Cloning and investigating gfp (green fluorescent protein) allowing higher expression in bacillus subtilis

Untitled Science & Technology Development, Vol 18, No T3 2015 Trang 46 Tạo dòng và khảo sát biểu hiện phiên bản GFP (Green Fluorescent Protein) cho khả năng biểu hiện tốt trong Bacillus subtilis  Ngu[.]

Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 Tạo dòng khảo sát biểu phiên GFP (Green Fluorescent Protein) cho khả biểu tốt Bacillus subtilis     Nguyễn Hoài Nam Phan Thị Phượng Trang Trần Linh Thước Nguyễn Đức Hoàng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM ( Bài nhận ngày 12 tháng 12 năm 2014, nhận đăng ngày 12 tháng 08 năm 2015) TÓM TẮT cho chủng chủ khác gặp nhiều khó khăn Gen gfp mã hóa cho protein GFP (Green tần suất sử dụng codon khả gấp Fluorescent Protein) có nguồn gốc từ sứa cuộn sau dịch mã chủng chủ Trong Aequorea victoria protein thị sử nghiên cứu này, với mục tiêu phát triển dụng phổ biến, (i) biểu phiên GFP phù hợp cho Bacillus subtilis, nhận biết dễ dàng thông qua khả phát tiến hành tạo đột biến điểm huỳnh quang, (ii) không cần chất hay gen gfp+ nhằm loại bỏ vị trí enzyme cofactor, (iii) ảnh hưởng đến protein mục cắt thơng dụng BamHI, XhoI giúp thuận lợi tiêu dung hợp Nhiều biến thể GFP cho việc dịng hóa; đồng thời thay đổi nghiên cứu cải tiến, đó, codon Y39N, N105T, I171V cho tương superfolder GFP với đặc tính có lợi thích với B subtilis Kết cho thấy phiên gấp cuộn nhanh, cấu trúc ổn định phát GFP sau đột biến cho khả phát huỳnh quang mạnh cho thấy khả ứng huỳnh quang tốt vị trí enzyme cắt dụng lớn protein Tuy nhiên, giới hạn nêu loại bỏ superfolder GFP phát triển Escherichia coli, việc ứng dụng phiên Từ khóa: Bacillus subtilis, pHT, GFP, superfolder GFP MỞ ĐẦU Cùng với phát triển cơng nghệ sinh học, việc tìm gen thị hiệu chiến lược hàng đầu Gen thị mã hóa cho protein mà biểu dễ dàng kiểm tra thơng qua kiểu hình đặc trưng (i) khả phát huỳnh quang không cần cofactor hay chất, (ii) ảnh hưởng đến hoạt tính protein mục tiêu, (iii) không gây độc hầu hết trường hợp, (iv) nhận biết mà khơng cần phá vỡ tế bào Ngồi ra, GFP cịn có đặc tính Một gen thị sử dụng phổ biến gfp có nguồn gốc từ sứa Aequorea victoria mã hóa cho protein GFP (Green Fluorescent Protein) [5] có nhiều ưu điểm bền với nhiệt, bền với chất tẩy rửa, pH kiềm nồng độ muối cao nên ứng dụng rộng rãi mà không cần quan tâm nhiều đến điều kiện hoạt động [12] Tuy nhiên, GFP tự nhiên cịn Trang 46 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SOÁ T3- 2015 nhiều nhược điểm gấp cuộn chậm mức độ phát huỳnh quang chưa đủ mạnh nên đơi khó phát [1] Do đó, nhiều biến thể GFP nghiên cứu cải tiến cho thấy khả ứng dụng lớn protein lĩnh vực nghiên cứu di chuyển, chức tương tác protein mục tiêu tế bào, dung hợp với cấu trúc khác nghiên cứu gen hệ thống biểu [9, 10] Trong đó, superfolder GFP với đặc tính có lợi gấp cuộn nhanh, cấu trúc ổn định phát huỳnh quang mạnh đối tượng hấp dẫn [6] Hạn chế lớn superfolder GFP phát triển Escherichia coli, việc ứng dụng phiên cho chủng chủ khác gặp nhiều khó khăn Mức độ phát huỳnh quang khơng chịu ảnh hưởng lượng protein, khả gấp cuộn mà phụ thuộc vào tốc độ chép, ổn định mRNA, tín hiệu dịch mã khả sử dụng codon tế bào chủ [3] Như vậy, để có hiệu sử dụng protein thị tối ưu, việc lựa chọn biến thể GFP phù hợp cho loài chủng chủ thực quan trọng cần thiết [2] Bacillus chủng vi khuẩn sử dụng phổ biến công nghệ vi sinh vật từ lâu Hơn 60 % sản lượng enzyme công nghiệp sản xuất từ chủng Với đặc tính an tồn thực phẩm, khả tiết protein vào môi trường, tăng trưởng với tốc độ cao, việc nghiên cứu ứng dụng chủng Bacillus ngày đẩy mạnh, tiêu biểu số B subtilis [4] Tuy nhiên, GFP biến thể thường sử dụng làm thị sinh học lại biểu chủng vi sinh vật Một số nghiên cứu cho thấy, gen gfp+mã hóa cho phiên GFP có khả biểu cao B subtilis nhờ codon tối ưu [11] Trong nghiên cứu này, với mục tiêu phát triển phiên GFP mang đột biến phù hợp cho B subtilis, tiến hành tạo đột biến điểm gen gfp+ nhằm loại bỏ vị trí enzyme cắt thơng dụng BamHI, XhoI giúp thuận lợi cho việc dịng hóa; đồng thời thay đổi codon Y39N, N105T, I171V cho tương thích với B subtilis GFP sau đột biến phiên trung gian định hướng phát triển phiên superfolder GFP cho B subtilis Hiệu biểu GFP sau đột biến đánh giá dựa vào kết phân tích SDS-PAGE khả phát huỳnh quang môi trường rắn lỏng B subtilis VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng vi sinh vật, plasmid môi trường nuôi cấy E coli OmniMAX (Invitrogen) sử dụng bước dịng hóa, B subtilis 1012 dùng để đánh giá khả biểu phát huỳnh quang GFP sau đột biến Plasmid pHT10-gfp+ sử dụng làm plasmid gốc để tạo đột biến gen gfp+ Thí nghiệm thực với đối chứng pHT01 [7] chứng âm không mang gen Tế bào B subtilis nuôi cấy lắc môi trường Luria broth (LB) 37 oC, với kháng sinh chloramphenicol 10 µg/mL Thiết kế plasmid Để thuận lợi cho trình tạo phiên gfp+ mang đột biến mong muốn, tiến hành theo bước Bước thứ nhất, tạo plasmid pHT10-gfp+ΔBamHI cách loại bỏ vị trí BamHI plasmid pHT10-gfp+, sử dụng phương pháp đột biến điểm định hướng (Quik Change Site-directed Mutagenesis, Qiagen, Agilent) với cặp mồi ON411 (CCACAACAT TGAAGATGGTTCCGTTCAACTAGCAGAC) ON412 (GTCTGCTAGTTGAACGGAACC ATCTTCAATGTTGTGG) Bước thứ hai, tạo plasmid pHT1241 mang đột biến loại bỏ vị Trang 47 Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 trí cắt giới hạn XhoI thay đổi codon Y39N, N105T, I171V từ plasmid pHT10-gfp+ΔBamHI phương pháp đột biến đa điểm định hướng (Quik Change Site-directed Mutagenesis, Qiagen, Agilent) với mồi ON867B (GTGAAGGTGATGCTACAAACGG AAAGCTACCCTTAAA), ON867E (AAGAT GACGGGACATACAAGACGCGTGCTGAAG TCAAG), ON867F (TGGAAACATTC TCGGACACAAACTCGAATACAACTTTAAC TCACACAA), ON867G (CTAACTTCAA AATTCGCCACAACGTTGAAGATGGTTCC) Quá trình sàng lọc thực E coli pHT1241 môi trường LB với kháng sinh chloramphenicol (10 µg/ml) nhiệt độ 27 oC, 32 o C, 37 oC tốc độ lắc 250 vòng/phút Cảm ứng IPTG thời điểm OD600 đạt 0,8 – với nồng độ mM; 0,01 mM; 0,05 mM; 0,1 mM; 0,5 mM mM Thu mẫu 0, 2, sau cảm ứng cho OD600 đạt 1,2 Sau ly tâm 9000 vịng/phút phút để thu sinh khối giữ mẫu -20 oC Tiến hành tương tự thu mẫu thời điểm sau cảm ứng với pHT01 Thí nghiệm lặp lại lần khuẩn lạc khác Mẫu sau thu dùng để điện di SDS-PAGE khảo sát hoạt tính GFP đĩa 384 OmniMAX với mồi ON314 (TGTTTCA ACCATTTGTTCCAGGT), plasmid biến nạp vào B subtilis 1012 giếng Khảo sát khả phát huỳnh quang GFP môi trường rắn Các khuẩn lạc đơn B subtilis chứa plasmid pHT10-gfp+, pHT10-gfp+ΔBamHI, pHT1241 khảo sát khả biểu GFP nhằm đánh giá hiệu đột biến Thí nghiệm tiến hành đĩa LB-Agar-Cm với nồng độ IPTG (0 mM; 0,01 mM; 0,05 mM; 0,1 mM; 0,5 mM mM) Ủ 37 oC, 32 oC 27 oC với thời gian tương ứng 16 giờ, 24 36 Sự phát huỳnh quang khuẩn lạc kích thích bước sóng UV phản ánh mức độ biểu GFP, qua đánh giá hiệu phiên GFP sau đột biến Hình ảnh ghi nhận máy chụp hình kỹ thuật số phân tích phần mềm AlphaEaseFC (Alpha Inotech) để tính tốn gray value (hay pixel value) Thực tương tự với chứng âm pHT01 Thí nghiệm lặp lại lần, lần khuẩn lạc khác Cảm ứng biểu GFP Tiến hành nuôi cấy B subtilis 1012 chứa plasmid pHT10-gfp+, pHT10-gfp+ΔBamHI, Trang 48 Kiểm tra biểu SDS PAGE Hòa tan sinh khối 100 μl lysis buffer, μl lysozyme 50 mg/mL, ủ 37 oC phút, sau thêm 30 μL loading buffer 5X (0,135 M Tris/HCl; 30 % glycerol; % SDS; 0,03 % bromophenol blue; 0,15 M DTT) Mẫu sau xử lý ủ 95 oC phút, ly tâm 10.000 vòng/phút phút thu dịch tiến hành điện di SDS-PAGE Đánh giá hiệu đột biến thông qua mức độ biểu GFP sau đột biến Khảo sát hoạt tính GFP đĩa 384 giếng Khả phát quang GFP liên quan tới cấu trúc Chromophore, tạo thành acid amine Serine65-Tyrosine66-Glycine67 trung tâm hoạt động chuỗi polypeptide Q trình đóng vịng chuỗi phản ứng khử hydro oxy hoá, tạo phân tử Chromophore trưởng thành cho phép hấp thu ánh sáng tối đa bước sóng 475 nm phát huỳnh quang màu xanh lục có bước sóng 508 nm [5] Mẫu tế bào B subtilis 1012 mang plasmid cần khảo sát thu bước cảm ứng biểu phá TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SỐ T3- 2015 dung dịch PBS 1X (Phosphate Buffer Saline) nồng độ cuối lysozyme mg/mL, ủ lắc 30 phút Dịch sau ly tâm đo đĩa 384 giếng với máy đọc đĩa (BioTek-Thermo, Mỹ) Kết xử lý tính tốn phần mềm Excel (Microsoft) Thí nghiệm lặp lại lần khuẩn lạc khác KẾT QUẢ Tạo plasmid gfp+ tạo plasmid pHT10-gfp+ΔBamHI (Hình 1, Trái) mang đột biến loại bỏ vị trí BamHI gen gfp+ Plasmid pHT10-gfp+ΔbamHI sau giải trình tự khung sườn để tạo plasmid pHT1241 (Hình 1, Phải) mang đột biến ΔXhoI, Y39N, N105T, I171V đột biến đa điểm định hướng với mồi ON867B, ON867E, ON867F, ON867G Kết giải trình tự hồn tồn tương đồng với trình tự lý thuyết, plasmid pHT10gfp+ΔBamHI pHT1241 tạo dịng thành cơng có cấu trúc Hình Sử dụng cặp mồi ON411 ON412 thực đột biến điểm định hướng plasmid pHT10- Hình Sơ đồ plasmid pHT10-gfp+ΔBamHI (Trái) pHT1241 (Phải), với gen gfp+được gây đột biến vị trí trình tự nucleotide, tạo độ biến ΔBamHI pHT-gfp+ΔBamHI ΔXhoI, Y39N, N105T, I171V pHT1241 Khảo sát hoạt tính GFP môi trường rắn Các khuẩn lạc B subtilis 1012 mang plasmid pHT01 (-) mẫu pHT10-gfp+ Thực lơ thí pHT10-gfp+ΔBamHI, pHT1241 đĩa biến nạp chấm lên đĩa môi trường chứa LB-AgarCm bổ sung IPTG với nồng độ tương ứng (Hình 2A) Tiến hành đồng thời với mẫu chứng âm nghiệm tương ứng với nhiệt độ ủ khác 27 oC, 32 oC 37 oC để đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ lên mức độ biểu GFP Trang 49 Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 Hình Kết đĩa mơi trường chứa LB-Agar-Cm (A) cường độ sáng chương trình AlphaEase (B) với nồng độ IPTG 0; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 mM nhiệt độ 27 oC, 32 oC 37 oC Kết sơ đĩa thạch có độ chênh lệch nhỏ, khơng thể khác biệt Tuy nhiên, qua chúng tơi nhận thấy số kết đương; nhiên, 27 oC, pHT10-gfp+ΔBamHI cho kết biểu thấp Kết kiểm chứng thí nghiệm khảo sát ban đầu sau Các chủng mang plasmid cần khảo sát cho khả phát huỳnh quang tăng dần theo nồng độ IPTG từ 0,05 mM đạt cực đại mM, chứng âm pHT01 khơng có tượng Nhiệt độ có ảnh hưởng đến biểu GFP, chứng 32 oC, phát huỳnh quang khuẩn lạc mạnh Kết kiểm tra lại phần mềm đo cường độ sáng AlphaEase (Alpha Inotech), chủng B subtilis 1012/pHT1241 cho giá trị cường độ sáng môi trường lỏng cao nhất, hai plasmid cịn lại có mức độ tương Trang 50 Cảm ứng biểu GFP Quy trình khảo sát biểu môi trường lỏng mô tả phần Vật liệu phương pháp Nồng độ IPTG sử dụng khảo sát mM; 0,01 mM; 0,05 mM; 0,1 mM; 0,5 mM mM với thời gian thu mẫu giờ, Mẫu kiểm tra mức độ biểu GFP điện di SDS-PAGE gel 12 % nhuộm Coomassie Blue cho vạch màu xanh TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SỐ T3- 2015 Hình Kết điện di SDS-PAGE; Mẫu B subtilis 1012/pHT1241 32 oC với nồng độ IPTG thời điểm thu mẫu 0, 2, (A); Mẫu B subtilis 1012 với plasmid cần khảo sát lắc biểu với nồng độ IPTG mM (B) 37 oC, 32 oC 27 oC (B) Trước tiên, chọn thời gian nồng độ chất cảm ứng biểu tối ưu cách khảo sát plasmid pHT1241 32 oC (nhiệt độ cho kết phát huỳnh quang tốt khảo sát đĩa thạch) thu kết Hình 3A So (Hình 3B), lượng protein tạo gần tương đương plasmid Tuy nhiên, 27 oC, biểu pHT-gfp+ΔBamHI giảm rõ rệt so với plasmid cịn lại, kết hồn tồn phù hợp với kết khảo sát hoạt tính đĩa Có sánh độ đậm vạch protein mục tiêu thời điểm thu mẫu nồng độ IPTG tương ứng, nhận thấy mức độ biểu tốt ghi nhận thời điểm sau cảm ứng với mM IPTG (Hình 3A, Giếng 8) Như vậy, điều kiện chọn để so sánh lượng GFP tạo plasmid nhiệt độ 27 oC, 32 oC 37 oC kết thể Hình 3B khả việc loại bỏ vị trí BamHI gen gfp+ ảnh hưởng đến biểu gen B subtilis Để có đánh giá chuẩn xác hơn, tiếp tục thực khảo sát mức độ biểu GFP đĩa 384 giếng GFP có kích thước tương đương 27 kDa, phát huỳnh quang GFP cách xác Đo huỳnh quang đĩa 384 giếng có nhằm khảo sát yếu tố thực phương pháp khảo sát hoạt tính đĩa có thay đổi codon cấu trúc mà pHT1241 cho vạch protein cao so với hai plasmid lại So với 37 oC 27 oC, vạch GFP biểu 32 oC cho kết cao bật (Hình 3B, Giếng 6, 7, 8) Cả plasmid cần khảo sát cho vạch GFP rõ nhiệt độ vạch lại khơng có khác biệt nhiều Khảo sát hoạt tính phát huỳnh quang GFP đĩa 96 giếng Phương pháp đo huỳnh quang có ưu điểm cho kết có độ nhạy cao, thể khả SDS-PAGE Các plasmid biểu thời gian giờ, với nồng độ nồng độ IPTG Số liệu thể dạng biểu đồ cột Hình Trang 51 Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 Hình Kết khảo sát khả phát huỳnh quang pHT10-gfp+, pHT10- gfp+ΔBamHI, pHT1241 đĩa 384 giếng 37 oC (Trên), 32 oC (Giữa) 27 oC (Dưới) Boxplot of Flourescence 4000 Flourescence 3750 3500 3250 3000 pHT10gfp pHT10gfpd Plasmid pHT1241 Hình Kết phân tích ANOVA One-way đánh giá ảnh hưởng đột biến lên hoạt tính GFP Trang 52 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SỐ T3- 2015 Collector – gathering Hình Đột biến điểm nhằm loại bỏ vị trí BamHI từ plasmid pHT10-gfp+(Trái) tạo pHT10gfp+ΔBamHI(Phải) Collector – filtering Kết Hình 4, cho thấy lắc biểu 37 oC, hoạt tính GFP tạo từ chủng mang pHT1241 tốt pHT10-gfp+∆BamHI nhiên không thực chênh lệch nhiều (Hình 4, Trên) Trong đó, với mẫu biểu 32 o C (Hình 4, Giữa), biểu pHT1241 vượt trội hẳn (~4000 đơn vị), cao gấp 1,3 lần so với plasmid lại Kết kiểm tra phân tích thống kê thể Hình 5, sử dụng phương pháp ANOVA One-way (Minitab), giá trị p-value = 0,000 khoảng tin cậy 95 % (α = 0,05) Cho thấy mức độ chênh lệch khả phát huỳnh quang pHT1241 so với plasmid cịn lại có ý nghĩa mặt thống kê Ở 27 oC (Hình 4, Dưới), nhận thấy ảnh hưởng lớn việc loại bỏ BamHI lên biểu gfp+ pHT10-gfp+∆BamHI, khả phát huỳnh quang thấp (~1000 đơn vị), 1/3 so với trường hợp khác, vấn đề thảo luận phần sau So sánh nhiệt độ, thu kết tương tự khảo sát phương pháp thạch điện di SDS-PAGE so sánh Khả phát huỳnh quang GFP 32 oC cao nhất, 37 oC yếu cuối 27 C o THẢO LUẬN Việc loại bỏ vị trí BamHI trường hợp pHT10-gfp+∆BamHI giữ nguyên trình tự amino acid trình tự gen sau đột biến thay đổi So sánh trình tự trước sau đột biến (Hình 5), codon GGA (trình tự gen GGA) nằm vị trí nhận biết BamHI (Hình 5, Trái) thay codon khác GGU (trình tự gen GGT) mã hóa cho glycine (Hình 5, Phải) Tuy nhiên, xét tần suất sử dụng codon B subtilis codon trước đột biến - GGA (21,8 ‰) cho hiệu sử dụng cao so với codon sau đột biến - GGU (13,0 ‰) [8] Như việc loại bỏ trình tự BamHI làm thay đổi tần suất sử dụng codon gen mục tiêu B subtilis, dẫn đến việc giảm biểu pHT10gfp+∆BamHI ảnh hưởng rõ nuôi cấy nhiệt độ thấp, trường hợp 27 oC Trang 53 Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 Theo kết ghi nhận được, mức độ phát huỳnh quang GFP phụ thuộc vào yếu tố, lượng protein tạo khả gấp cuộn Khi so sánh nhiệt độ, lượng protein 32 o C tạo nhiều khả phát huỳnh quang cao Còn nhiệt độ, lượng protein tạo tương đương (kết từ phương pháp điện di SDS-PAGE) khả phát huỳnh quang protein tạo từ pHT1241 lại vượt trội hẳn so với plasmid ban đầu pHT1241 mang đột biến làm thay đổi acid amine, làm thay đổi cấu trúc khả gấp cuộn GFP, giúp GFP sau đột acid (Y39N, N105T, I171V) theo nội dung đề tài nhằm mục đích tăng khả gấp cuộn, khả phát sáng, độ bền protein, đồng thời loại bỏ trình tự enzyme cắt giới hạn phổ biến gen (BamHI, XhoI) để thuận lợi cho bước dịng hóa Phạm vi nội dung đề tài phần định hướng tạo superfolder GFP mang ưu điểm gấp cuộn nhanh, phát huỳnh quang mạnh phù hợp tần suất sử dụng codon, cho hoạt động tốt B subtilis Công việc cho kết tương đối khả quan, tạo vector mang gen thị biểu thành GFP có hoạt tính cao Đây bước trung gian quan trọng để tiếp tục thực biến có khả phát huỳnh quang mạnh bền so với protein ban đầu thêm nhiều đột biến gen gfp+, phát triển khả ứng dụng GFP B subtilis, giúp đưa ứng dụng GFP vào chủng chủ ngày dễ dàng, nhanh chóng tiết kiệm KẾT LUẬN Việc tạo biến đổi trình tự amino Cloning and investigating GFP (green fluorescent protein) allowing higher expression in Bacillus subtilis     Nguyen Hoai Nam Phan Thi Phuong Trang Tran Linh Thuoc Nguyen Duc Hoang University of Science, VNU-HCM ABSTRACT Gfp gene coding for protein GFP (green fluorescent protein) from the jellyfish Aequorea victoria is the most popular indicator protein, due to (i) easy to recognize the expression through the fluorescent ability, (ii) without substrate or cofactor, (iii) less impact on the fusion protein target form A lot of modifications of GFP have been studied and improved, in which GFP superfolder containing beneficial properties such as rapid Trang 54 folding, structural stability and strong fluorescence showed great applicability However, GFP superfolder has just been developed in Escherichia coli It is difficult to apply this version for all other strains since codon usage and the folding ability of each host species In this study, with the aim of generating a GFP gene which is suitable for Bacillus subtilis, we mutated in the gene gfp+ to delete general BamHI, XhoI restriction TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SOÁ T3- 2015 enzyme site for facilitating in cloning step; as new version of GFP stronger in fluorescence well asmodified Y39N, N105T, I171V codon and sequences of restriction enzymes have also been removed that is compatible with B subtilis The results showed that the mutations have made the Key words: Bacillus subtilis, pHT plasmid, GFP, supperfolder GFP TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] B.P Cormack, R.H Valdivia, S.Falkow, FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP) Gene, 173, 1, 33-38 (1996) intra - and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis Protein Expression and Purification 46, 2, 189-195 (2006) [2] C Gustafsson, S Govindarajan, J Minshull, Codon bias and heterologous protein expression Trends in Biotechnology, 22, 7, 346-353 (2004) [8] P.M Sharp, E Cowe, D.G Higgins, D.C Shields, K.H Wolfe, F Wright, Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizo saccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity Nucleic Acids Research, 16, 17, 8207-8211 (1988) [3] G Lithwick, H Margalit, Hierarchy of sequence-dependent features associated with prokaryotic translation Genome Research,13, 12, 2665-2673 (2003) [4] H.D.Nguyen, Q.A Nguyen, R.C Ferreira, L.C.S Ferreira., L.T Tran, W Schumann, Construction of plasmid-based expression vectors for Bacillus subtilis exhibiting full structural stability Plasmid 54, 3, 241-248 (2005) [5] M Ormö, A.B Cubitt, K Kallio, L.A Gross, R.Y Tsien, S.J Remington, Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein Science, 273, 5280, 1392-1395 (1996) [6] J.D Pédelacq, S Cabantous, T Tran, T.C Terwilliger, G.S Waldo, Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein Nature Biotechnology 24(1) 79-88 (2006) [7] T.T.P Phan, H.D Nguyen, W Schumann, Novel plasmid-based expression vectors for [9] C.N Stewart, The utility of green fluorescent protein in transgenic plants Plant Cell Reports, 20, 5, 376-382 (2001) [10] J Wahlfors, S Loimas, T Pasanen, T Hakkarainen, Green fluorescent protein (GFP) fusion constructs in gene therapy research Histochemistry and Cell Biology,115, 1, 59-65 (2001) [11] G.S Waldo, B.M Standish, J Berendzen, T.C.Terwilliger, Rapid protein-folding assay using green fluorescent protein Nature America Inc17, 7, 691-695 (1999) [12] M Zimmer, Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior Chemical Reviews,102, 3, 759-781 (2002) Trang 55 ... dụng GFP vào chủng chủ ngày dễ dàng, nhanh chóng tiết kiệm KẾT LUẬN Việc tạo biến đổi trình tự amino Cloning and investigating GFP (green fluorescent protein) allowing higher expression in Bacillus. .. (1996) intra - and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis Protein Expression and Purification 46, 2, 189-195 (2006) [2] C Gustafsson, S Govindarajan, J Minshull,... Tran Linh Thuoc Nguyen Duc Hoang University of Science, VNU-HCM ABSTRACT Gfp gene coding for protein GFP (green fluorescent protein) from the jellyfish Aequorea victoria is the most popular indicator