Untitled Science & Technology Development, Vol 19, No T3 2016 Trang 24 Thiết lập qui trình trữ lạnh mô buồng trứng trên mô hình bò Nguyễn Thị Phương Dung Nguyễn Thị Thu Lan Hồ Mạnh Tường Đơn vị[.]
Science & Technology Development, Vol 19, No.T3-2016 Thiết lập qui trình trữ lạnh mơ buồng trứng mơ hình bị Nguyễn Thị Phương Dung Nguyễn Thị Thu Lan Hồ Mạnh Tường Đơn vị hỗ trợ sinh sản, Bệnh viện An Sinh (IVFAS) Nguyễn Minh Tài Lộc Trung tâm nghiên cứu di truyền sức khỏe sinh sản (CGRH), Khoa Y, ĐHQG-HCM Nguyễn Nhật Quang Huỳnh Chí Thiện Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 07 tháng 09 năm 2015, nhận đăng ngày 06 tháng 05 năm 2016) TÓM TẮT Trữ lạnh mô buồng trứng giải pháp phù hợp nhằm bảo tồn khả sinh sản phụ nữ trước điều trị bệnh lý có nguy ảnh hưởng đến chức buồng trứng khả sinh sản sau Toàn phần buồng trứng bảo quản lạnh để sử dụng tương lai Mục tiêu nghiên cứu nhằm thiết lập qui trình trữ lạnh mơ buồng trứng mơ hình bị để ứng dụng người Phương pháp tiến hành bao gồm thu nhận buồng trứng bò từ lò mổ bảo quản oC tối đa 12 trước tiến hành thí nghiệm Phần vỏ mơ buồng trứng xử lý để thu nhận mảnh mơ với kích thước 10x10x1 mm Các mảnh vỏ mơ buồng trứng chia ngẫu nhiên thành nhóm: (1) mẫu mô trước đông lạnh (đối chứng), (2) mẫu mô đông lạnh phương pháp đông lạnh chậm (3) mẫu mô đông lạnh phương pháp thủy tinh hóa Sau đó, mảnh mơ buồng trứng xử lý với men Collagenase Ia để phân lập nang noãn nhuộm với Neutral Red Tỉ lệ nang noãn sống sót sau đơng lạnh rã đơng mơ buồng trứng sử dụng làm tiêu đánh giá hiệu qui trình đơng lạnh Kết tỉ lệ nang nỗn sống sót nhóm đơng lạnh chậm thủy tinh hóa so với nhóm chứng 72,46 ± 6,11 % 59,09 ± 7,08 % Đây nghiên cứu thiết lập thành công qui trình đơng lạnh mơ buồng trứng mơ hình bị Việt Nam Tuy nhiên, qui trình thiết lập cần cải tiến để ứng dụng điều trị người tương lai Từ khóa: nang nỗn, trữ mơ buồng trứng, đơng lạnh chậm, thủy tinh hóa MỞ ĐẦU Bảo tồn khả sinh sản mục tiêu quan trọng ứng dụng công nghệ hỗ trợ sinh sản (HTSS) động vật đặc biệt người Với mục tiêu này, phương pháp trữ lạnh khác thực nhiều đối tượng giao tử (tinh trùng/nỗn), phơi mơ (tinh hồn/buồng trứng) Trong năm gần đây, Trang 24 trữ lạnh mô buồng trứng (MBT) người nhiều quốc gia giới quan tâm nhằm bảo tồn khả sinh sản bé gái trước tuổi dậy phụ nữ độ tuổi sinh sản mắc bệnh lý có nguy ảnh hưởng đến chức buồng trứng TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SOÁ T3- 2016 Kỹ thuật trữ lạnh MBT với cấy ghép mô sau trữ lạnh - rã đông nhằm phục hồi khả sinh sản báo cáo chuột cách 50 năm Trải qua 30 năm sau đó, kỹ thuật tiếp tục thử nghiệm nhiều mơ hình động vật Trong đó, thử nghiệm thành công cấy ghép MBT sau trữ lạnh phương pháp hạ nhiệt độ chậm giúp hồi phục chức buồng trứng khả mang thai, sinh cừu Sau đó, trường hợp sinh sau cấy ghép MBT trữ lạnh báo cáo tinh tinh vào năm 2004 [1] Đến năm 1996, trữ lạnh MBT thực thành công người Ca cấy ghép thành công MBT trữ lạnh người báo vào năm 2000 Từ năm 2004, số trung tâm giới công bố trường hợp em bé sinh sau người mẹ hồi phục sau điều trị ung thư cấy ghép thành công MBT qua trữ lạnh – rã đông Cho đến nay, có 24 trường hợp sinh sau cấy ghép MBT trữ lạnh người giới [2, 3] Tại Việt Nam, khảo sát Bệnh viện Ung bướu Thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỉ lệ phụ nữ mắc bệnh lý ác tính buồng trứng ngày gia tăng, riêng năm 2013 có 22.000 bệnh nhân chẩn đoán ung thư buồng trứng 1/8 số bệnh nhân độ tuổi 45 Đồng thời, tỉ lệ phụ nữ độ tuổi sinh sản mắc bệnh lý lành tính buồng trứng ngày tăng Trên thực tế, trình điều trị bệnh liên quan đến buồng trứng dẫn đến định cắt bán phần tồn buồng trứng Đồng thời, q trình xạ trị, hóa trị phụ nữ mắc bệnh ung thư khác gây ảnh hưởng đến chức buồng trứng sau buồng trứng bảo tồn thể [4] Như vậy, bảo quản lạnh MBT giải pháp “trả lại” hội làm mẹ cho đối tượng bệnh nhân tương lai, giúp nâng cao chất lượng sống cho bệnh nhân sau điều trị Bên cạnh đó, kỹ thuật HTSS Việt Nam, đặc biệt kỹ thuật bảo quản lạnh, thực từ năm 1998 hiệu ứng dụng ngang tầm với nhiều nước giới Tuy nhiên, kỹ thuật trữ lạnh MBT người chưa triển khai trung tâm HTSS nước Trước nhu cầu đó, nghiên cứu thực nhằm thiết lập qui trình trữ lạnh MBT mơ hình bị nhằm tiến đến ứng dụng người Đây nghiên cứu lĩnh vực Việt Nam, gắn kết việc nghiên cứu với ứng dụng điều trị lâm sàng bệnh viện có chương trình HTSS VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Thu nhận xử lý buồng trứng bò Buồng trứng bò thu nhận lò mổ thuộc công ty Việt Nam Kỹ nghệ Súc sản (VISSAN) Tại thời điểm thu nhận, buồng trứng rửa dung dịch muối sinh lý, bổ sung kháng sinh penicillin (100 IU/mL) bảo quản môi trường Flushing (Medicult, Origio) o C tối đa 12 trước tiến hành thí nghiệm Tại phịng thí nghiệm CGRH, dao mổ y tế dụng cụ cố định mẫu mô buồng trứng (Kitazato, Nhật) sử dụng để cắt phần vỏ MBT thành mảnh mơ có kích thước 10x10x1 mm Các mảnh mô giữ môi trường TCM-199 (Sigma) nhiệt độ phòng tiến hành phân lập nang noãn (mẫu đối chứng) trữ lạnh sau Trữ lạnh rã đơng mơ buồng trứng Phương pháp hạ nhiệt độ chậm theo chương trình tự động (slow-freezing) Đơng lạnh: MBT bị chuyển vào cryotube 1,8 mL (Nunc, Mỹ) có chứa mL mơi trường đông lạnh ES (EG 1,5 M; sucrose 0,1 M), đặt oC 60 phút, lắc nhẹ Sau đó, cryotube chứa MBT đặt vào máy hạ nhiệt độ tự động CL-8800 (CryoLogic, Úc) thực chương trình hạ nhiệt độ chậm: từ 24 oC đến -6,5 oC (tốc độ oC/phút) tạo mầm tinh thể đá (seeding) giữ 10 phút từ -6,5 oC đến -35 oC Trang 25 Science & Technology Development, Vol 19, No.T3-2016 (tốc độ -0,3 oC/phút) từ -35 oC đến -122 oC (tốc độ -8 oC/phút) giữ 10 phút -196 oC (nhúng trực tiếp vào nitrogen lỏng) Kết thúc trình trên, cryotube chứa MBT lưu giữ bình nitrogen lỏng (-196 oC) tuần rã đông Rã đông: Cryotube chứa MBT bò trữ lạnh lấy khỏi nitrogen lỏng nhúng trực tiếp vào bể nước ấm 37 oC phút Sau đó, chuyển mơ vào mơi trường rã đơng TS (EG 0,75 M; sucrose 0,25 M) 10 phút Tiếp theo, rửa mô môi trường rửa (sucrose 0,1 M) môi trường rửa (TCM-199), 10 phút/bước Giữ mô ổn định môi trường TCM-199 37 o C, % CO2 15 phút trước đánh giá tỉ lệ nang noãn sống Phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) Đơng lạnh: MBT chuyển vào ống nghiệm (BD Falcon, Mỹ) chứa 10 mL môi trường VS1 (7,5 % EG; 7,5 % DMSO) 25 phút Sau đó, mơ chuyển sang ống nghiệm chứa 10 mL môi trường VS2 (20 % EG; 20 % DMSO, 0,5 M sucrose) 15 phút Đặt mô lên dụng cụ trữ lạnh cryotissue (Kitazato, Nhật) giấy nhôm tự chế (Việt Nam), nhanh chóng nhúng dụng cụ chứa mô vào nitrogen lỏng (-196 o C), đậy nắp bảo vệ cất mẫu vào bình lưu trữ (-196 oC) rã đông Rã đông: Lấy dụng cụ chứa mô trữ lạnh khỏi nitrogen lỏng nhúng trực tiếp vào ống nghiệm chứa 10 mL môi trường TS1 (1M sucrose) 37 oC phút, mảnh mô rơi khỏi dụng cụ trữ vào môi trường Chuyển mô vào môi trường TS2 (0,5 M sucrose) phút Sau đó, rửa mơ lần môi trường TCM-199, phút/lần Mô sau rã đông giữ ổn định môi trường TCM-199 37 oC, % CO2 15 phút đánh giá nang noãn sống Trang 26 Phân lập nang nỗn nhuộm nang nỗn Các mảnh MBT trước đơng lạnh (đối chứng) mô sau trữ lạnh – rã đơng (thí nghiệm) chuyển vào mơi trường TCM-199 bổ sung men Collagenase Ia (1 mg/mL) 30 phút 37 oC Dùng pippette Pasteur hút nhả mô nhiều lần, loại bỏ mảnh mô lớn ly tâm dịch sau xử lý với tốc độ 2.500 vòng/phút/5phút Loại dịch nổi, rửa huyền phù sau ly tâm cấy vào môi trường TCM-199 bổ sung thuốc nhuộm Neutral Red (50 µg/l) 37 oC, % CO2 Nang noãn sống bắt màu đỏ Neutral Red quan sát kính hiển vi đảo ngược (ở độ phóng đại x20) Xác định tỉ lệ nang nỗn sống sót Tỉ lệ nang nỗn sống sau phân lập lơ thí nghiệm lơ đối chứng xác định cách đếm bách phân số nang noãn sống chết quan sát sau tiến hành nhuộm với Neutral Red, đếm tối thiểu 200 nang noãn/lần đếm lần với lơ thí nghiệm Tỉ lệ nang nỗn sống sót sau lơ thí nghiệm tính theo cơng thức sau: KẾT QUẢ Đặc điểm mẫu mơ buồng trứng sử dụng thí nghiệm Trong 10 lơ thí nghiệm, tổng cộng 37 buồng trứng bị sử dụng để thu nhận mô vỏ buồng trứng Đặc điểm buồng trứng lơ thí nghiệm đánh giá thơng qua diện tích bề mặt buồng trứng (mơ chương trình Autocard 2007 dựa vào kích thước đo chiều buồng trứng), số lượng nang noãn phân lập trung bình mẫu mơ tỉ lệ nang nỗn phân lập có đường kính ≥ 15 µm (Bảng 1) TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T3- 2016 Bảng Đặc điểm mơ buồng trứng bị lơ thí nghiệm Lơ thí nghiệm 10 Trung bình Số buồng trứng 4 2 Diện tích bề mặt/ buồng trứng (cm2) 12,15 10,17 13,27 18,43 9,43 22,80 21,29 12,54 14,24 10,07 14,44 ± 2,68 Tỉ lệ nang noãn sống sau trữ lạnh - rã đông mô buồng trứng Tỉ lệ nang nỗn sống lơ thí nghiệm xác định để tính tỉ lệ nang nỗn sống sót sau Số nang nỗn phân lập/mảnh mơ (nang) 18 982 31 637 31 637 50 619 71 184 71 184 71 184 55 365 15 818 23 728 44 134 ± 13 899 Tỉ lệ nang nỗn phân lập có đường kính ≥ 15 µm (%) 7,21 11,20 4,60 15,24 19,69 20,50 2,33 10,32 5,43 2,87 9,94 ± 4,13 trữ lạnh – rã đông MBT Đây thông số cuối để đánh giá hiệu qui trình trữ lạnh – rã đơng MBT (Bảng Bảng 3) Hình Nang noãn sau phân lập nhuộm với Neutral Red (X20) 1: Nang nỗn sống có đường kính ≥ 15µm 2: Nang nỗn khơng sống có đường kính < 15µm 3: Nang nỗn sống có đường kính ≤ 15µm Trang 27 Science & Technology Development, Vol 19, No.T3-2016 Lơ thí nghiệm Bảng Tỉ lệ nang nỗn sống sau phân lập lơ thí nghiệm Thủy tinh hóa Thủy tinh hóa Đối chứng Đơng lạnh chậm dùng cryotissue dùng giấy nhôm 41,51 32,35 27,57 29,43 49,75 38,78 28,84 25,09 38,17 29,75 18,45 21,55 39,25 18,59 18,51 16,16 31,75 20,74 17,92 18,5 41,21 33,11 26,14 23,26 61,83 45,19 40,90 34,95 23,83 18,57 15,54 17,45 29,33 20,86 16,56 18,55 10 43,67 33,04 27,67 24,53 Trung bình 40,03 ± 6,65 29,10 ± 5,67 23,81 ± 7,92 22,95 ± 5,87 (%) Bảng Tỉ lệ nang nỗn sống sót sau trữ lạnh – rã đơng MBT phương pháp Lơ thí nghiệm Đông lạnh chậm 10 Trung bình (%) 77,93 77,95 77,94 47,36 65,32 80,34 73,09 77,93 71,12 75,66 72,46 ± 6,11 Thủy tinh hóa dùng cryotissue 66,42 57,97 48,34 47,16 56,44 63,43 66,15 65,21 56,46 63,36 59,09 ± 7,08 Thủy tinh hóa dùng giấy nhơm 70,90 50,43 56,46 41,17 58,27 56,44 56,53 73,23 63,25 56,17 58,28 ± 9,28 THẢO LUẬN Buồng trứng bò chọn làm đối tượng nghiên cứu trữ lạnh MBT tương đồng kích thước buồng trứng, cấu trúc mô học độ dài chu kỳ sinh nỗn bị người [1] Thực tế, phần vỏ MBT nơi phân bố chủ yếu nang nỗn, nang nỗn ngun Trang 28 thủy chiếm khoảng 94,3 % nang noãn bị [5] Số lượng nang nỗn ngun thủy phản ánh dự trữ noãn buồng trứng nang noãn trải qua trình chiêu mộ, chọn lọc, phát triển để đạt đến nang nỗn trưởng thành, phóng nỗn chu kỳ Do đó, phần vỏ MBT thường TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T3- 2016 trữ lạnh với mục đích bảo tồn khả sinh sản Trong nghiên cứu này, nguồn mẫu thu nhận lò mổ thường buồng trứng từ bò thịt độ tuổi khác bò sữa già nên chất lượng không ổn định Điều phản ánh thơng qua dao động kích thước buồng trứng, số lượng nang noãn phân lập tỉ lệ nang nỗn ngun thủy phát triển (đường kính nang nỗn ≥ 15 µm) lơ thí nghiệm Theo nghiên cứu tác giả Ingrid Raymond vào năm 1996 nang ngun thủy bị có dạng hình cầu dẹt với đường kính hai chiều trung bình 38,0 ± 5,4 µm 28,9 ± 4,3 µm [5] Trong đó, nang nỗn mà chúng tơi phân lập nghiên cứu có đường kính dao động khoảng 10 µm đến 30 µm, nang nỗn có đường kính ≥ 15 µm (9,94 ± 4,13 %) Sự khác biệt xuất phát từ giống bò khác nghiên cứu Đây nghiên cứu ghi nhận đặc điểm nang nỗn giống bị Việt Nam, cung cấp thơng tin cho nghiên cứu có liên quan sau Hiện nay, bảo quản lạnh phương pháp đơng lạnh chậm (slow-freezing) thủy tinh hóa (vitrification) hai phương pháp bảo quản lạnh phổ biến HTSS người Trong lịch sử phát triển, đông lạnh chậm áp dụng trước trở thành phác đồ chuẩn cho trữ lạnh MBT [2] Sau đó, phát triển phác đồ thủy tinh hóa chứng minh hiệu vượt trội đối tượng nỗn phơi Vì vậy, thủy tinh hóa áp dụng MBT năm gần [6] Do nguyên lý hai phương pháp trữ lạnh thủy tinh hóa đơng lạnh chậm khác nhau, chủ yếu dựa nồng độ chất bảo quản đông lạnh sử dụng tốc độ làm lạnh, trình rã đông thực mẫu tế bào mô sau đông lạnh phương pháp hoàn toàn khác Cụ thể, với phương pháp thuỷ tinh hố, nồng độ chất bảo quản đơng lạnh lên đến – M, giúp trình trao đổi nước tế bào, mơ với mơi trường xung quanh diễn thật nhanh triệt để Lúc tốc độ làm lạnh thật nhanh (25.000 – 40.000 oC/phút) nhằm giảm tác động bất lợi cho tế bào mô phải tiếp xúc lâu với mơi trường có nồng độ chất bảo quản đơng lạnh cao Điều xảy tương tự q trình rã đơng phương pháp này, tốc độ rã đông phải thật nhanh nồng độ chất bảo quản đông lạnh môi trường dùng để rã đông thường cao để giúp cho tế bào mơ nhanh chóng trở nhiệt độ sinh lý, trình bù nước cho tế bào, mô diễn thật nhanh Khác với thuỷ tinh hoá, phương pháp hạ nhiệt độ chậm lại sử dụng nồng độ chất bào quản đông lạnh thấp (0,5 – 1,5 M) để giúp lấy nước khỏi tế bào, mơ cách từ từ q trình đơng lạnh, đó, tốc độ hạ nhiệt diễn chậm (0,3 oC/phút) để tế bào, mơ có thời gian trao đổi nước với môi trường pha đầu q trình đơng lạnh, trước vật chất chuyển hồn tồn sang trạng thái đơng Đó lý mà tốc độ rã đơng nồng độ chất bảo quản đông lạnh sử dụng phương pháp thấp nhiều so với thuỷ tinh hố, nhằm giúp tế bào, mơ bù nước cách từ từ cách mà nước rút q trình đơng lạnh Để đánh giá hiệu qui trình trữ lạnh, cấu trúc mơ nang nỗn khả sống, phát triển nang noãn MBT sau trữ lạnh – rã đông ghi nhận Khảo sát cho thấy khác biệt cấu trúc mơ sức sống noãn MBT người sau trữ lạnh – rã đông hai phác đồ trữ lạnh chậm thủy tinh hóa [7] Tuy nhiên, hầu hết trường hợp sinh sau trữ lạnh – rã đông MBT người ghi nhận từ việc sử dụng phác đồ trữ lạnh chậm [8] Mặc dù vậy, chưa đủ sở để khẳng định phác đồ trữ lạnh chậm hay thủy tinh hóa tối ưu cho áp dụng trữ MBT Trong nghiên cứu này, chúng tơi xây dựng qui trình trữ lạnh MBT bị hai phương Trang 29 Science & Technology Development, Vol 19, No.T3-2016 pháp đông lạnh chậm thủy tinh hóa nhằm chọn phác đồ tối ưu để áp dụng người điều kiện Việt Nam Kết cho thấy tỉ lệ nang nỗn sống sót phác đồ trữ lạnh chậm khả quan phác đồ thủy tinh hóa, 72,46 ± 6,11 % so với 59,09 ± 7,08 % (cryotissue) 58,28 ± 9,28 % (giấy nhôm) Báo cáo Mikkel Rosendahl đồng nghiệp vào năm 2011 sử dụng phác đồ trữ lạnh chậm MBT tương tự chuột cho kết tỉ lệ nang noãn sống mẫu đối chứng mẫu sau trữ lạnh rã đông 97 ± 1,30 % 63 ± 8,00 % (tỉ lệ nang nỗn sống sót sau q trình trữ lạnh – rã đơng 64,95%) [7] Như vậy, tỉ lệ nang nỗn sống sót sau q trình trữ lạnh – rã đơng MBT bị phương pháp đông lạnh chậm nghiên cứu khả quan so với nghiên cứu Mikkel Rosendahl đồng nghiệp (2011), 72,46 ± 6,11 % so với 64,95 % Qua cho thấy, phác đồ đơng lạnh chậm MBT mà chúng tơi áp dụng có hiệu Tuy vậy, số vấn đề mà cần cải thiện phác đồ việc thu nhận bảo quản nguồn mẫu trước thí nghiệm để đảm bảo tỉ lệ nang nỗn sống ban đầu tốt Đồng thời, việc xử lý mẫu MBT với men Collagenase Ia cần khảo sát thêm để đánh giá khả ảnh hưởng đến sức sống nang nỗn sau phân lập Trong đó, kết từ báo cáo Noriko Kagawa đồng nghiệp vào năm 2009 áp dụng qui trình thủy tinh hóa MBT bị tương tự với nghiên cứu cho thấy khơng có khác biệt tỉ lệ nang noãn sống mẫu trước sau trữ lạnh – rã đông, khoảng 89 %) [9] Như vậy, phác đồ thủy tinh hóa MBT mà chúng tơi xây dựng cần cải thiện Bên cạnh đó, hiệu đông lạnh – rã đông Trang 30 MBT bị tương đương sử dụng giấy nhơm tự chế để làm dụng cụ trữ lạnh so với sản phẩm thương mại cryotissue nghiên cứu cho thấy khả ứng dụng vật liệu tự chế phù hợp với hoàn cảnh Việt Nam Đây sáng tạo trình tiếp cận qui trình Hiện tại, chưa ghi nhận báo cáo khác việc sử dụng giấy nhôm việc trữ lạnh MBT Đây nghiên cứu xây dựng qui trình trữ lạnh MBT mơ hình bị Việt Nam kết thu nhận ban đầu khả quan Để hồn thiện qui trình trữ lạnh MBT, tiếp tục triển khai theo hướng cải tiến công đoạn bảo quản mẫu MBT trước trữ lạnh, mở rộng hướng đánh giá kết qui trình khảo sát mơ học ni cấy nang noãn sau phân lập KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng thành cơng mơ hình trữ lạnh MBT bị cho kết nang nỗn sống sót sau q trình đơng lạnh – rã đơng mức chấp nhận điều kiện Việt Nam Trong đó, qui trình trữ lạnh chậm MBT sử dụng máy hạ nhiệt độ theo chương trình cho tỉ lệ nang nỗn sống sót cao so với qui trình thủy tinh hóa Thử nghiệm thành cơng giấy nhơm tự chế qui trình thủy tinh hóa MBT bị mở tiềm ứng dụng vật liệu với giá thành thấp thay sản phẩm thương mại Nghiên cứu tiếp tục mở rộng nhằm cải thiện hiệu qui trình trữ lạnh MBT trước tiến đến ứng dụng người Lời cảm ơn: Nghiên cứu thực kinh phí đề tài khoa học cơng nghệ cấp Đại học quốc gia TP HCM TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T3- 2016 Establishment of the ovarian tissue cryopreservation protocol on bovine model Nguyen Thi Phuong Dung Nguyen Thi Thu Lan Nguyen Nhat Quang Ho Manh Tuong The IVF center, An Sinh Hospital (IVFAS) Nguyen Minh Tai Loc The Research Center for Genetics and Reproductive Health (CGRH), Department of Medicine, VNU-HCM Huynh Chi Thien University of Science, VNU-HCM ABSTRACT Ovarian tissue cryopreservation is a suitable method for fertility preservation on women receiving treatment that may threaten the ovarian function and subsequent fertility The whole ovarian or a part of ovarian can be cryopreserved for future use This study was aimed to establish ovarian tissue cryopreservation protocols on bovine model for human application in Vietnam In this method, bovine ovarians were collected from a slaughterhouse and kept at oC up to a maximum of 12 hours before doing experiments The ovarian cortex was cut into pieces of 10x10x1 mm These pieces were randomly divided into groups: (1) fresh species (control group), (2) species were freezed by slow-freezing method and (3) pieces were freezed by vitrification After thawing, ovarian cortex pieces were treated with Collagenase Ia for the follicle isolation The isolated follicles then were stained with Neutral Red The rate of viable follicles was used as the outcome measure to assess the efficiency of the cryopreservation protocol In results, the rates of viable follicles were 72.46 ± 6.11 % and 59.09 ± 7.08 % after slow-freezing and vitrification comparing to the control group, respectively This was the first study which successfully established a protocol of ovarian tissue cryopreservation on bovine model in Vietnam The protocol should be improved for further application to human treatment in the near future Key words: follicle, ovarian tissue cryopreservation, slow-freezing, vitrification TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] R.R Santos, C Amorim, S Cecconi, M Fassbender, M Imhof, J Lornage, M Paris, V Schoenfeldt, B MartinezMadrid, Cryopreservation of ovarian tissue: An emerging technology for female germline preservation of dangered species and breeds, Reprod Sci doi: 10.1016/j.anireprosci 08.010 (2010) [2] J Donnez, B Martinez-Madrid, P Jadoul, A Van Langendonckt, D Demylle, M.M Dolmans, Ovarian tissue cryopreservation and transplantation: a review, Hum Reprod Update, 12, 519–35 (2006) [3] M Rosendahl, K.T Schmidt, E Ernst, P.E Rasmussen, A Loft, A.G Byskov, A.N Andersen, C.Y Andersen, Trang 31 Science & Technology Development, Vol 19, No.T3-2016 Cryopreservation of ovarian tissue for a decade in Denmark: a view of the technique, Reproductive BioMedicine Online, 22, 162 – 171 (2011) [4] D Meirow, D Nugent, The effects of radiotherapy and chemotherapy on female reproduction, Hum Reprod Update, 27, 535-43 (2001) [5] I.L.V Wezel, R.J Rodgers, Morphological characterization of bovine primordial follicles and their environment in vivo, Biology Of Reproduction, 55, 1003-1011 (1996) [6] C.A Amorim, M Curaba, A Van Langendonckt, M.M Dolmans, J Donnez, Vitrification as an alternative means of cryopreserving ovarian tissue, ReprodBiomed Online, 23, 160–86 (2011) Trang 32 [7] V Keros, S Xella, K Hultenby, K Pettersson, M Sheikhi, A Volpe, J Hreinsson, O Hovatta, Vitrification versus controlled-rate freezing in cryopreservation of human ovarian tissue, Hum Reprod, 24, 1670-83 (2009) [8] J Donnez, M.M Dolmans, A Pellicer, C.D Garcia, M.S Serrano, K.T Schmidt, E Ernst, V Luyckx, C.Y Andersen, Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation, Fertil Steril, 99, 1503–13 (2013) [9] N Kagawa, S Silber, M Kuwayama, Successful vitrification of bovine and human ovarian tissue, Reprod Biomed Online, 18, 4, 568-77 (2009) ... vitrification comparing to the control group, respectively This was the first study which successfully established a protocol of ovarian tissue cryopreservation on bovine model in Vietnam The protocol. .. 19, SỐ T3- 2016 Establishment of the ovarian tissue cryopreservation protocol on bovine model Nguyen Thi Phuong Dung Nguyen Thi Thu Lan Nguyen Nhat Quang Ho Manh Tuong The IVF center,... use This study was aimed to establish ovarian tissue cryopreservation protocols on bovine model for human application in Vietnam In this method, bovine ovarians were collected from a slaughterhouse