Expression and purification of listeriolysin o from listeria monocytogenes harbouring e247m and d320k mutations in bacillus subtilis

Untitled Science & Technology Development, Vol 19, No T4 2016 Trang 20 Biểu hiện và tinh sạch listeriolysin O của Listeria monocytogenes mang hai đột biến điểm E247M và D320K trong Bacillus subtilis [.]

Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 Biểu tinh listeriolysin O Listeria monocytogenes mang hai đột biến điểm E247M D320K Bacillus subtilis        Ngô Khắc Huy Nguyễn Lê Tuấn Anh Huỳnh Thị Kim Phương Nguyễn Văn Phúc Trần Linh Thước Nguyễn Đức Hoàng Phan Thị Phượng Trang Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 17 tháng 07 năm 2015, nhận đăng ngày 20 tháng 08 năm 2016) TÓM TẮT Nhằm tăng cường khả biểu protein Listeriolysin O (LLO) từ Listeria B subtilis dễ dàng thu nhận monocytogenes có chức phân hủy màng phương pháp tinh chế qua cột sắc kí chứa ion phospholipid điều kiện pH thấp q trình Ni2+, gen mã hóa protein LLOE247M D320K xâm nhiễm tế bào chủ Yếu tố ứng dung hợp với trình tự LysSRN-6xHisdụng việc phân phối tác chất vào mô TEVsite Kết tinh chế protein tái tổ LLO hoạt động điều kiện pH hợp có độ tinh cao có hoạt tính tán huyết trung tính khơng chứa độc tố trình với HU độc tố khoảng pH từ 5,0 đến 8,5 thu nhận LLO Nghiên cứu nhằm biểu Kết nghiên cứu làm sở cho LLO đột biến E247M D320K hệ thống nghiên cứu ứng dụng Bacillus subtilis nhằm thu nhận LLOE247M D320K có hoạt tính điều kiện pH trung tính Từ khóa: Listeriolysin O, E247M, D320K, Bacillus subtilis, Pgrac, pHT vectors system MỞ ĐẦU Listeria monocytogenes tác nhân gây bệnh có khả ký sinh nội bào cách tùy ý Để xâm nhiễm, tồn nhân lên bên tế bào chủ, vi khuẩn cần sử dụng nhân tố độc lực quan trọng listeriolysin O (LLO) [15] Các chủng L monocytogenes đột biến thiếu LLO (hlyA-) tính gây độc mơ hình tế bào chuột [10] Ngược lại, số chủng vi khuẩn khác Bacillus subtilis mang gen hlyA lại có hoạt tính tán huyết L monocytogenes hoang dại [2] LLO thành viên họ Trang 20 Cholesterol Dependent Cytolysins (CDCs), bao gồm độc tố có khả hình thành lỗ màng chứa cholesterol chủ yếu tìm thấy vi khuẩn Gram dương [13] Ngồi chức hình thành cấu trúc lỗ màng, nhiều nghiên cứu đến cho thấy LLO độc tố đa tác động lên tế bào chủ [15, 5] Độc tố ban đầu vi khuẩn tiết dạng monomer, sau nhận diện thụ thể cholesterol, chúng có khả biến đổi cấu hình hình thành cấu trúc lỗ (dạng oligomer) để TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T4 - 2016 phá vỡ màng phagolysosome giúp giải phóng vi khuẩn bên ngồi tế bào chất [15] Chính nhờ đặc tính hình thành lỗ màng mà LLO có tiềm ứng dụng số chiến lược hỗ trợ vận chuyển tác chất (phân tử thuốc, kháng nguyên – kháng thể, plasmid DNA, antisense oligonucleotide) vào tế bào chất tế bào chủ [6, 11] Tế bào chất hay nhân tế bào nơi hoạt động tiềm nhiều tác chất, nhiên việc đưa đại phân tử vào gặp vài khó khăn, mà chủ yếu chất vào tế bào bị giữ lại tiêu hủy bên phagosome Các nghiên cứu sử dụng liposome đồng vận chuyển tác chất với LLO chứng minh làm tăng hiệu phân phối vào tế bào chất dạng phân phối không sử dụng LLO [7, 8] Tuy nhiên, khác với thành viên cịn lại họ CDCs, LLO có hoạt tính tốt pH acid (5,5) hoàn toàn bị ức chế pH trung tính hay kiềm (pH > 7,0) [3] Nghiên cứu Schuerch cộng [1, 14] đưa số giải thích chế hoạt động phụ thuộc vào pH LLO dựa tương tác acid amin bên cấu trúc nội phân tử Trong đó, số đơn vị mang tính acid chuỗi α-helice thuộc domain D3 có vai trị quan trọng việc cảm biến với pH Nhìn chung, protein họ CDCs có cấu trúc chung bao gồm domain, với vai trị đặc trưng riêng biệt q trình hình thành lỗ Vai trò gắn màng số acid amine quan trọng domain D4 vị trí đầu C protein đảm nhiệm Trong đó, q trình oligomer hóa xảy với phối hợp hoạt động domain cịn lại Trong đó, domain D2 D3 có vai trị quan trọng tạo nên tái xếp dẫn đến biến đổi cấu hình protein Kết trình tái xếp tạo hai cấu trúc βhairpin từ hai α-helice để xuyên qua màng phospholipid Ở điều kiện pH trung tính hay kiềm nhiệt độ 30 oC, vươn sớm α-helice dẫn đến biến tính khơng thuận nghịch gây nên kết tụ protein làm giảm đáng kể hoạt tính chúng Dựa nghiên cứu cấu trúc protein, Schuerch mô tả số dạng đột biến domain khác LLO làm thay đổi số đặc tính quan trọng chúng, đặc biệt tính chất hoạt động phụ thuộc pH Các dạng đột biến điểm E247M, D208S, D320K, E355H L461T mơ tả có khả cải thiện tính bền LLO pH trung tính Glu-247, Asp-320 Glu-208 thành phần quan trọng để hình thành cảm biến pH cho LLO Đột biến điểm E247M cho thấy có khả cải thiện tính bền protein pH 7,4 Dạng LLO mang đột biến D208S hay kết hợp với E247M gây độc cho tế bào E coli Dạng đột biến D320K riêng lẻ có tác động lên tính bền LLO, kết hợp với E247M lại có tác động đáng kể đến tính bền protein điều kiện biến tính pH Khác với dạng đột biến vị trí ba cảm biến, hai dạng đột biến E355H L461T tạo nên dạng LLO có hoạt tính bị tác động yếu tố pH nhiệt độ Giả thuyết cho hai dạng đột biến giúp tăng nhanh tốc độ tái xếp nội phân tử để hình thành cấu trúc lỗ, nhờ vượt qua tác động q trình biến tính pH Do đột biến dạng có xu hướng làm tăng tốc độ hoạt động protein mơi trường trung tính khơng bảo vệ protein khỏi q trình biến tính mơi trường Tuy nhiên, chế phân tử hai dạng đột biến nhiều tranh cãi chưa làm sáng tỏ hoàn toàn [14] Với đặc tính phụ thuộc pH, LLO dạng tự nhiên (LLOWT) gặp phải số khó khăn cần chúng hoạt động mơi trường có pH trung tính dịch ngoại bào, túi phagosome sớm hay bên tế bào chất Hiện nay, để sử dụng LLOWT cho mục tiêu phân phối tác chất, cần phải sử dụng thêm thành phần hỗ trợ dạng liposome đặc biệt để bảo vệ chúng tránh tiếp xúc với mơi trường có pH bất lợi Điều làm tăng Trang 21 Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 độ phức tạp cho việc thiết kế làm giảm hiệu việc phân phối Ngược lại, dạng LLO mang hai đột biến kép (LLOE247M/D320K) mô tả Schuerch cho thấy có nhiều tiềm để thay LLOWT trường hợp cần protein hoạt động điều kiện pH trung tính Khi LLO có khả hoạt động khơng phụ thuộc vào pH đẩy nhanh tốc độ giải phóng tác chất khỏi túi phagosome mà khơng cần đợi q trình giảm pH mơi trường nhờ dung hợp với lysosome, nơi chứa nhiều enzyme phân giải giúp phân hủy nhanh chóng tác chất Mặt khác, dạng đột biến tạo nhiều thuận lợi cho việc biểu hiện, tinh chế bảo quản protein tái tổ hợp vốn sử dụng chủ yếu mơi trường pH trung tính Ngồi ra, để có ứng dụng rộng rãi, protein LLO thu nhận trực tiếp từ L monocytogenes mà cần sản xuất dạng tái tổ hợp với quy mô lớn Tuy nhiên, để biểu protein LLO tái tổ hợp, đa số tác giả sử dụng hệ thống E coli Trái với hệ thống biểu protein tái tổ hợp truyền thống này, B subtilis xem chủng vi sinh vật an tồn (GRAS) Do đó, với mục tiêu sản xuất protein ứng dụng y học, hệ thống B subtilis phù hợp không lẫn nội độc tố chủng vi khuẩn Gram âm việc tinh tiết kiệm chi phí Bên cạnh đó, hệ thống vector pHT sử dụng promoter mạnh Pgrac với kiểm soát biểu chất cảm ứng IPTG cho phép biểu tốt protein mục tiêu nội bào hay tiết môi trường B subtilis [9] Trong nghiên cứu này, vector biểu dạng protein LLO B subtilis tạo dòng từ khung sườn hệ thống plasmid pHT Gen mhlyA đột biến tạo từ hlyA hoang dại phương pháp đột biến đa điểm định hướng VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP Chủng vi sinh vật, plasmid mồi nhân gen Chủng vi sinh vật gồm E coli OmniMAXTM (Invitrogen) sử dụng để dịng hóa gene B subtilis 1012 [12] để biểu protein tái tổ hợp Plasmid pHT322, pHT364 pHT358 cung cấp Trung tâm Khoa học Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Mồi cho phản ứng PCR tổng hợp cơng ty Macrogene Inc Trình tự mồi thể Bảng Sơ đồ vị trí bắt cặp mồi thể Hình Bảng Trình tự mồi sử dụng báo (in đậm nghiêng: trình tự gây đột biến điểm, in đậm gạch dưới: trình tự enzyme cắt giới hạn ) Tên mồi ON317 – LLO – E247M_F ON318 – LLO – E247M_R ON319 – LLO – D320K_F ON320 – LLO – D320K_R ON387 – F ON388 – R HlyA – R02 – AatII Trang 22 Trình tự nucleotide 5’ – GGGAAAATGCAAGAAATGGTCATTAGTTTTAAACAAATTT ACTAT – 3’ 5’ – GTTTAAAACTAATGACCATTTCTTGCATTTTCCCTTCACTG ATTGCGCC – 3’ 5’ – CATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTAAAGCTGCCGTAA GCGG – 3’ 5’ – CCGCTTACGGCAGCTTTAAAAGCAGCTTTTACTTTAGTAC TATG – 3’ 5’ – AAAGGAGGAAGGATCCATGAGTCAAGAAGAACATAACCA TGA – 3’ 5’ – ATGCATCCATGGATCCCTGGAAGTACAGGTTCTCACCGC – 3’ 5’ – GGCCATGACGTCTTCGATTGGATTATCTACTTTATTACTA TA – 3’ TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T4 - 2016 Hình Sơ đồ vị trí bắt cặp mồi Hóa chất số vật liệu sinh học khác Enzyme Pfu DNA polymerase enzyme cắt giới hạn bao gồm BamHI, AatII cung cấp công ty Thermo Scientific, enzyme Taq DNA polymerase cung cấp công ty HT Biotech Các kit hóa chất sử dụng nghiên cứu sinh học phân tử nuôi cấy vi sinh cung cấp công ty Qiagen, GE Healthcare, Thermo Scientific, Sigma-Aldrich, Merck-Millipore BioBasic Máu cừu cung cấp công ty Nam Khoa Biotek dạng tuýp 10 mL giữ lạnh oC đến sử dụng Tạo plasmid pHT363 Plasmid pHT362 mang gen mhlyA đột biến tạo cách gây đột biến điểm định hướng plasmid pHT322 mang gen hlyA hoang dại từ L monocytogenes phản ứng PCR với cặp mồi ON317 ON318 chứa vị trí đột biến điểm E247M Plasmid gốc sau loại bỏ enzyme DpnI Sản phẩm sau xử lý biến nạp vào tế bào E coli OmniMAX sàng lọc đĩa kháng sinh chứa ampicillin 100 µg/mL giải trình tự vùng gene đột biến Tương tự plasmid pHT362, plasmid pHT363 mang gen mhlyA chứa hai đột biến điểm E247M D320K, tạo phản ứng PCR với cặp mồi ON319 ON320 khuôn plasmid pHT362 Tạo plasmid pHT387 Plasmid pHT387 tạo dòng từ plasmid pHT363 chèn thêm đoạn trình tự mã hóa đuôi tinh chế LysSRN-6xHis-TEV site giúp protein mục tiêu biểu tốt B subtilis dễ dàng tinh sắc ký lực với ion Ni2+ Đoạn trình tự gene LysSRN-6xHis-TEVsite thu nhận phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu ON387/ON388 khuôn pHT364 Sản phẩm PCR plasmid pHT363 xử lý với enzyme cắt BamHI nối lại với T4 DNA ligase Hỗn hợp sản phẩm nối biến nạp vào tế bào E coli OmniMAX, sàng lọc kháng sinh ampicillin 100 µg /mL, PCR khuẩn lạc với cặp mồi ON387 HlyA_R02_AatII (Hình 1) giải trình tự kiểm tra đoạn DNA chèn mồi ON653 Các plasmid tạo dịng thành cơng mang gen mhlyA đột biến dung hợp với trình tự tinh chế LysSRN6xHis-TEVsite đặt tên pHT387 Sơ đồ tóm tắt bước tạo vector pHT387 thể Hình Trang 23 Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 Hình Sơ đồ tạo vector pHT387 Khảo sát biểu lên men thu nhận sinh khối chủng B subtilis 1012 mang vector pHT387 Plasmid pHT387 sau dịng hóa thành cơng biến nạp vào chủng B subtilis 1012 phương pháp biến nạp tự nhiên Các khuẩn lạc mọc môi trường LB – agar chứa chloramphenicol 10 µg/mL chọn để kiểm tra mức độ biểu nồng độ IPTG cảm ứng từ đến mM phương pháp SDSPAGE Sau đó, protein biểu ni cấy nhiệt độ 27 oC, 32 oC 37 oC kiểm tra tính tan Sinh khối tế bào vi khuẩn phá sóng siêu âm Ly tâm nhẹ 2000 g phút để loại bỏ tế bào chưa vỡ Dịch protein tổng sau tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút phút để phân tách phân đoạn tủa tan Kiểm tra lượng protein phân đoạn phương pháp SDS-PAGE Tiến hành ni cấy lít dịch vi khuẩn B subtilis 1012 mang vector pHT387 hệ thống lên men L Các thơng số q trình lên men kiểm sốt tốc độ khuấy 400 vịng/phút, tốc độ sục khí lít/phút, pH 7,0 Trang 24 nhiệt độ nuôi cấy nồng độ chất cảm ứng tối ưu từ khảo sát Thời điểm cảm ứng biểu protein mục tiêu vào đầu pha log, giá trị OD600nm dịch nuôi cấy khoảng 2,0 Tiếp tục theo dõi đường cong tăng trưởng q trình ni cấy kết thúc mẻ lên men vào đầu pha cân Tinh chế protein LLOE247M/D320K Huyền phù sinh khối với 3V (so với trọng lượng sinh khối) dung dịch đệm ly giải chứa 30 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 10 % glycerol, 10 mM immidazole, mg/mL lysozyme, mg/mL DNaseI mM PMSF Phá tế bào sóng siêu âm bể đá, biên độ sóng (Amplitude) 70 30 chu kì, chu kì gồm 10 giây phá 30 giây nghỉ Ly tâm 13000 g 20 phút oC, thu nhận phần dịch cho chảy qua cột Histrap HP mL (GE Healthcare) Rửa cột đệm ly giải với thể tích gấp 10 lần thể tích cột dung ly protein mục tiêu dung dịch chứa 30 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 10 % glycerol 40 - 250 mM immidazole TAÏP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T4 - 2016 Protein dung hợp LysSRN-6xHis-TEVsiteLLOE247M/D320K sau dung ly khỏi cột Histrap cắt loại bỏ đuôi dung hợp TEV protease (tỷ lệ LysSRN-6xHis-TEVsiteLLOE247M/D320K: TEV protease 30 : wt/wt) nhiệt độ phòng dung dịch cắt 50 mM PIPES pH 6,0, 300 mM NaCl, 15 % glycerol, 0,5 mM EDTA, mM DTT Protein LLOE247M/D320K thu nhận từ phân đoạn chảy qua cột Histrap HP mL Kiểm tra protein sau tinh chế phương pháp SDS-PAGE Dịch protein tinh bổ sung với 10 mM EDTA, mM cystein bảo quản -80 oC đến sử dụng Dạng LLO hoang dại (LLOWT) mã hóa gene hlyA plasmid pHT358 biểu B subtilis tinh theo quy trình cơng bố nghiên cứu khác nhóm Xác định khối lượng phân tử LC-MS Protein LLOE247M/D320K sau tinh pha loãng nồng độ mg/mL gửi phân tích LC-MS Phịng Thí nghiệm Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Kết xử lý phần mềm Bruker Compass Data Analysis 4.0 Khảo sát hoạt tính tán huyết protein LLO tinh Phương pháp phân tích hoạt tính tán huyết thực theo quy trình Giammarini cộng [4] có cải biên Dịch máu cừu rửa ba lần với PBS, pH 7,4 để loại bỏ huyết ly tâm 1.700 g phút oC để thu nhận tế bào hồng cầu Pha loãng tế bào hồng cầu PBS nồng độ cho 0,5 mL dịch tế bào hồng cầu ly giải hoàn toàn với mL Triton X100 0,1 % cho phổ hấp thụ A541nm đạt giá trị 2,0 Dịch tế bào hồng cầu cừu bảo quản oC không ba ngày trước sử dụng Hoạt tính tán huyết độc tố thể đơn vị tán huyết (HU) mg protein độc tố Một đơn vị hoạt tính tán huyết (1 HU) lượng độc tố thấp (hay độ pha lỗng cao nhất) gây giải phóng nửa hemoglobin (50 % ly giải) từ dung dịch hòa tan tế bào hồng cầu Độ hấp thụ tối ưu hemoglobin xác định bước sóng A541 nm Các mẫu ly giải sử dụng làm đối chứng chuẩn bị phản ứng 0,5 mL dịch pha loãng hồng cầu với mL dung dịch Triton X-100 0,1 % (đối chứng dương) mL dung dịch PBS pH tương ứng dùng để pha loãng độc tố có bổ sung 0,1 % BSA mM DTT (đối chứng âm) Protein LLOE247M/D320K (được xem độc tố tế bào hồng cầu) nồng độ mg/mL pha loãng bậc 10 PBS bổ sung với 0,1 % BSA mM DTT đến nồng độ ng/mL (106) Ủ mL dịch pha loãng độc tố với 0,5 mL dịch hồng cầu cừu 45 phút 37 oC Ly tâm 1700 g phút oC đo phổ hấp thụ A541nm dịch thu Các thử nghiệm lặp lại ba lần Kết thể đồ thị phần trăm tán huyết dựa giá trị đo A541nm Hoạt tính tán huyết hai dạng protein LLOWT LLOE247M/D320K giá trị pH khác Sử dụng mL dịch pha loãng độc tố chứa HU độc tố PBS có pH từ 5,0 đến 8,5 cho thí nghiệm khảo sát hoạt tính tán huyết dạng protein với pH Quy trình tiến hành tương tự mô tả Các thử nghiệm lặp lại ba lần giá trị sai số thể sai số đồ thị KẾT QUẢ - THẢO LUẬN Kết dịng hóa vector pHT387 Sau gây đột biến điểm định hướng plasmid pHT322 pHT362 để tạo thành plasmid pHT363 có chứa gen mã hóa cho protein LLO thay amino acid glutamate (E) vị trí 247 thành methionine (M) aspatate (D) vị trí 320 thành lysine (K) (Hình 3) Đoạn gen mã hóa đuôi dung hợp LysSRN-6xHis-TEVsite Trang 25 Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 chèn vào plasmid pHT363 tạo thành pHT387 Plasmid biến nạp vào chủng E coli OmniMAX sàng lọc đĩa môi trường chứa kháng sinh ampicillin tiếp tục sàng lọc PCR khuẩn lạc với cặp mồi ON387 HlyA_R02_AatII Chọn khuẩn lạc cho phản ứng PCR khuẩn lạc dương tính (kích thước sản phẩm 2059 bp gel agarose 1,5 %) ni cấy để tách chiết plasmid giải trình tự Kết giải trình tự cho thấy tương đồng 100 % với trình tự lý thuyết vector pHT387 (kết khơng trình bày) Như vậy, vector pHT387 mang gen mhlyA có hai vị trí đột biến điểm dung hợp với gen LysSRN-6xHis-TEVsite dịng hóa thành cơng Hình Vị trí đột biến điểm thay protein LLOE247M/D320K Kết biểu protein LLOE247M/D320K dạng dung hợp với LysSRN-6xHis-TEVsite B subtilis Hình Kết điện di SDS-PAGE khảo sát điều kiện cảm ứng biểu protein mục tiêu theo (A) Nồng độ IPTG cảm ứng khảo sát (B) Nhiệt độ nuôi cấy biểu M: thang protein, (-): Đối chứng âm, chủng B subtilis mang plasmid pHT01 không mang gen mục tiêu Kết kiểm tra mức độ biểu protein dung hợp chủng B subtilis mang plasmid pHT387 thời điểm sau cảm ứng cho thấy, tăng nồng độ chất cảm ứng từ đến mM, lượng protein mục tiêu biểu tăng dần Tuy nhiên, so sánh mức độ biểu nồng độ 0,5 mM không thấy có thay đổi đáng kể (Hình 4A) Như nồng độ IPTG 0,5 mM thích hợp cho việc cảm ứng biểu protein mục tiêu Tính tan đặc tính quan trọng tạo thuận lợi cho bước tinh chế protein Trong nhiệt độ nuôi cấy thông số quan trọng ảnh hưởng đến tính tan protein mục Trang 26 tiêu Kết điện di phân tích phân đoạn tổng – tủa – tan mẫu sinh khối nuôi cấy 27 oC, 32 oC 37 oC gel SDS-PAGE cho thấy 37 oC hầu hết vạch protein mục tiêu (76 kDa) nằm pha tủa Ngược lại, nhiệt độ 27 o C 32 oC hầu hết protein nằm pha tan (có thể tốc độ tăng trưởng nhanh biểu mạnh 37 oC làm hạn chế trình gấp cuộn protein mục tiêu Bên cạnh đó, kết theo dõi đường cong tăng trưởng chủng vi khuẩn tái tổ hợp cho thấy nuôi cấy nhiệt độ 27 oC, pha tăng trưởng kéo dài OD600 dịch nuôi cấy đầu pha cân cao hơn, thu nhiều sinh khối so với ni cấy TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T4 - 2016 32 oC (dữ liệu khơng trình bày) Như vậy, nhiệt độ 27 oC thích hợp cho nuôi cấy cảm ứng biểu để thu lượng protein mục tiêu nhiều có tính tan tốt Kết nuôi cấy biểu quy mô lớn bồn lên men kiểm tra gel SDS-PAGE 12 % cho thấy, mức độ biểu protein mục tiêu theo thời gian từ thời điểm sau cảm ứng đến kết thúc trình lên men (lúc giờ) khơng có thay đổi đáng kể (Hình 5A) Như vậy, trình lên men nuôi cấy kết thúc đầu pha cân (7 giờ) thích hợp, với lượng sinh khối thu cao lượng protein LLOE247M/D320K biểu đơn vị sinh khối không bị ảnh hưởng Để xác nhận lại mức độ tan protein mục tiêu nuôi cấy lên men so với nuôi cấy khảo sát quy mơ nhỏ trước đó, mẫu sinh khối thời điểm kết thúc mẻ lên men thu nhận làm kiểm tra tổng – tủa – tan Kết SDS-PAGE cho kết tương tự khảo sát, phần lớn protein LLOE247M/D320K tái tổ hợp dạng tan (Hình 5B) Hình Kết điện di SDS-PAGE khả biểu protein trình ni cấy lên men; (A) Kết khảo sát biểu theo thời gian (B) Kết tổng – tủa – tan M: thang protein, (-): Đối chứng âm, chủng B subtilis mang plasmid pHT01 không mang gen mục tiêu Kết tinh chế protein LLOE247M/D320K Với thiết kế mang trình tự dung hợp LysSRN-6xHis-TEVsite, 6xHis có lực cao với ion Ni2+ cột Histrap HP cho phép dễ dàng thu nhận protein LLOE247M/D320K dung hợp loại bỏ đáng kể protein tạp tế bào nhờ bước qua cột sắc ký Kết điện di mẫu protein trước qua cột sau qua cột cho thấy phần lớn lượng protein dung hợp gắn giữ lại cột, hầu hết protein B subtilis khơng có khả bắt lên cột nên bị loại bỏ phân đoạn sau cột Kết dung ly với nồng độ imidazole tăng dần từ 40 đến 120 mM (Hình 6A, phân đoạn đến 7) cho thấy gần toàn protein LLOE247M/D320K dung hợp bám cột thu nhận, từ phân đoạn 160 mM imidazole (8 – 10) trở cịn lại protein mục tiêu cột (Hình 6A) Như vậy, protein LysSRN-6xHis-TEVsite-LLOE247M/D320K tinh chế thành cơng Tuy nhiên cịn lượng đáng kể protein tạp lẫn với protein mục tiêu phân đoạn dung ly (1 – 5) Protein tái tổ hợp sau tinh chế cắt loại bỏ đuôi dung hợp khỏi protein mục tiêu ví trí nhận biết enzyme TEV protease (ENLYFQ) So sánh kết điện di phân đoạn trước cắt sau cắt nhận thấy vạch protein dung hợp ~ 76,5 kDa cắt hoàn toàn thành hai vạch protein có kích thước 57,5 kDa 19 kDa Sau cắt khơng cịn mang poly-histidine nên chảy lại qua cột Trang 27 Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 Histrap lần thứ hai không giữ lại cột thu nhận thành phân đoạn sau qua cột (Hình 6B, F1 – F25) Ngược lại, tất thành phần lại hỗn hợp sau cắt gồm đuôi dung hợp, TEV protease protein tạp có khả bám với Ni2+ nên giữ lại cột Các phân đoạn kiểm tra phương pháp SDS-PAGE, cho thấy phân đoạn sau qua cột F1 đến F25 cịn vạch protein có kích thước 57,5 kDa với dự đốn Phân đoạn dung ly sau cho thấy đuôi dung hợp, TEV protease protein tạp bám lại cột (Hình 6B) Kết từ lít dịch ni cấy thu 50 mg protein LLOE247M/D320K tinh Hình Kết SDS-PAGE phân tích trình tinh chế protein LLOE247M/D320K (A): Tinh chế protein dung hợp LysSRN-6xHis-TEVsite-LLO; (B): Cắt loại bỏ đuôi dung hợp thu nhận LLOE247M/D320K tinh Kết phân tích khối lượng phân tử LC-MS Dung dịch protein tinh pha loãng nồng độ mg/mL trước phân tích phổ LCMS Kết cho thấy cấu tử protein có khối lượng phân tử 57, 494, 5710 Da (Hình 7) so với khối lượng 57, 492, 47 Da protein LLOE247M/D320K tính tốn lý thuyết dựa trình tự cơng cụ phân tích PeptideMass (http://web.expasy.org/peptide_mass/) Tương tự, kết phân tích phổ LC-MS LLO dạng hoang dại cho kết cấu protein có khối lượng 57,479,4874 Da (so với 57,477,31 Da theo lý thuyết) (đã cơng bố trước nhóm nghiên cứu) Kết cho thấy với độ sai số khối lượng không Da, protein tinh Trang 28 thu nhận dung dịch sau tinh chế xác protein LLOE247M/D320K mục tiêu Đồng thời kết chứng minh cắt loại bỏ thành công đuôi dung hợp khỏi protein mục tiêu Bên cạnh đó, với thay hai amino acid (Glu  Met Aps  Lys) theo lý thuyết tạo protein LLO đột biến có khối lượng phân tử tăng thêm khoảng 15 Da so với dạng hoang dại Và kết so sánh khối lượng thực tế hai dạng protein theo phân tích LC-MS cho thấy hoàn toàn phù hợp với lý thuyết Như kết luận biểu tinh chế thành công protein mục tiêu với độ tinh cao hai bước qua cột Histrap TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T4 - 2016 Hình Kết phân tích phổ LC-MS dạng LLOE247M/D320K Hoạt tính tán huyết hai dạng protein LLOwt LLOE247M/D320K Kết HU protein LLOwt LLOE247M/D320K tương đương với lượng độc tố 3,75 ng 12 ng Như vậy, theo quy trình đo hoạt tính nghiên cứu, hoạt tính riêng hai dạng protein 2,67 x 105 8,3 x 104 HU/mg protein Với kết thấy protein đột biến có hoạt tính riêng thấp khoảng lần so với LLO dạng hoang dại Hoạt tính tán huyết giá trị pH khác Một lượng HU hai dạng protein (3 HU) pha loãng mL PBS có pH từ 5,0 đến 8,5 Kết kiểm tra hoạt tính tán huyết theo pH cho thấy protein LLOWT cho hoạt tính tối ưu khoảng 5,5 protein bị hồn tồn hoạt tính pH cao 7,0 (Hình 8) Điều hồn tồn phù hợp với đặc tính protein LLO dạng hoang dại công bố nhiều nghiên cứu trước Ngược lại, hoạt tính dạng LLO mang hai đột biến điểm E247M D320K giữ 90 % hoạt tính pH kiềm Kết cho thấy protein LLO mang hai đột biến có hoạt tính bền hẳn so với dạng LLO hoang dại pH trung tính đến kiềm nhẹ mong đợi Hình Hoạt tính tán huyết giá trị pH khác Trang 29 Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 KẾT LUẬN Đã tạo chủng B subtilis có khả biểu LLOE247M/D320K hiệu Từ 30 g sinh khối vi khuẩn thu nhận 50 mg protein LLOE247M/D320K có độ tinh cao qua hai bước tinh chế qua cột Histrap Hoạt tính LLOE247M/D320K pH 7,0 tốt hẳn LLO dạng tự nhiên Tính chất tạo nhiều thuận lợi cho việc ứng dụng protein này, đơn giản hóa thao tác thu nhận, tinh chế, bảo quản vốn sử dụng thường xuyên môi trường pH trung tính Bên cạnh đó, hệ thống B subtilis hồn tồn biểu tốt protein LLO dạng đột biến mở thêm lựa chọn cho nghiên cứu ứng dụng liên quan Lời cảm ơn: Nghiên cứu hỗ trợ phần kinh phí Sở Khoa học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh Huỳnh Thị Kim Phương hỗ trợ Đại Học Quốc gia Tp HCM từ kinh phí nhiệm vụ thường xuyên Expression and purification of listeriolysin O from Listeria monocytogenes harbouring E247M and D320K mutations in Bacillus subtilis        Ngo Khac Huy Nguyen Le Tuan Anh Huynh Thi Kim Phuong Nguyen Van Phuc Tran Linh Thuoc Nguyen Duc Hoang Phan Thi Phuong Trang University of Science, VNU-HCM ABSTRACT Listeriolysin O (LLO) is an important extracellular toxin of Listeria monocytogenes which degrades the phospholipid membranes of the host cells’ phagosomes at low pH during the intracellular survival In contrast to the natural form, the mutant LLO carrying two replacements of amino acid E247M and D320K possesses stable activity at pH 7.4 In this study, we have constructed vectors that carry the mhlyA gene encoding double-mutated LLOE247M/D320K express in B subtilis 1012 The target gene was fused to the sequence of LysRN-6xHis-TEV site to enhance the recombinant protein expression in B subtilis and to ease the acquisition of protein by Ni2+-based affinity chromatography As results, we have obtained the purified protein LLOE247M/D320K with high purity The activity measurement with HU hemolytic toxins in the pH range from 5.0 to 8.5 suggested that the activity of LLOE247M/D320K was much better than that of natural LLO at neutral pH and slightly alkaline These results not only provided important scientific foundations for mutant LLO bases expression in B subtilis but also supplied purified materials for researche and medical applications based on this protein Key words: Listeriolysin O, Listeria monocytogenes, E247M, D320K, Bacillus subtilis, pHT vector system Trang 30 TAÏP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T4 - 2016 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] A Bavdek, R Kostanjšek, V Antonini, J.H Lakey, M Dalla Serra, R.J.C Gilbert, G Anderluh, pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability, The FEBS Journal, 279, 1, 126–141 (2012) [2] J Bielecki, P Youngman, P Connelly, D.A Portnoy, Bacillus subtilis expressing a haemolysin gene from Listeria monocytogenes can grow in mammalian cells, Nature, 345, 6271, 175–176 (1990) [3] C Geoffroy, J.L Gaillard, J.E Alouf, P Berche, Purification, characterization, and toxicity of the sulfhydryl-activated hemolysin listeriolysin O from Listeria monocytogenes, Infection and Immunity, 55(7), 1641–1646 (1987) [4] C Giammarini, F Andreoni, G Amagliani, A Casiere, S Barocci, M Magnani, Highlevel expression of the Listeria monocytogenes listeriolysin O in Escherichia coli and preliminary characterization of the purified protein, Protein Expression and Purification, 28, 1, 78–85 (2003) [5] S Kayal, A Charbit, Listeriolysin O: a key protein of Listeria monocytogenes with multiple functions, FEMS Microbiology Reviews, 30, 4, 514–529 (2006) [6] K.D Lee, Y.K Oh, D.A Portnoy, J.A Swanson, Delivery of macromolecules into cytosol using liposomes containing hemolysin from Listeria monocytogenes, The Journal of Biological Chemistry, 271, 13, 7249–7252 (1996) [7] M Mandal, K.D Lee, Listeriolysin Oliposome-mediated cytosolic delivery of macromolecule antigen in vivo: enhancement of antigen-specific cytotoxic T lymphocyte frequency, activity, and tumor protection, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes, 1563, 1–2, 7–17 (2002) [8] E Mathew, G.E Hardee, C.F Bennett, K.D Lee, Cytosolic delivery of antisense oligonucleotides by listeriolysin O-containing liposomes, Gene Therapy, 10(13), 1105–1115 (2003) [9] T.T.P Phan, H.D Nguyen, W Schumann, Novel plasmid-based expression vectors for intra - and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis, Protein Expression and Purification, 46, 2, 189–195 (2006) [10] D.A Portnoy, P.S Jacks, D.J Hinrichs, Role of hemolysin for the intracellular growth of Listeria monocytogenes, The Journal of Experimental Medicine, 167, 4, 1459–1471 (1988) [11] C.J Provoda, K.D Lee, Bacterial poreforming hemolysins and their use in the cytosolic delivery of macromolecules, Advanced Drug Delivery Reviews, 41, 2, 209– 221 (2000) [12] H Saito, T Shibata, T Ando, Mapping of genes determining nonpermissiveness and host-specific restriction to bacteriophages in Bacillus subtilis Marburg, Molecular & General Genetics: MGG, 170(2), 117–122 (1979) [13] P Schnupf, D.A Portnoy, Listeriolysin O: a phagosome-specific lysin, Microbes and Infection, 9, 10, 1176–1187 (2007) [14] D.W Schuerch, E.M Wilson-Kubalek, R.K Tweten, Molecular basis of listeriolysin O pH dependence, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102, 35, 12537–12542 (2005) [15] S Seveau, Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes, Subcellular Biochemistry, 80, 161–195 (2014) Trang 31 ... (2006) [6] K.D Lee, Y.K Oh, D.A Portnoy, J.A Swanson, Delivery of macromolecules into cytosol using liposomes containing hemolysin from Listeria monocytogenes, The Journal of Biological Chemistry,... HCM từ kinh phí nhiệm vụ thường xuyên Expression and purification of listeriolysin O from Listeria monocytogenes harbouring E247M and D320K mutations in Bacillus subtilis        Ngo Khac... purified protein, Protein Expression and Purification, 28, 1, 78–85 (2003) [5] S Kayal, A Charbit, Listeriolysin O: a key protein of Listeria monocytogenes with multiple functions, FEMS Microbiology