử dụng NAA riêng lẻ (không bổ sung BA), kết thu cho thấy, tỷ lệ hình thành mơ sẹo khối lượng mô sẹo tăng dần tăng nồng độ NAA từ 0,5 mg/L đến 3,0 mg/L Tuy nhiên, tiếp tục tăng nồng độ NAA lên 3,5 mg/L 4,0 mg/L, tỷ lệ mẫu tạo sẹo khối lượng mô sẹo bắt đầu giảm (Bảng 1), mẫu tử diệp tiếp xúc với mơi trường bắt đầu hóa nâu Trong thí nghiệm này, nghiệm thức có kết hợp NAA BA, mẫu cấy có cảm ứng tạo thành mô sẹo, nhiên tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo khối lượng mơ sẹo hình thành hình thái mơ sẹo thu có khác biệt nghiệm thức (Bảng 1) Trong đó, nghiệm thức sử dụng mg/L NAA kết hợp với 0,5 mg/L BA thu tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo khối lượng tươi mô sẹo cao (tương ứng 96,3% 258 mg); mô sẹo thu có màu vàng xốp (Hình 1a) Ban đầu để mơ sẹo cảm ứng cần auxin cytokinin riêng rẽ, để tiếp tục trì phát triển mơ sẹo, kết hợp auxin cytokinin cần thiết Vì vậy, việc cảm ứng tạo mơ sẹo thường địi hỏi kết hợp auxin cytokinin [13] Trong thí nghiệm này, môi trường bổ sung BA với nồng độ từ 0,5-2,0 mg/L kết hợp với NAA (nồng độ từ 0,5-4,0 mg/L) kết cho thấy rằng, kết hợp đạt hiệu tốt việc hình thành mô sẹo gia tăng khối lượng mô sẹo Quan sát hình thái mẫu mơ sẹo thí nghiệm cho thấy, có nhiều dạng mơ sẹo tạo thành (trắng xanh, vàng nâu, vàng, cứng, xốp) Trong hầu hết nghiệm thức có bổ sung NAA nồng độ cao (3,0-4,0 mg/L) mô sẹo có màu vàng mỡ gà, xốp Đây nguồn ngun liệu để tạo phơi lồi Trong nghiên cứu bá bệnh, Hussein et al (2012) cho thấy mẫu mô sẹo hình thành từ tử diệp có khả hình thành phơi [9] Do thí nghiệm này, mẫu cấy tử diệp nuôi cấy môi trường MS bổ sung 3,0 mg/L NAA kết hợp 0,5 mg/L BA cho tỷ lệ hình thành mơ sẹo khối lượng tươi cao 3.1.2 Ảnh hưởng BA NAA lên phát sinh hình thái mẫu cấy non Sau 45 ngày nuôi cấy, kết thu tương tự với thí nghiệm mẫu cấy tử diệp Ở nghiệm thức không bổ sung CĐHSTTV bổ sung BA riêng lẻ, mẫu khơng có cảm ứng tạo thành mô sẹo Các mẫu cấy cảm ứng tạo thành mơ sẹo mơi trường ni cấy có diện NAA nồng độ từ 0,5-3,0 mg/L Khi sử dụng NAA nồng độ từ 3,5-4,0 mg/L (có kết hợp khơng kết hợp BA), mẫu non nuôi cấy không cảm ứng tạo mơ sẹo, mà hố nâu chết (Bảng 2) Điều cho thấy, mẫu cấy non nhạy cảm với nồng độ NAA mẫu cấy tử diệp Đối với mẫu cấy non, diện NAA môi trường nuôi cấy cần thiết để mẫu cảm ứng tạo thành mô sẹo, với nồng độ thấp từ 0,5-3,0 mg/L 83 Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Lệ Hoa Tiên, Nguyễn Thị Dược, Nguyễn Thị Huyền Trang,… Bảng Ảnh hưởng BA NAA lên phát sinh hình thái mẫu cấy tử diệp sau 45 ngày nuôi cấy CĐHSTTV (mg/L) NAA BA 0,0 0,0 – 2,0 0,0 0,5 1,0 0,5 1,5 2,0 0,0 0,5 1,0 1,0 1,5 2,0 0,0 0,5 1,0 1,5 1,5 2,0 0,0 0,5 1,0 2,0 1,5 2,0 0,0 0,5 1,0 2,5 1,5 2,0 0,0 0,5 1,0 3,0 1,5 2,0 0,0 0,5 1,0 3,5 1,5 2,0 0,0 0,5 1,0 4,0 1,5 2,0 P Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) 0,00 0,00 22,22 37,37 22,22 11,11 11,11 29,63 44,44 51,85 66,67 29,63 62,96 88,89 92,60 96,30 33,33 88,89 96,30 66,67 51,85 51,85 92,60 96,30 74,07 74,07 70,37 96,30 88,90 88,89 74,07 62,96 100,00 100,00 96,30 92,59 62,96 74,07 77,78 100,00 96,30 Khối lượng tươi (mg) 196b* 170cd 122hi 111ij 92kl 153ef 125gh 81kl 103jk 92kl 107ij 140fg 101jk 109ij 130gh 171cd 123gh 117ij 103jk 137fg 166de 171cd 89kl 69kl 175bc 258a 145ef 123gh 88kl 138fg 147ef 137fg 107ij 69kl 90kl 137fg 97kl 116ij 124ij * Đặc điểm hình thái mẫu Phồng, xanh Phồng, xanh Phồng, xanh Phồng, xanh Phồng, xanh Phồng, xanh Phồng, xanh Xanh nâu, cứng Nâu, cứng Nâu, cứng Vàng, xốp Vàng nâu, cứng Vàng nâu, cứng Trắng xanh, cứng Vàng nâu, xốp Vàng nâu, xốp Phồng, xanh Vàng nâu, cứng Vàng nâu, cứng Vàng nâu, cứng Vàng nâu, cứng Phồng, xanh Trắng xanh, xốp Trắng, xốp Vàng, cứng Vàng, xốp Vàng, cứng Vàng, xốp Vàng, xốp Vàng, xốp Vàng, xốp Xanh, cứng Vàng, xốp Vàng, xốp Vàng, xốp Vàng, xốp Xanh, cứng Xanh, cứng Vàng, xốp Vàng, xốp Vàng, xốp *Các chữ a, b… cột thể khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 84 Nghiên cứu phát sinh hình thái bá bệnh (Eurycoma longifolia) từ nguồn mô Ở nghiệm thức kết hợp NAA (0,5-3,0 mg/L) BA (0,5-2,0 mg/L), hiệu tạo mô sẹo cao so với sử dụng NAA riêng lẻ; nhiên, tỷ lệ mẫu tạo thành mô sẹo khối lượng tươi mơ sẹo có khác nghiệm thức Trong đó, nghiệm thức sử dụng 0,5 mg/L NAA + 0,5 mg/L BA nghiệm thức sử dụng 1,0 mg/L NAA+ 0,5 mg/L BA, tỷ lệ mẫu tạo thành mô sẹo khối lượng tươi mô sẹo đạt cao (tương ứng 100% 99 mg, 96 mg) (Bảng 2, Hình 1b) Kết tương tự kết khảo sát Hussein et al (2012) bá bệnh [9] Quan sát hình thái cho thấy, mơ sẹo ban đầu hình thành vùng gân sau hình thành xung quanh rìa lá, vết cắt Hình thái mơ sẹo thu khác với mô sẹo phát sinh từ mẫu từ diệp Hầu hết mơ sẹo thu có màu trắng, xốp Bảng Ảnh hưởng BA NAA lên phát sinh hình thái mẫu cấy non sau 45 ngày nuôi cấy CĐHSTTV (mg/L) NAA BA 0,0 – 2,0 0,0 0,5 1,0 0,5 1,5 2,0 0,0 0,5 1,0 1,0 1,5 2,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0,0 – 2,0 0,0 – 2,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) 0,00 44,44 100,00 100,00 94,44 55,56 61,11 100,00 94,44 83,33 66,67 Khối lượng tươi (mg) 53cde* 99a 87abc 56bcd 89abc 55bcd 96a 89abc 94ab 75abc Đặc điểm hình thái mẫu Trắng, nhỏ Trắng, xốp Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, xốp Trắng, xốp Trắng, xốp Trắng, xốp Trắng, xốp 33,33 38,89 72,22 61,11 50,00 33,33 83,33 55,56 61,11 61,11 11,11 44,44 22,22 11,11 0,00 0,00 50,00 38,89 11,11 11,11 0 20def 23def 94ab 21def 18def 13ef 20def 24def 18def 13ef 7f 10f 20def 8f 6f 17def 9f 6f 10f * Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, xốp Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, xốp Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ - P *Các chữ a, b… cột thể khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 85 Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Lệ Hoa Tiên, Nguyễn Thị Dược, Nguyễn Thị Huyền Trang,… 3.1.3 Ảnh hưởng BA NAA lên phát sinh hình thái mẫu cấy cuống non Đối với mẫu nuôi cấy cuống non, môi trường nuôi cấy không bổ sung NAA bổ sung NAA từ 1,5 mg/L trở lên (có kết hợp khơng kết hợp BA), tất mẫu cuống nuôi cấy không cảm ứng tạo thành mô sẹo chết Sự cảm ứng tạo thành mô sẹo xảy môi trường nuôi cấy có diện NAA nồng độ thấp từ 0,5-1,0 mg/L Trong đó, nghiệm thức sử dụng 1,0 mg/L NAA + 2,0 mg/L BA, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo khối lượng tươi mô sẹo cao (tương ứng 100% 56 mg); mô sẹo tạo thành có màu nâu xốp (Bảng 3, Hình 1c) Việc cảm ứng tạo mơ sẹo thường địi hỏi kết hợp auxin cytokinin [13] Sandra et al (1987) báo cáo rằng, với mẫu cấy cuống phong đỏ môi trường MS bổ sung BA kết hợp NAA cho tỷ lệ tạo mô sẹo khối lượng tươi tốt so với môi trường bổ sung NAA riêng lẻ [14] Kết thí nghiệm khẳng định vai trị cytokinin auxin q trình biệt hóa lồi thực vật khả cảm ứng nguồn mẫu khác khác Bảng Ảnh hưởng BA NAA lên phát sinh hình thái mẫu cấy cuống non sau 45 ngày nuôi cấy CĐHSTTV (mg/L) NAA BA 0,0 0,0 - 2,0 0,5 1,0 1,5 - 4,0 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Khối lượng tươi (mg) Đặc điểm hình thái mẫu - - bc Trắng, nhỏ 0,0 58,33 14 0,5 58,33 44ab Trắng, xốp 1,0 41,67 15bc Trắng, xốp 1,5 25,00 10c Trắng, xốp 2,0 0,00 - - abc Trắng, xốp 0,0 75 38 0,5 100 39abc Trắng, xốp 1,0 100 42abc Trắng, xốp 1,5 100 29 abc Trắng, xốp 2,0 100 56a Trắng, xốp 0,0 - 2,0 - - P * *Các chữ a, b… cột thể khác biệt có ý nghĩa mức p= 0,05 3.1.4 Ảnh hưởng BA kết hợp TDZ lên phát sinh hình thái mẫu cấy tử diệp Khi nuôi cấy mẫu tử diệp môi trường có bổ sung BA TDZ kết hợp riêng lẻ, kết thu cho thấy, nghiệm thức bổ sung 0,2 mg/L TDZ kết hợp không kết hợp với BA (nồng độ 0,5-2,0 mg/L), mẫu nuôi cấy không cảm ứng tạo thành mô sẹo, trì trạng thái màu xanh mẫu ban đầu Các nghiệm thức có bổ sung TDZ nồng độ (từ 0,4-1,0 mg/L TDZ) kết hợp với BA (0,5-2,0 mg/L), tất mẫu cấy có cảm ứng tạo thành mô sẹo Tuy nhiên, tỷ lệ tạo thành mô sẹo khối lượng mô sẹo thu thí nghiệm thấp so với ni cấy mẫu tử diệp mơi trường có bổ sung BA kết hợp với NAA Trong thí nghiệm này, tỷ lệ mẫu tạo thành mô sẹo đạt cao 50% nghiệm 86 Nghiên cứu phát sinh hình thái bá bệnh (Eurycoma longifolia) từ nguồn mô thức 0,4 mg/L TDZ kết hợp với 0,5-1,5 mg/L BA (tương ứng 77,78; 55,56 51,85%) Khối lượng tươi mẫu có khác biệt đáng kể mặt thống kê nghiệm thức khảo sát Tại nghiệm thức 0,4 mg/L TDZ + 0,5 mg/L BA, khối lượng tươi mẫu thu đạt cao (136 mg) (Bảng 4) Quan sát mặt hình thái nhận thấy, mẫu ni cấy mơi trường có bổ sung 0,4 mg/L TDZ thu mơ sẹo màu vàng, cứng Khi nồng độ TDZ tăng lên 0,6-1,0 mg/L, mô sẹo thu màu vàng nâu, cứng; màu nâu mô sẹo đậm dần nồng độ TDZ tăng dần Như vậy, bổ sung TDZ nồng độ thấp (0,2 mg/L) nồng độ cao 0,6 mg/L khơng thích hợp cho hình thành mơ sẹo mẫu cấy tử diệp bá bệnh Bảng Ảnh hưởng BA kết hợp TDZ lên phát sinh hình thái mẫu cấy tử diệp sau 45 ngày nuôi cấy CĐHSTTV (mg/L) TDZ BA Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) 0,2 0,0 – 2,0 0,4 0,6 0,8 1,0 Khối lượng tươi (mg) Đặc điểm hình thái mẫu - Xanh c 0,0 33,33 54 0,5 77,78 65c 1,0 55,56 136a 1,5 51,85 51c 2,0 44,44 46c 0,0 33,33 123ab 0,5 37,04 75bc 1,0 37,04 67c 1,5 33,33 50c 2,0 33,33 45c 0,0 11,11 65c 0,5 33,33 41c 1,0 37,04 75bc 1,5 33,33 41d 2,0 29,63 49c 0,0 7,41 82bc 0,5 11,11 48c 1,0 29,63 47c 1,5 29,63 69 c 2,0 14,81 42c P Vàng, cứng Vàng nâu, cứng Vàng nâu, cứng Vàng nâu, cứng * *Các chữ a, b…: cột thể khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 87 Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Lệ Hoa Tiên, Nguyễn Thị Dược, Nguyễn Thị Huyền Trang,… 3.1.5 Ảnh hưởng BA TDZ lên phát sinh hình thái mẫu cấy non Đối với mẫu cấy non, mơi trường ni cấy có bổ sung TDZ nồng độ từ 0,6-1,0 mg/L kết hợp với BA (0,5-2,0 mg/L), tất mẫu hoá nâu chết Mẫu cấy cảm ứng tạo thành mơ sẹo nghiệm thức có bổ sung TDZ (nồng độ từ 0,2-0,4 mg/L) kết hợp với BA (nồng độ 0,5-2,0 mg/L) (Bảng 5) Ở nghiệm thức này, mô sẹo xuất sau 20 ngày nuôi cấy, ban đầu mơ sẹo hình thành phần gân vết cắt, sau lớn dần lên Tỷ lệ mẫu tạo thành mô sẹo khối lượng tươi mẫu đạt cao thu nghiệm thức 0,2 mg/L TDZ + 1,5 mg/L BA, tương ứng 60% 19 mg Mô sẹo thu màu trắng xốp, thích hợp nguồn vật liệu cho ni cấy tạo huyền phù (Bảng 5, Hình 1b) Bảng Ảnh hưởng BA kết hợp TDZ lên phát sinh hình thái mẫu cấy non sau 45 ngày nuôi cấy CĐHSTTV (mg/L) TDZ Tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo (%) Khối lượng tươi (mg) Đặc điểm hình thái mẫu 0,0 21,00 13ab Trắng, nhỏ 0,5 26,67 24ab Trắng, nhỏ 1,0 46,67 10 b Trắng, nhỏ 1,5 60,00 19ab Trắng, xốp 2,0 53,33 21 ab Trắng, nhỏ 0,0 26,67 28a Trắng, xốp 0,5 21,00 13 ab Trắng, xốp 1,0 6,67 24ab Trắng, xốp 1,5 6,67 8b Trắng, nhỏ 2,0 6,67 7b Trắng, nhỏ 0,0 – 2,0 - - BA 0,2 0,4 0,6 – 1,0 P * *Các chữ a, b, c… thể khác biệt kết cột có ý nghĩa mức p = 0,05 3.1.6 Ảnh hưởng BA kết hợp TDZ lên phát sinh hình thái mẫu cấy cuống non Kết thu thí nghiệm tương tự với trường hợp sử dụng mẫu non Tất mẫu cuống hố nâu chết ni cấy mơi trường có bổ sung TDZ (ở nồng độ 0,6-1,0 mg/L) kết hợp với BA (0,5-2,0 mg/L) Sự cảm ứng tạo thành mô sẹo xảy sử dụng TDZ môi trường nuôi cấy với nồng độ 0,2-0,4 mg/L kết hợp với BA (0,5-2,0 mg/L), nhiên tỷ lệ mẫu tạo thành mô sẹo khối lượng tươi mô sẹo thu tương đối thấp Trong đó, nghiệm thức cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (60%) khối lượng tươi mô sẹo (39 mg) cao 0,4 mg/L TDZ + 1,0 mg/L BA Ở nghiệm thức này, mô sẹo cảm ứng hình thành sau khoảng ngày ni cấy, xuất vị trí vết thương, sau phát triển thành khối, mô sẹo thu màu trắng, xốp (Bảng 6, Hình 1b) 88 Nghiên cứu phát sinh hình thái bá bệnh (Eurycoma longifolia) từ nguồn mô Bảng Ảnh hưởng BA kết hợp TDZ lên phát sinh hình thái mẫu cấy cuống non sau 45 ngày nuôi cấy CĐHSTTV (mg/L) TDZ 0,2 0,4 0,6 – 1,0 BA Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Khối lượng tươi (mg) Đặc điểm hình thái mẫu 0,0 40,00 21bc Trắng, xốp 0,5 53,33 26 b Trắng, xốp 1,0 46,67 25b Trắng, xốp c Trắng, xốp 1,5 26,67 2,0 6,67 19bc Trắng, xốp bc Trắng, xốp 0,0 33,33 19 0,5 33,33 15bc Trắng, xốp 1,0 60,00 39a Trắng, xốp 1,5 13,33 10c Trắng, xốp 2,0 6,67 19bc Trắng, xốp 0,0 – 2,0 - - P * *Các chữ a, b… cột thể khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 3.1.7 Khảo sát ảnh hưởng IAA, IBA, NAA với nồng độ khác lên khả phát sinh rễ bất định từ ex vitro bá bệnh Nhiều nghiên cứu chứng minh vai trò auxin lên khả hình thành nhân nhanh rễ bất định nhiều đối tượng sâm Ngọc Linh, nhàu,… Nuôi cấy rễ bất định làm gia tăng sinh khối tế bào lựa chọn hàng đầu để sản xuất hợp chất thứ cấp từ thực vật Trong đó, auxin nhân tố định hiệu tốc độ phát triển qui trình Do đó, thí nghiệm số loại auxin phổ biến IAA, IBA, NAA sử dụng để khảo sát phát sinh rễ từ mẫu bá bệnh ex vitro Sau 45 ngày nuôi cấy, mẫu bá bệnh ex vitro không cảm ứng tạo rễ môi trường khảo sát Môi trường bổ sung IAA IBA tất nghiệm thức mẫu không đáp ứng tạo rễ hay sẹo, mẫu xanh hóa nâu mơi trường chết Với mơi trường khảo sát bổ sung NAA nghiệm thức 0,5 1,0 mg/L NAA khơng có khả tạo rễ tạo sẹo, nhiên tăng nồng độ NAA môi trường lên cao (1,5 2,0 mg/L NAA), có hình thành mơ sẹo số lượng hình thành mô sẹo thấp, không đáng kể nên không ghi nhận số liệu 3.2 Nội dung 2: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên phát sinh hình thái từ nguồn mẫu in vitro Kết Bảng cho thấy loại auxin (IAA, IBA, NAA) có khả kích thích tạo rễ bất định từ mẫu bá bệnh, nhiên nồng độ bắt đầu khởi phát rễ khác loại auxin: với NAA nồng độ bổ sung 1,0 mg/L có hình thành rễ bất định (Hình 1e, 1f), IAA 1,5 mg/L IBA 2,0 mg/L Ngoài ra, NAA cho kết hình thành rễ cao so với IBA IAA (với NAA cho kết cao 1,0 mg/L NAA bổ sung phát sinh rễ đạt 2,5 rễ/mẫu, chiều dài rễ trung bình 23,8 mm, tỷ lệ tạo rễ 80,0%, với IBA kết cao 2,0 mg/L phát sinh rễ đạt 0,8 rễ/mẫu, chiều dài trung bình 7,5 mm, tỷ lệ tạo rễ đạt 60% IAA kết cao tỷ lệ hình thành rễ đạt 1,8 rễ/mẫu, chiều dài 89 Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Lệ Hoa Tiên, Nguyễn Thị Dược, Nguyễn Thị Huyền Trang,… rễ trung bình 10,4 tỷ lệ tạo rễ 80%) Kết tương đồng với kết luận báo cáo Husein cộng (2012), NAA có hiệu cao IBA IAA nuôi cấy tạo rễ bất định từ bá bệnh [9] Ngoài ra, ảnh hưởng nồng độ auxin bổ sung vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến phát sinh rễ bất định mẫu bá bệnh Cụ thể môi trường bổ sung NAA, tăng nồng độ NAA khả phát sinh rễ bất định theo chiều hướng giảm xuống (ở mg/L NAA cho kết cao 2,5 rễ/mẫu, chiều dài rễ trung bình 23,8 mm, tỷ lệ tạo rễ 80,0%, 1,5 mg/L kết đạt 2,1 rễ/mẫu, chiều dài rễ trung bình 13,3 mm, tỷ lệ tạo rễ 73,3% với mg/L NAA tỷ lệ rễ/mẫu 1, chiều dài rễ trung bình đạt 6,7 mm, tỷ lệ tạo rễ 53,3%) Bên cạnh đó, mẫu in vitro sử dụng nghiên cứu cho khả phát sinh rễ tối ưu so với mẫu từ ex vitro, nghiên cứu sử dụng nguồn mẫu ex vitro hình thành rễ (thí nghiệm nội dung trên) Trong báo cáo Hussein cộng (2012) lồi bá bệnh, ni cấy mẫu ex vitro môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L NAA khả phát sinh rễ mẫu đạt 1,7 rễ/mẫu, thấp so với mẫu in vitro [9] Bảng Ảnh hưởng NAA, IBA, IAA với nồng độ khác lên khả phát sinh rễ bất định từ bá bệnh nuôi cấy in vitro Chất điều hòa sinh trưởng NAA IBA IAA Nồng độ Tỷ lệ mẫu hình thành rễ (%) Chiều dài rễ (mm) Số rễ/mẫu 0,5 0,0 0,0d 0,0d 1,0 80,0 23,8a 2,5a 1,5 73,3 13,3b 2,1ab 2,0 53,3 6,7c 1,0c 0,5 0,0 0,0d 0,0d 1,0 0,0 0,0d 0,0d 1,5 0,0 0,0d 0,0d 2,0 60,0 7,5c 0,8c 0,5 0,0 0,0d 0,0d 1,0 0,0 0,0d 0,0d 1,5 60,0 9,3bc 1,1c 2,0 80,0 10,4bc 1,8b * * P *Các chữ a, b… cột thể khác biệt có ý nghĩa mức p= 0,05 90 Nghiên cứu phát sinh hình thái bá bệnh (Eurycoma longifolia) từ nguồn mơ Hình Một số hình thái mơ sẹo hình thái rễ; (a) mơ sẹo có màu vàng xốp; (b) mơ sẹo có màu trắng xốp; (c) mơ sẹo có màu nâu xốp; (d) mơ sẹo có màu vàng cứng; (e) hình thành rễ bất định từ lá; (f) hình thành rễ nhánh KẾT LUẬN Ảnh hưởng CĐHSTTV lên phát sinh hình thái mơ sẹo mẫu khác khác Môi trường ni cấy thích hợp cho phát sinh hình thái mô sẹo mẫu tử diệp, mẫu non cuống non mơi trường MS có bổ sung 3,0 mg/L NAA + 0,5 mg/L BA; 0,5 mg/L NAA + 0,5 mg/L BA; 1,0 mg/L NAA + 2,0 mg/L BA Mô sẹo thu từ nuôi cấy mẫu tử diệp có màu vàng, xốp; mơ sẹo thu từ mẫu cấy cuống có màu trắng, xốp Sự kết hợp nhóm CĐHSTTV khác ảnh hưởng khác đến phát sinh hình thái mơ sẹo bá bệnh Mơi trường ni cấy có bổ sung BA kết hợp với NAA cho khả cảm ứng tạo mô sẹo tốt so với sử dụng BA kết hợp với TDZ Trong nghiên cứu phát sinh rễ bất định in vitro bá bệnh, NAA cho kết hình thành rễ cao so với IBA IAA NAA cho kết cao nồng độ 1,0 mg/L với phát sinh rễ đạt 2,5 rễ/mẫu, chiều dài rễ trung bình 23,8 mm, tỷ lệ mẫu tạo rễ 80,0% Khơng có hình thành rễ mẫu ex vitro tất nghiệm thức Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn Sở Khoa học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ kinh phí thực nghiên cứu (theo hợp đồng số 64/2018/HĐ-SKHCN ngày 21/6/2018) 91 Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Lệ Hoa Tiên, Nguyễn Thị Dược, Nguyễn Thị Huyền Trang,… TÀI LIỆU THAM KHẢO Shaheed U.R., Kevin Ch., Hye H.Y - Review on a traditional herbal medicine: Eurycoma longifolia Jack (Tongkat Ali): its traditional uses, chemistry, evidence-based pharmacology and toxicology, Molecules 21 (3) (2016) 331 Jiwajinda S., Santisopasri V., Murakami A., Hirai N and Ohigashi H - Quassinoids from Eurycoma longifolia as plant growth inhibitors, Phytochemistry 58 (6) (2001) 959-962 Ang H., Ikeda S., Gan E.K - Evaluation of the potency activity of aphrodisiac in Eurycoma longifolia Jack, Phytotherapy Research 15 (5) (2001) 435-436 Kuo P.C., Damu A.G., Lee K.H., Wu T.S - Cytotoxic and antimalarial constituents from the roots of Eurycoma longifolia, Biorganic & Medicinal Chemistry 12 (2004) 537-544 Miyake K., Li F., Tezuka Y., Awale S., Kadota S - Cytotoxic activity of quassinoids from Eurycoma longifolia, Natural Product Communications (7) (2010) 1009-1012 Le Van Thoi, Nguyen Ngoc Suong - Constituents of Eurycoma longifolia, The Journal of Organic Chemistry 35 (4) (1970) 1104-1109 Pham Bich Ngoc, Thanh Binh Pham, Hai Dang Nguyen, Thu Trang Tran, Hoang Ha Chu and Van Minh Chau, Jeong H.L., Tien Dat Nguyen - A new anti-inflammatory βcarboline alkaloid from the hairy-root cultures of Eurycoma longifolia, Natural Product Research 30 (12) (2016) 1360-1365 Mahmood M., Normi R and Subramaniam S - Optimization of suitable auxin application in arecalcitrant woody forest plant of Eurycoma longifolia (Tongkat Ali) for callus induction, African Journal of Biotechnology (49) (2010) 8417-8428 Hussein S., Ling A.P.K., Tze H.Ng., Ibrahim R and Paek K.Y - Adventitious roots induction of recalcitrant tropical woody plant Eurycoma longifolia, Romanian Biotechnological Letters 17 (1) (2012) 7026-7035 10 Zawawi D.D., Ja’afar H., Zainuddin R., Kari R., Mohd N.M - Thidiazuron induces high frequency direct somatic embryogenesis growth from cotyledon culture of Eurycoma longifolia, Sains Malaysiana 44 (7) (2015) 913-920 11 Murashige T., Skoog F - A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue culture, Physiologia plantarum 15 (1962) 473-497 12 Duncan D.B - Multiple range and multiple F test, Biometrics 11 (1955) 1-42 13 Murnilawati A.G.H., Masitah H., Rosna M.T - Callus induction from tobacco (Nicotiana tabacum) leaf explants for the production of quinone, Asia-Pacific Journal of Chemical Engineering 13 (5/6) (2008) 563-572 14 Sandra M.K., Allen L.M - Effect of BA, NAA, and 2,4-D on red maple callus growth, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 10 (1987) 57-63 92 Nghiên cứu phát sinh hình thái bá bệnh (Eurycoma longifolia) từ nguồn mô ABSTRACT RESEARCH THE EFFECT OF PLANT GROWTH REGULATORS ON MORPHOGENESIS FROM DIFFERENT EXPLANT SOURCES OF Eurycoma longifolia Tran Trong Tuan1*, Nguyen Le Hoa Tien1, Nguyen Thi Duoc1, Nguyen Thi Huyen Trang1, Do Dang Giap1, Trinh Thi Huong2 Institute of Tropical Biology Ho Chi Minh City University of Food Industry *Email: trantrongtuan.com@gmail.com This study was conducted to investigate the effect of plant growth regulators and the type of explants on morphogenesis in Eurycoma longifolia The results showed that, for the cotyledon explants: the rate of callus formation and the fresh weight were the highest, 96.3% and 258 mg respectively when the explants were cultured on the MS medium supplemented with 3.0 mg/L NAA in combination with 0.5 mg/L BA, the calli were yellow and friable; for young leaf explants: the rate of callus formation and fresh weight reached the highest, 100% and 99 mg respectively when the explants were cultured on the MS medium supplemented with 0.5 mg/L NAA in combination with 0.5 mg/L BA, the calli were white and friable; for young petiole explants, the rate of callus formation and fresh weight were the highest 100% and 56 mg respectively when the explants were cultured on the MS medium supplemented with 1.0 mg/L NAA in combination with 2.0 mg/L BA, calli were white and friable The callogenesis time of the petiole explants occurred earlier than callogenesis time of leaf and cotyledons explants The callus formation rate of treatment using BA combined with TDZ was lower than treatment using BA combined with NAA The results of this study show that the collected calli have different morphology and colors This will be a diverse source of materials to serve many different research directions such as embryogenesis, cell suspension culture to receive secondary compounds In the study of adventious rooting of in vitro leaf explants, NAA is suitable for the formation of adventious roots of Eurycoma longifolia The research results showed that the average rooting ratio, number of roots/explants and average root length reached the highest, 80%, 2.5 roots/explants, 23.8 mm respectively in the treatment using 1.0 mg/L NAA There was no root formation in ex vitro leaves explants in all treatments Keywords: BA, callus, cotyledon, Eurycoma longifolia, leaves, NAA, petiole, TDZ 93 ... 95% 82 Nghiên cứu phát sinh hình thái bá bệnh (Eurycoma longifolia) từ nguồn mô KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nội dung 1: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên phát sinh hình thái từ nguồn. . .Nghiên cứu phát sinh hình thái bá bệnh (Eurycoma longifolia) từ nguồn mô Cho đến nay, nước ta nước khác có nhiều nghiên cứu tác dụng dược lý, hoạt tính sinh học, nhân giống đặc điểm sinh thái. .. 1,8b * * P *Các chữ a, b… cột thể khác biệt có ý nghĩa mức p= 0,05 90 Nghiên cứu phát sinh hình thái bá bệnh (Eurycoma longifolia) từ nguồn mơ Hình Một số hình thái mơ sẹo hình thái rễ; (a)