Establishment of electroporation protocol for bacillus subtilis 1012 and wb800n

Untitled Science & Technology Development, Vol 18, No T3 2015 Trang 16 Thiết lập quy trình điện biến nạp cho Bacillus subtilis 1012 và WB800N  Phạm Thị Mỹ Tiên  Phan Thị Phượng Trang Trường Đại học[.]

Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 Thiết lập quy trình điện biến nạp cho Bacillus subtilis 1012 WB800N  Phạm Thị Mỹ Tiên  Phan Thị Phượng Trang Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM ( Bài nhận ngày 12 tháng 12 năm 2014, nhận đăng ngày 12 tháng 08 năm 2015) TÓM TẮT Bacillus subtilis chủng chủ biểu 1012 WB800N sử dụng phổ biến mang nhiều ưu điểm bật không sinh nghiên cứu làm chủng chủ độc tố, tiết protein mục tiêu môi biểu protein tái tổ hợp thời gian gần trường nuôi cấy, khoảng 60 % protein công đây, phương pháp điện biến nạp cho nghiệp sản xuất từ chủng Bacillus hai chủng chưa thiết lập Trong Để sử dụng B subtilis nghiên cứu nghiên cứu này, sử dụng plasmid làm chủng chủ biểu protein tái pHT10-gfp+ để tiến hành thiết lập quy trình tổ hợp, phương pháp kỹ thuật di truyền điện biến nạp cho chủng B subtilis 1012 cần phát triển Một phương WB800N Các kết ảnh hưởng pháp mà nhiều nhà khoa học quan tâm điện thời điểm thu mẫu, nồng độ thời gian ủ biến nạp để đưa DNA trực tiếp vào tế bào lysozyme, hiệu điện lượng DNA sử Tuy nhiên vấn đề gặp phải hiệu suất dụng lên tần suất biến nạp khảo sát biến nạp DNA vào B subtilis thấp nghiên cứu để hình thành qui trình điện biến nạp không ổn định chủng khác gây trở ngại cho thao tác di truyền B subtilis Từ khóa: plasmid pHT, điện biến nạp, Bacillus subtilis, 1012, WB800N MỞ ĐẦU B subtilis vi sinh vật có nhiều ứng dụng phương pháp biến nạp, điện biến nạp kỹ thuật quan trọng nghiên cứu công nghệ sinh học [2, 9] Đặc biệt hai chủng B subtilis 1012 WB800N thường sử dụng viện nghiên cứu, phịng thí nghiệm Một bước cần thiết quan trọng cho thao tác di truyền chủng B subtilis biến nạp DNA vào tế bào [2, 11] Có nhiều phương pháp chuyển DNA vào tế bào vi khuẩn sử dụng deoxyribonucleate [10], biến nạp qua protolast [3], hay xử lý với alkali [1] Hạn chế phương pháp hiệu suất biến nạp thấp đòi hỏi lượng DNA cao khoảng 10 µg cho lần biến nạp Trong số đơn giản phổ biến cho nhiều loài vi khuẩn khác cho tần suất biến nạp cao [4] Kỹ thuật dùng thẩm điện để tạo lỗ tạm thời màng cho phép DNA trần vào bên tế bào Mặc dù điện biến nạp áp dụng rộng rãi cho nhiều chủng vi sinh vật khác việc sử dụng cho B subtilis nhiều hạn chế Ngun nhân cho vấn đề quy trình điện biến nạp vào chủng B subtilis không ổn định chủng khác Để tạo tế bào khả nạp cho điện biến nạp B subtilis thường sử dụng sorbitol, manitol Xue (1999) cải tiến phương pháp Trang 16 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SỐ T3- 2015 Vehmaanpera (1989) cách thêm sorbitol manitol vào môi trường điện biến nạp để tạo áp suất thẩm thấu làm tế bào co rút giảm tính khơng thấm màng [5] Lysozyme enzyme có hoạt tính phân giải vách tế bào, việc khảo sát nồng độ khác lysozyme nhằm tìm nồng độ tối ưu thủy phân phần vách tế bào mà không phá màng nhằm hỗ trợ cho DNA dễ dàng qua màng lúc thẩm điện cần thiết Trong nghiên cứu này, thiết lập quy trình điện biến nạp cho B subtilis 1012, B Subtilis WB800N nâng cao tần suất biến nạp Quy trình xây dựng dựa vào phương pháp điện biến nạp cho chủng B subtilis số báo công bố kết hợp với khảo sát ảnh hưởng thời điểm thu mẫu, nồng độ thời gian ủ lysozyme, hiệu điện biến nạp, lượng DNA Chúng sử dụng plasmid pHT10-gfp+ có mang gen kháng kháng sinh Cm (chloramphenicol) gen thị gfp để xác định tần suất biến nạp VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chủng vi sinhvật plasmid Chủng B subtilis 1012 (leuA8 metB5 trpC2 hsdRM1) [8] B subtilis WB800N (nprE aprE epr bpr mpr :: ble nprB :: bsr vpr wprA :: hyg cm :: neo; NeoR)[6] Plasmid pHT10-gfp+[7] sử dụng biến nạp vào hai chủng nhằm xác định tần suất biến nạp Khuẩn lạc mang plasmid pHT10-gfp+ biểu GFP cho màu xanh lục đèn UV Xây dựng đường cong tăng trưởng Chủng B subtilis hoạt hóa qua đêm mL môi trường LB (10 g trypton, g cao nấm men, g NaCl, dH2O vừa đủ lít) chuyển sang 200 mL LB có bổ sung 0,5 M sorbitol cho đo giá trị OD600 ban đầu đạt 0,1 Chủng B subtilis nuôi cấy lắc o 250 vòng/phút 37 C đo OD600 sau nuôi cấy, xây dựng đường cong tăng trưởng cho hai chủng B subtilis 1012 WB800N Xác định pha tăng trưởng lag, log, ổn định suy tàn chủng Tạo tế bào khả nạp Hoạt hóa chủng B subtilis qua đêm mL LB Sau cấy chuyền dịch ni cấy sang 200 mL LB có bổ sung 0,5 M sorbitol cho OD600 ban đầu đạt mức 0,1; lắc 37 oC tốc tộ lắc 250 vòng/phút Đo OD600 sau nuôi cấy, dịch nuôi cấy tế bào tăng trưởng vào pha log bắt đầu thu dịch nuôi cấy tế bào, theo thời điểm khác Xử lý dịch tế bào với lysozyme µg/mL 10 phút Tiếp theo, ủ lạnh dịch nuôi cấy đá phút ly tâm thu sinh khối 6000 vòng/phút phút, loại bỏ dịch Bước rửa lặp lại lần sử dụng đệm EB (0,5 M sorbitol, 0,5 M manitol, 10 % glycerol) ly tâm 6000 vòng/phút phút [5] Phân tán sinh khối tế bào lại EB với tỉ lệ pha loãng 1/40 bảo quản -80 oC Điện biến nạp plasmid vào tế bào khả nạp Tế bào khả nạp biến nạp pHT10-gfp+ thẩm điện máy điện biến nạp Micro Pulser Bio-Rad Trộn 100 µL tế bào khả nạp với µL plasmid 100 ng/µL, chuyển tế bào vào cuvette điện biến nạp 0,2 cm giữ đá lạnh phút Sau tế bào thẩm điện 25 µF, 200 , 2,5 kV/cm khoảng – ms Phục hồi tế bào mL môi trường phục hồi LB bổ sung 0,5 M sorbitol, 0,38 M manitol, 10 % glycerol vào tế bào vừa thẩm điện [5] Tiếp theo dịch tế bào lắc 37 oC, tốc độ lắc 250 vòng /phút Toàn tế bào trải đĩa LB – Agar có bổ sung chloramphenicol, ủ đĩa 37 oC qua đêm Những khuẩn lạc mọc đĩa có kháng sinh chứng tỏ có mang plasmid Đếm số khuẩn lạc mọc đĩa để tính hiệu suất biến nạp Trang 17 Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất điện biến nạp Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất biến nạp khảo sát sau: Khảo sát ảnh hưởng thời điểm thu mẫu: giai đoạn tăng trưởng khác tế bào từ pha log đến pha cân thu nhận tạo tế bào khả nạp với quy trình Khảo sát ảnh hưởng nồng độ lysozyme: thu tế bào giai đoạn tăng trưởng thích hợp cho hiệu suất biến nạp cao khảo sát sau xử lý lysozyme cách bổ sung lysozyme vào dịch tế bào cho nồng độ cuối 0,5; 1; 2; µg/mL lắc 37 oC 10 phút Tiếp tục làm theo quy trình tạo tế bào khả nạp Khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ với lysozyme: chọn nồng độ lysozyme tối ưu khảo sát khoảng thời gian ủ 5, 10, 15 20 phút Khảo sát ảnh hưởng hiệu điện thế: tế bào khả nạp biến nạp với dãy hiệu điện từ 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV/cm Khảo sát ảnh hưởng nồng độ plasmid: tạo tế bào khả nạp với quy trình chọn thời Trang 18 điểm thu mẫu nồng độ lysozyme thích hợp Điện biến nạp với nồng độ khác plasmid pHT10-gfp+: 0,05; 0,1; 0,2 µg/µL Khảo sát hiệu suất biến nạp với nhiều loại plasmid: plasmid khác dùng biến nạp vào hai chủng B subtilis 1012 WB800N để đánh giá hiệu suất biến nạp tương ứng với loại plasmid khác KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đường cong tăng trưởng Dựa vào đường cong tăng trưởng B subtilis 1012 WB800N (Hình 1) nhận thấy khoảng đầu tế bào tăng trưởng pha tiềm tàng, từ – tế bào vào pha log, từ – 16 tế bào vào pha ổn định sau 16 tế bào vào pha suy tàn Đường cong tăng trưởng sở để xác định thời điểm thu mẫu thích hợp cho tính khả nạp tế bào Mỗi chủng vi khuẩn q trình tăng trưởng có giai đoạn tế bào có khả khả nạp tốt nhất, giai đoạn tùy thuộc vào đặc tính tăng trưởng chủng Log2 (OD600nm) TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SỐ T3- 2015 2,61 1,5 2,02 3,01 2,3 3,6 4,6 5,3 5,4 5,5 5,5 4,06 4,3 3,6 4,2 4,2 3,4 4,1 3,2 2,6 0,67 0,5 B subtilis WB800N 0,34 B.s WB800N 0,25 0,125 B 1012 subtilis 1012 B.s 0,74 1,08 5,3 5,12 0,22 0,1 0,1 0,0625 10 15 20 Thời gian (giờ) Hình Đường cong tăng trưởng B subtilis 1012 B subtilis WB800N môi trường LB – 0,5 M sorbitol Ảnh hưởng thời điểm thu mẫu Mẫu thu tăng trưởng tế bào vào pha log pha ổn định giai đoạn tế bào có sức sống tốt thích hợp làm tế bào khả nạp tính số khuẩn lạc µg DNA plasmid Kết Hình cho thấy thời điểm pha log tế bào bắt đầu khả nạp hiệu suất biến nạp cho điện biến nạp Tiếp theo tiến hành bước tạo tế bào khả nạp thời điểm thu mẫu nêu Giá trị OD600 tương ứng với hiệu suất biến nạp chủng B subtilis 1012 chủng B subtilis WB800N Hình Hiệu suất biến nạp thấp, hiệu suất bắt đầu tăng cao tế bào tăng trưởng vào pha ổn định tối ưu thời điểm đầu pha ổn định sau hiệu suất biến nạp giảm dần B subtilis WB800N Hiệu suất biến nạp (x102 CFU µg-1 DNA) Hiệu suất biến nạp (x102 CFU µg-1 DNA) B subtilis 1012 1,5 2,61 3,01 3,6 4,06 4,3 4,6 OD 600 1,08 2,02 2,3 2,6 3,2 3,4 OD 600 Trang 19 Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 Hình Hiệu suất biến nạp thời điểm thu mẫu từ đầu pha log đến đầu pha ổn định chủng B subtilis 1012 WB800N Như xác định thời điểm thu mẫu thích hợp cho hai chủng B subtilis 1012 Hiệu suất biến nạp hai chủng tăng dần theo nồng độ lysozyme từ 0,5 – µg/mL bắt WB800N vào khoảng cuối pha log đầu pha ổn định Vì vi khuẩn Bacillus nói chung có tính khả nạp cao giai đoạn tăng trưởng cuối pha log, vào pha ổn định bắt đầu giai đầu giảm hiệu suất nồng độ µg/mL (Hình 3) Ở nồng độ µg/mL hiệu suất biến nạp thấp, điều cho thấy nồng độ lysozyme cao ly giải tế bào Trong khoảng nồng độ từ đoạn tạo bào tử nên tính khả nạp giảm 0,5 – µg/mL lysozyme làm mỏng lớp vách tế bào tạo điều kiện thuận lợi cho DNA vào tế bào kích thích thẩm điện Kết khảo sát cho thấy nồng độ lysozyme tối ưu để xử lý tế bào bước làm tế bào khả nạp µg/mL 37 oC 10 phút Khoảng nồng độ lysozyme xử lý để tạo tế bào khả nạp từ 0,5 – µg/mL Ảnh hưởng lysozyme Trong thí nghiệm ảnh hưởng lysozyme, thu dịch nuôi cấy tế bào giai đoạn tăng trưởng thích hợp cho hai chủng B subtilis 1012 WB800N khoảng cuối pha log Tiếp theo, tiến hành tạo tế bào khả nạp với quy trình xử lý với lysozyme nồng độ khác từ 0,5; 1; 2; µg/mL B subtilis 1012 B subtilis WB800N Hiệu suất biến nạp (x103 CFU µg-1 DNA) Hiệu suất biến nạp (x103 CFU µg-1 DNA) 2,5 1,5 0,5 0,5 Nồng độ lysozyme µg/ml 0,5 Nồng độ lysozyme µg/ml Hình Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ lysozyme lên hiệu suất biến nạp Ảnh hưởng thời gian ủ với lysozyme Sau chọn nồng độ tối ưu cho xử lý tế bào tiếp tục khảo sát thời gian xử lý tế bào với lysozyme nồng độ µg/mL Thời gian khảo sát 5, 10, 15, 20 phút Kết thể Trang 20 Hình cho thấy khoảng thời gian ủ từ 10 – 15 phút hiệu suất biến nạp cao Ủ khoảng phút ngắn 20 phút dài cho trình hoạt động lysozyme để xử lý vách tế bào hiệu suất biến nạp thấp TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SỐ T3- 2015 B subtilis 1012 B subtilis WB800N Hiệu suất biến nạp (x103 CFU µg-1 DNA) Hiệu suất biến nạp (x103 CFUµg-1 DNA) 3,5 2,5 1,5 0,5 0 10 15 20 Thời gian (phút) 10 15 20 Thời gian (phút) Hình Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ với lysozyme lên hiệu suất biến nạp Với kết chúng tơi chọn khoảng thời gian thích hợp cho xử lý tế bào với nồng độ lysozyme µg/mL 15 phút Ảnh hưởng hiệu điện Hiệu suất biến nạp thay đổi theo hiệu điện Hiệu suất hai chủng tăng dần theo dãy hiệu điện từ 1,9 – 2,5 kV/cm (Hình 5) Giá trị hiệu điện 2,5 kV/cm cho hiệu suất biến nạp cao hai chủng.Thẩm điện tạo lỗ tạm thời màng giúp DNA plasmid vào tế bào, thẩm điện với hiệu điện cao giúp DNA vào tế bào dễ dàng B subtilis 1012 B subtilis WB800N 3,5 2,5 Hiệu suất biến nạp (x103CFU µg-1 DNA) Hiệu suất biến nạp (x103CFU µg-1 DNA) 1,5 0,5 1,9 2,1 2,3 2,5 kV/cm 1,9 2,1 2,3 2,5 kV/cm Hình Hiệu suất biến nạp B subtilis 1012 WB800N tương ứng với dãy hiệu điện từ 1,9 – 2,5 kV/cm Ảnh hưởng nồng độ plasmid Trang 21 Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 Để xác định ảnh hưởng nồng độ plasmid lên tần suất biến nạp, nồng độ plasmid với nồng độ 0,05; 0,1; 0,2 µg biến nạp vào tế bào khả nạp hiệu suất tương ứng với nồng độ plasmid thể Hình Hiệu suất biến nạp tính theo số khuẩn lạc/µg plasmid Hiệu suất biến nạp cao nồng độ sử dụng biến nạp thấp Cụ thể với nồng độ plasmid 0,05 µg hiệu suất đạt 1,2 x103 B subtilis 1012 2,25x103 B subtilis WB800N Song song với điện biến nạp, thực việc biến nạp theo phương pháp tự nhiên sử dụng phương pháp mô tả [12] với plasmid pHT01-gfp+ Kết cho thấy, phương pháp điện biến nạp cho kết hiệu suất biến nạp cao phương pháp thơng thường phương pháp thơng thường cần lượng plasmid khoảng 10 µg để biến nạp vào B subtilis nên tần suất biến nạp thấp khoảng – khuẩn lạc/ µg DNA Kết khả quan cho việc ứng dụng quy trình tạo dịng plasmid trực tiếp vào B subtilis mà không thông qua bước dịng hóa trung gian E coli 4,5 3,5 2,5 1,5 0,5 Hiệu suất biến nạp (x103 µg-1 DNA) B.B s 1012 subtilis 1012 subtilis WB800N B.B s WB800N 0,05 0,1 0,2 ng Hình Hiệu suất biến nạp theo nồng độ plasmid hai chủng B subtilis 1012 WB800N Hoàn thiện qui trình tạo tế bào khả nạp điện biến nạp Dựa vào kết khảo sát trên, chúng tơi hồn thiện qui trình điện biến nạp cho hai chủng B subtilis 1012 B subtilis WB800N sau: tế bào tăng trưởng mơi trường LB có 0,5 M sorbitol, thời điểm thu mẫu tạo tế bào khả nạp khoảng cuối pha log, đầu pha ổn định Dịch nuôi cấy tế bào xử lý lysozyme với nồng độ cuối µg/ml cách lắc 250 vịng/phút 37 oC 15 phút, rửa tế bào với đệm EB chứa 0,5 M sorbitol; 0,5 M manitol, 10 % glycerol, lặp lại Trang 22 bước rửa lần Giữ tế bào đệm EB 80 °C Plasmid dùng cho biến nạp 0,1 µg plasmid/100 µL tế bào khả nạp thẩm điện 25 µF, 200 , 2,5 kV/cm giây, phục hồi tế bào mL mơi trường LB có bổ sung 0,5 M sorbitol, 0,38 M manitol, lắc 250 vòng/ phút 37 oC, trải tế bào lên đĩa LB –Agar có kháng sinh thích hợp, ủ 37 oC qua đêm Để kiểm chứng qui trình thiết lập trên, tiến hành biến nạp plasmid khác loại tế bào khả nạp chuẩn bị theo qui trình trên, kết cho thấy tất TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SOÁ T3- 2015 plasmid biến nạp vào chủng chủ B subtilis 1012 B subtilis WB800N Kết khẳng định tính ổn định qui trình thiết lập cho hai chủng Tuy hiệu suất biến nạp nghiên cứu chưa cao (103 CFU/µg DNA) nghiên cứu chủng B subtilis khác cơng bố (105CFU/µg DNA) [5], qui trình thiết lập làm sở cho nghiên cứu B subtilis 1012, B subtilis WB800N chủng B subtilis khác KẾT LUẬN Chúng thiết lập qui trình điện biến nạp ổn định cho B subtilis 1012 B subtilis WB800N Nồng độ plasmid sử dụng 0,1 µg, hiệu suất biến nạp (103 CFU/µg DNA) Kết làm sở cho quy trình dịng hoa cách biến nạp trực tiếp sản phẩm nối vào B subtilis mà không cần qua bước tạo dòng qua trung gian E coli Establishment of electroporation protocol for Bacillus subtilis 1012 and WB800N  Phạm Thi My Tien  Phan Thi Phuong Trang University of Science, VNU-HCM ABSTRACT Bacillus subtilis has been developed as an attractive expression host because of many advantages For examples, it is nonpathogenic and allows secretion of functional extracellular proteins directly into the culture medium; about 60 % of industrial enzymes available produced by Bacillus species To use B subtilis strain for research and as host strain for expression of recombinant protein, bacterial genetic methods should be developed Electroporation to transfer directly DNA into B subtilis is one of the methods that draw a lot of attention of scientists A problem encountered in the methods that draw a lot of attention of scientists A problem encountered in the electroporation of DNA into B subtilis is that an established protocol for one strain can hardly be used for another strain B subtilis 1012 and WB800N have recently been used as expression hosts for expression of recombinant proteins, but electroporation method has not been established In this study, we use a pHT plasmid to establish an electroporation protocol for B subtilis 1012 and WB800N The influence of sampling time, concentration and time for incubating with lysozyme, voltage on the transformation was investigated to establish the protocol Keywords: plasmid pHT, electroporation, Bacillus subtilis, 1012, WB800N Trang 23 Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] T Ano, A Kobayashi, M Shoda, Transformation of Bacillus subtilis with the treatment by alkali cations Biotechnology Letters,12, 2, 99–104 (1990) [2] A Brans, P Filée, A Chevigné, A Claessens, B Joris, New integrative method to generate Bacillus subtilis recombinant strains free of selection markers Applied and Environmental Microbiology, 70, 12, 7241– 7250 (2004) [3] S Chang, S.N Cohen, High frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA Molecular & General Genetics: MGG, 168, 1, 111–115 (1979) purification of recombinant proteins in Bacillus subtilis Current Microbiology, 55, 2, 89–93 (2007) [8] H Saito, T Shibata, T Ando, Mapping of genes determining nonpermissiveness and host-specific restriction to bacteriophages in Bacillus subtilis Marburg Molecular & General Genetics: MGG170, 2, 117–122 (1979) [9] M Schallmey, A Singh, O.P Ward, Developments in the use of Bacillus species for industrial production Canadian Journal of Microbiology, 50, 1, 1–17 (2004) [4] R.C Kuhad, R Gupta, A Singh, Microbial cellulases and their industrial applications Enzyme Research., 1–10 (2011) [10] J Spizizen,Transformation of biochemically deficient strains of Bacillus subtilis by deoxyribonucleate Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 44, 10, 1072–1078 (1958) [5] Y.P Lu, C Zhang, F.X Lv, X.M Bie, Z.X Lu, Study on the electro-transformation conditions of improving transformation efficiency for Bacillus subtilis Letters in Applied Microbiology, 55, 1, 9–14 (2012) [11] A.L Zhang, H Liu, M.M Yang, Y Gong, S Chen, H Assay and characterization of a strong promoter element from B subtilis Biochemical and Biophysical Research Communications, 354, 1, 90–95 (2007) [6] Nguyen, H.D., Phan, T.T.P, Schumann, W., Analysis and application of Bacillus subtilis sortases to anchor recombinant proteins on the cell wall AMB Express,1, 1, 22 (2011) [12] http://www.mobitec.com/cms/products/bio/0 4_vector_sys/bacillus_subtilis_expression.ht ml? pdf=Bacillus_subtilis_Expression_VectorsHandbook [7] Nguyen, H.D, Phan, T.T.P and Schumann, W., Expression vectors for the rapid Trang 24 ... nạp trực tiếp sản phẩm nối vào B subtilis mà khơng cần qua bước tạo dịng qua trung gian E coli Establishment of electroporation protocol for Bacillus subtilis 1012 and WB800N  Phạm Thi My Tien... problem encountered in the electroporation of DNA into B subtilis is that an established protocol for one strain can hardly be used for another strain B subtilis 1012 and WB800N have recently been... hosts for expression of recombinant proteins, but electroporation method has not been established In this study, we use a pHT plasmid to establish an electroporation protocol for B subtilis 1012 and