Untitled TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 18, SOÁ T3 2015 Trang 87 Tạo tế bào vi khuẩn Escherichia coli biểu hiện tái tổ hợp enzyme acyl thioesterase 2 (ALT2) có khả năng tổng hợp các 2 methylketone[.]
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SỐ T3- 2015 Tạo tế bào vi khuẩn Escherichia coli biểu tái tổ hợp enzyme acyl thioesterase (ALT2) có khả tổng hợp 2methylketone chuỗi carbon ngắn trung bình Khuất Lê Uyên Vy Đỗ Phương Thảo Nguyễn Thị Hồng Thương Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM ( Bài nhận ngày 12 tháng 12 năm 2014, nhận đăng ngày 12 tháng 08 năm 2015) TÓM TẮT 2-Methylketone nhóm hợp chất hữu có nhiều ứng dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm mỹ phẩm với vai trò chất tạo mùi, tạo hương Một số methylketone tìm thấy thực vật có vai trị chất dẫn dụ sinh học thuốc trừ sâu tự nhiên Đặc biệt, gần methylketone xem nguồn hợp chất hứa hẹn cho việc sản xuất lượng sinh học tương lai chúng có số kích nổ cetane cao, có tính ưa nước nhiệt độ nóng chảy thấp acid béo sử dụng nhiều sản xuất dầu diesel sinh học Thêm vào đó, methylketone có chuỗi carbon ngắn có nhiệt độ nóng chảy thấp so với methylketone chuỗi carbon dài Trong nghiên cứu này, chúng tơi tạo dịng biểu tế bào vi khuẩn Escherichia coli C41(DE3) gen mã hóa enzym acyl thioesterase (ALT2) phân lập từ Arabidopsis thaliana Khi biểu tái tổ hợp tế bào vi khuẩn E coli C41(DE3), enzyme ALT2 chủ yếu sử dụng chất 3ketoacyl-ACP, hợp chất trung gian đường chuyển hóa acid béo diễn tế bào vi khuẩn, để tổng hợp 3ketoacid 3-Ketoacid hợp chất khơng bền, bị decarboxyl hóa thành hợp chất methylketone tương ứng có chiều dài chuỗi carbon ngắn nguyên tử carbon Các hợp chất methylketone từ dịch mơi trường ni cấy ly trích hexane phân tích thành phần kỹ thuật sắc ký khí với đầu dò FID (GC-FID) Kết cho thấy nuôi cấy cảm ứng với IPTG 0,25 mM nhiệt độ 37 oC 3,5 tế bào vi khuẩn E coli C41(DE3) biểu tái tổ hợp enzyme ALT2 có khả sản sinh hợp chất 2-methylketone chuỗi carbon ngắn trung bình bao gồm 2-nonanone (9C), 2-undecanone (11C) 2-tridecanone (13C) Từ khóa: 2-methylketone, acyl thioesterase (ALT2), Arabidopsis thaliana, vector pETDuet-1, E coli C41(DE3), sắc ký khí với đầu dị FID (GC-FID) Trang 87 Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 MỞ ĐẦU 2-Methylketone nhóm hợp chất hữu mang nhóm định chức ketone nguyên tử carbon thứ hai Nhóm hợp chất có nhiều ứng dụng rộng rãi cơng nghiệp thực phẩm mỹ phẩm với vai trò chất tạo hương [1] Một số 2methylketone tìm thấy thực vật có vai trị chất dẫn dụ sinh học thuốc trừ sâu tự nhiên [2, 3] Những năm gần đây, methylketone bắt đầu nhận nhiều quan tâm nhà nghiên cứu lượng sinh học hợp chất có trị số kích nổ cetane cao, xem nguồn lượng tái sinh tương lai Dựa sở liệu trình tự gen liệu EST công bố số loài thực vật, năm gần nhà khoa học xác định gen mã hóa cho enzyme tham gia đường sinh tổng hợp methylketone thực vật Năm 2010, Yu cộng [4] xác định hai enzyme methylketone synthase (ShMKS2) methylketone synthase (ShMKS1) tham gia đường sinh tổng hợp methylketone loài cà chua hoang dại Solanum habrochaites ShMKS2 có hoạt tính 3ketoacyl-ACP thioesterase xúc tác thủy phân liên kết thioester 3-ketoacyl-ACP (một hợp chất trung gian đường sinh tổng hợp acid béo) thành 3-ketoacid ShMKS1 có hoạt tính 3ketoacid decarboxylase, xúc tác decarboxyl hóa 3-ketoacid thành methylketone có chiều dài chuỗi carbon ngắn nguyên tử carbon (Hình 1) Ngồi ra, 3-ketoacid hợp chất khơng bền, bị decarboxyl hóa 75 oC thành hợp chất methylketone, lượng nhỏ 3ketoacid bị decarboxyl hóa nhiệt độ thường Hình Sự tổng hợp methylketone [4] ShMKS2 hoạt động hiệu chất 3-ketomyristoyl-ACP (C14) 3ketolauroyl-ACP (C12) tạo thành 3-ketoacid tương ứng 3-ketomyristic acid (C14) 3ketolauric acid (C12), methylketone tổng hợp lơng tiết cà chua hoang dại dịch môi trường nuôi cấy vi khuẩn E coli siêu biểu ShMKS2 ShMKS1 chủ yếu bao gồm 2-tridecanone (13C) 2undecanone (11C) [4] Hỗn hợp 2-tridecanone ngắn có sườn carbon mang liên kết đơi có nhiệt độ nóng chảy thấp nhiều so với methylketone chuỗi dài có sườn carbon bão hịa với chiều dài chuỗi, hướng nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu hóa đặc tính nhiên liệu cách điều chỉnh chiều dài chuỗi mức độ khơng bão hịa sườn carbon hợp chất methylketone Năm 2014, Pulsifer cộng [6] phân lập bốn gen thuộc họ acyl (C13) 2-undecanone (C11) với tỉ lệ 1:1 dựa khối lượng có số kích nổ cetane cao (58,4) [5], nhiên, nhiệt độ nóng chảy chúng tương đối cao điều bất lợi cho đặc tính thioesterase từ Arabidopsis thaliana mã hóa cho protein tương đồng 72-80 % với ShMKS2 đặt tên acyl-lipid thioesterase (ALT1), ALT2, ALT3 ALT4 Khi biểu gen nhiên liệu nhiệt lạnh Do methylketone chuỗi tế bào E coli K27, chủng khuyết gen Trang 88 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SỐ T3- 2015 FadD – gen mã hóa enzyme acyl-CoA synthetase, enzym ALT sử dụng chất acyl-ACP để tạo thành acid béo đa dạng chiều dài chuỗi carbon (C8-C16), mức độ bão hịa chuỗi trạng thái oxy hóa Đặc biệt, enzyme ALT2 có khả sử dụng chất 3-ketoacyl-ACP để tổng hợp 3-ketoacid (acid béo có mang nhóm chức ketone nguyên tử carbon thứ 3) chuỗi ngắn (8C, 10C) biểu tái tổ hợp tế bào E coli K27 Thêm vào đó, năm 2012, Auldrich cộng [7] chứng minh ShMKS1G129W, dạng đột biến thay acid amine G (Glycine) vị trí 129 acid amine mơ cơng nghiệp cách chủ động, đáp ứng tiềm ứng dụng rộng rãi nhóm hợp chất methylketone bảo vệ thực vật, công nghiệp tạo hương lĩnh vực sản xuất lượng sinh học, mong muốn đưa đường sinh tổng hợp methylketone chuỗi ngắn trung bình vào tế bào vi khuẩn E coli cách biểu đồng thời hai gen ALT2 ShMKS1G129W vào vector pETDuet-1 chứa hai vùng tạo dòng Trong đó, gen ShMKS1G129W tạo dịng vào vùng MSC1 gen ALT2 tạo dòng vào vùng MSC2 vector pETDuet-1 Như vậy, việc tạo dòng gen ALT2 vào W (Tryptophan) có hoạt động xúc tác hiệu gấp 44 lần so với ShMKS1 chất 3-ketoacid chuỗi ngắn Nhằm hướng tới việc tổng hợp methylketone chuỗi ngắn trung bình quy vùng MSC2 vector pETDuet-1 bước cần thực nội dung báo Trang 89 Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 Hình Con đường sinh tổng hợp methylketone tế bào E.coli từ chất ban đầu glucose [8] VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng vi sinh vật vector Vector pUNI51 mang cDNA mã hóa cho gen ALT2 (426 bp) từ Arabidopsis thaliana (Arabidopsis Biological Resource Center) Vector pETDuet-1 thuộc hệ thống vector Duet (Novagen) có mang gen kháng kháng sinh ampicillin Chủng E coli TOP10 (Invitrogen) dùng để nhân plasmid Chủng E coli C41(DE3) (Invitrogen) dùng để tạo dòng biểu protein mục tiêu với cảm ứng IPTG Tế bào khả nạp E coli TOP10 E coli C41(DE3) tạo phương pháp CaCl2 lạnh Phương pháp PCR kết hợp A-tailing Phương pháp PCR sử dụng để tổng hợp đoạn DNA mang gen ALT2 có gắn trình tự cắt giới hạn NdeI đầu 5’ XhoI đầu 3’(được gọi đoạn NdeI-ALT2-XhoI báo này) Bước A-tailing kết hợp cuối phản ứng PCR giúp gắn thêm Adenine vào đầu 5’ hai mạch sản phẩm PCR Gen ALT2 khuếch đại Taq DNA Polymerase (BioLabs) từ khuôn vector pUNI51 mang trình tự mã hóa ALT2 Mồi xi (NdeIALT2-F: 5'-CATATGGGTGGGTTCCATGAG3') mồi ngược (XhoI-ALT2-R: 5'CTCGAGATCGACCAAGTGTTGACA-3') thiết kế có gắn thêm trình tự nhận biết enzym cắt giới hạn NdeI XhoI nhằm hỗ trợ việc chèn đoạn gen ALT2 vào vùng MCS2 vector pETDuet-1 bước sau Để thu nhận hiệu đoạn NdeI-ALT2-XhoI, tiến hành gắn đoạn NdeI-ALT2-XhoI vào vector pGEM-T (Promega) trước, cần gắn thêm Adenine vào đầu 5’ hai mạch đoạn DNA thông qua phản ứng A-tailing kết hợp vào giai đoạn kéo Trang 90 dài bước cuối phản ứng PCR Chi tiết chu trình nhiệt cho phản ứng PCR kết hợp Atailing sau: 95 ˚C/30 giây; 36 x (95 ˚C/20 giây, 52 ˚C/20 giây, 72 ˚C/40 giây); bổ sung thêm 0,2 µl Taq DNA Polymerase 0,2 µL dATP (10 mM); 72 ˚C/5 phút; ˚C/∞ Phương pháp thu hồi tinh DNA từ gel agarose Sản phẩm phản ứng PCR kết hợp Atailing chạy điện di gel agarose %, đoạn NdeI-ALT2-XhoI có mang Adenine đầu 5’ hai mạch tinh từ gel kit ExpinTM Gel SV (GenAll) bảo quản -20 ˚C để làm nguyên liệu tạo dòng bước sau Phương pháp gắn đoạn NdeI-ALT2-XhoI vào vector pGEM-T Đoạn NdeI-ALT2-XhoI có mang Adenine đầu 5’ hai mạch chèn vào vector pGEMT thông qua phản ứng nối xúc tác enzyme T4 DNA ligase, tạo plasmid pGEM-T-NdeIALT2-XhoI Hỗn hợp phản ứng nối biến nạp vào tế bào khả nạp E coli TOP10 phương pháp sốc nhiệt Sau đó, thể biến nạp E coli TOP10/pGEM-T-NdeI-ALT2-XhoI nuôi cấy đĩa môi trường LB rắn (10 g/L tryptone, g/L cao nấm men g/L muối NaCl) có bổ sung ampicillin với nồng độ cuối 100 µg/mL Thu nhận khuẩn lạc đơn mọc lên, tiến hành phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi NdeI-ALT2F XhoI-ALT2-R, với chu trình nhiệt 95 ˚C/30 giây; 36 x (95 ˚C/20 giây, 52 ˚C/20 giây, 72 ˚C/40 giây); 72 ˚C/5 phút; ˚C/∞ để sàng lọc khuẩn lạc dòng tế bào E coli TOP10 mang plasmid pGEM-T-NdeI-ALT2-XhoI Dòng tế bào E coli TOP10/pGEM-T-NdeI-ALT2-XhoI nuôi nhân sinh khối plasmid pGEM-T-NdeI-ALT2- TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SOÁ T3- 2015 XhoI tách chiết kit StrataPrep Plasmid Miniprep Kit (Agilent Technologies) Plasmid pGEM-T-NdeI-ALT2-XhoI cắt mở vòng với enzyme NdeI điện di song song với thang DNA chuẩn kb gel agarose % để kiểm tra kích thước plasmid Phương pháp tạo dòng gen ALT2 vào vector pETDuet-1 Plasmid pGEM-T-NdeI-ALT2-XhoI cắt hai enzyme cắt giới hạn NdeI XhoI Sản phẩm cắt điện di gel agarose % Đoạn NdeI-ALT2-XhoI thu hồi tinh từ gel agarose, sau nối với vector pETDuet-1 cắt mở vòng với NdeI XhoI Hỗn hợp Phương pháp biểu ALT2 tế bào vi khuẩn E coli C41(DE3) Plasmid pETDuet-1-ALT2 biến nạp vào tế bào khả nạp E coli C41(DE3) phương pháp sốc nhiệt Khuẩn lạc đơn dòng tế bào E coli C41(DE3) biến nạp pETDuet-1ALT2 cho vào mL mơi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin với nồng độ cuối 100 µg/mL ni cấy lắc hoạt hóa qua đêm Cấy chuyền 0,1 mL dịch nuôi cấy sang 30 mL môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin với nồng độ cuối 100 µg/ml tiếp tục nuôi cấy 37 ˚C với tốc độ lắc 200 vòng/phút Khi OD600 đạt 0,6-1, bổ sung IPTG đến nồng độ cuối 0,25 mM, tiếp tục ni cấy lắc 200 vịng/phút 37 ˚C 3,5 Dịch nuôi cấy vi khuẩn E coli C41(DE3) mang vector pETDuet-1-ALT2 thu nhận cho bước phân tích Thí nghiệm đối chứng thực tương tự với tế bào E coli C41(DE3) biến nạp vector pETDuet-1 trống, không mang gen ALT2 phản ứng nối biến nạp vào tế bào khả nạp E coli TOP10 Các bước sàng lọc dòng tế bào E coli TOP10 mang plasmid pETDuet-1-ALT2 phương pháp tách chiết kiểm tra kích thước plasmid pETDuet-1-ALT2 thực tương tự mô tả mục “Phương pháp gắn đoạn NdeI-ALT2-XhoI vào vector pGEM-T” Trình tự nucleotide gen ALT2 vector pETDuet-1ALT2 xác định theo phương pháp cải tiến máy BigDye® Terminator v3.1 cơng ty First BASE, Malaysia với mồi T7 Terminator Kết giải trình tự kiểm tra phần mềm BioEdit để phát lỗi bắt cặp enzym DNA Taq polymerase tạo trình PCR Phương pháp xác định thành phần methylketone dịch nuôi cấy vi khuẩn E coli C41(DE3)/pETDuet-1-ALT2 30 ml dịch môi trường nuôi cấy vi khuẩn E coli C41(DE3)/pETDuet-1-ALT2 đun nóng 75 oC 30 phút mL hexane thêm vào để chiết xuất hợp chất methylketone vào pha hexane Thành phần methylketone hòa tan pha hexane phân tích phương pháp sắc ký khí (GC) Hệ thống GC Agilent 6890 N sử dụng với cột HP innowax, 30 m x 250 µm x 0,25 µm (chịu nhiệt độ cao 250 oC) đầu dị FID Chương trình nhiệt độ chạy 31 phút sau: nhiệt độ tiêm (giải hấp) 250 oC, nhiệt độ đầu dò 250 oC, nhiệt độ đầu 50 oC, tăng 15 oC/1 phút đến 160 oC, tăng oC/1 phút đến 240 o C giữ 10 phút Các hợp chất methylketone từ dịch ni cấy xác định thông qua việc so sánh thời gian lưu với chất chuẩn 2nonanone (9C), 2-undecanone (11C), 2tridecanone (13C) 2-pentadecanone (SigmaAldrich) Thí nghiệm đối chứng thực tương tự với dịch môi trường nuôi cấy vi khuẩn E coli Trang 91 Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 C41(DE3) biến nạp vector pETDuet-1 trống, không mang gen ALT2 Kiểm tra biểu gen ALT2 phương pháp điện di SDS-PAGE 10 ml dịch môi trường nuôi cấy vi khuẩn E coli C41(DE3)/pETDuet-1-ALT2 cảm ứng biểu gen ALT2 IPTG ly tâm thu sinh khối Hòa tan sinh khối 500 μL đệm ly giải (100 mM NaCl; 10 mM Tris; mM EDTA; 10 % glycerol; pH 8) phá vỡ màng tế bào sóng siêu âm Dịch sau phá màng tế bào chia làm hai phần: phần (100 μL) sử dụng làm dịch protein tổng số, phần (300 μL) ly tan, phần tủa chứa protein không tan huyền phù lại 300 μL đệm ly giải Tiến hành điện di SDS-PAGE dung dịch chứa protein tổng số, protein tan, protein khơng tan để phân tích biểu gen ALT2 tế bào E coli C41(DE3)/pETDuet-1-ALT2 Thí nghiệm đối chứng thực tương tự với dịch môi trường nuôi cấy vi khuẩn E coli C41(DE3) biến nạp vector pETDuet-1 trống, không mang gen ALT2 dịch môi trường nuôi cấy vi khuẩn E coli C41(DE3)/pETDuet-1ALT2 không cảm ứng biểu gen ALT2 IPTG tâm Sau ly tâm, phần dịch chứa protein KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tổng hợp đoạn gen ALT2 có gắn trình tự cắt giới hạn NdeI đầu 5’ XhoI đầu 3’ (NdeIALT2-XhoI) Kết khuếch đại đoạn DNA chứa trình tự mã hóa ALT2 có gắn thêm trình tự nhận biết enzyme cắt giới hạn NdeI đầu 5’ XhoI đầu 3’ kỹ thuật PCR kết hợp A-tailing (Hình 3) cho thấy giếng xuất vạch nằm vạch 500 bp thang chuẩn dự đoán tương đương với kích thước 426 bp gen ALT2 Đoạn NdeI-ALT2-XhoI gắn thêm Adenine vào đầu 5’ hai mạch chèn vào vector pGEM-T có mang Thymidine đầu 3’của chứng tỏ khuẩn lạc sử dụng tương ứng với dòng tế bào TOP10 mang plasmid pGEM-T-NdeIALT2-XhoI Ngược lại, giếng không xuất vạch nào, chứng tỏ khuẩn lạc sử dụng tương ứng với dịng tế bào vi khuẩn khơng biến nạp plasmid pGEM-T-NdeI-ALT2-XhoI Plasmid pGEM-T-NdeI-ALT2-XhoI cắt mở vòng với enzyme cắt giới hạn NdeI, chạy điện di gel agarose % Kết điện di (Hình 5) cho thấy có vạch (giếng 1) vị trí tương ứng vạch 3000 bp 4000 bp thang chuẩn DNA (giếng 2) phù hợp với kích thước dự đoán plasmid pGEM-T-NdeI-ALT2XhoI khoảng 3432 bp Như vậy, gắn đoạn NdeI-ALT2-XhoI vào vector pGEM-T tạo plasmid pGEM-T-NdeI-ALT2-XhoI hai mạch nhờ xúc tác enzyme T4 DNA ligase Hỗn hợp phản ứng nối biến nạp vào tế bào khả nạp E coli TOP10 Kết sàng lọc dịng tế bào TOP10 có mang plasmid pGEM-TNdeI-ALT2-XhoI phản ứng PCR khuẩn lạc Plasmid pGEM-T-NdeI-ALT2-XhoI cắt hai enzym cắt giới hạn NdeI XhoI Sản (Hình 4) cho thấy giếng xuất vạch có kích thước tương đương với kích thước 426 bp gen ALT2 (dưới vạch 500 bp thang chuẩn), phẩm cắt điện di gel agarose % Đoạn NdeI-ALT2-XhoI thu hồi tinh từ gel agarose Trang 92 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SỐ T3- 2015 Hình Kết phản ứng PCR kết hợp A-tailing khuếch đại gen ALT2 1, sản phẩm PCR; 2, thang chuẩn DNA 1kb Hình Kết sàng lọc dịng tế bào TOP10/pGEM-T-NdeI-ALT2-XhoI phản ứng PCR khuẩn lạc 1, dòng tế bào TOP10 khơng biến nạp plasmid pGEM-T-NdeI-ALT2-XhoI; 2, dịng tế bào TOP10 biến nạp plasmid pGEM-TNdeI-ALT2-XhoI; 3, thang chuẩn DNA kb Tạo dòng gen ALT2 vào vector pETDuet-1 Đoạn trình tự NdeI-ALT2-XhoI thu nhận cách cắt plasmid pGEM-T-NdeI-ALT2-XhoI cặp enzyme cắt giới hạn NdeI XhoI Đoạn trình tự sau nối với vector pETDuet1 cắt mở vòng với hai enzyme cắt giới hạn Hỗn hợp phản ứng nối biến nạp vào tế bào khả nạp E coli TOP10 Kết sàng lọc dòng tế bào E coli TOP10 mang plasmid pETDuet-1ALT2 thực phản ứng PCR khuẩn lạc với mồi xuôi DuetUP2 mồi ngược XhoIALT2-R (Hình 6) cho thấy giếng xuất vạch có kích thước tương đương với kích thước dự đoán 540 bp, chứng tỏ khuẩn lạc sử dụng Hình Kết kiểm tra kích thước plasmid pGEM-T-NdeIALT2-XhoI 1, plasmid pGEMT-NdeI-ALT2-XhoI cắt mở vòng NdeI; 2, thang chuẩn DNA kb dòng tế bào vi khuẩn E coli TOP10 biến nạp thành cơng plasmid pETDuet-1-ALT2 Plasmid pETDuet-1-ALT2 cắt mở vịng với enzyme cắt giới hạn NdeI, chạy điện di gel agarose % Kết điện di (Hình 7) cho thấy có vạch (giếng 1) vị trí tương ứng vạch 5000 6000 bp thang chuẩn (giếng 2) phù hợp với kích thước dự đoán plasmid pETDuet-1-ALT2 khoảng 5789 bp Kết giải trình tự gene ALT2 plasmid pETDuet-1ALT2 (Hình 8) cho thấy q trình tạo dịng gene ALT2 vào vector pETDuet-1 không xuất đột biến làm thay đổi trình tự gene ALT2 Trang 93 Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 Như vậy, tạo dịng thành cơng gene ALT2 từ Arabidopsis thaliana vào vùng MCS2 vector pETDuet-1 Hình Kết sàng lọc dòng tế bào E coli TOP10/pETDuet-1-ALT2 phản ứng PCR khuẩn lạc 1, thang chuẩn DNA kb; 2, sản phẩm PCR khuẩn lạc dòng tế bào E coli TOP10 biến nạp thành công plasmid pETDuet-1-ALT2 Hình Kết kiểm tra kích thước vector pETDuet-1-ALT2 1, thang chuẩn DNA kb; 2, plasmid pETDuet-1-ALT2 cắt mở vịng NdeI Hình Kết giải trình tự plasmid pETDuet-1-ALT2 với mồi T7 Terminator Đoạn trình tự in đậm trình tự mã hóa protein ALT2 tạo dòng vào vector pETDuet-1 Biểu tái tổ hợp protein ALT2 tế bào vi khuẩn E coli C41(DE3) xác định thành phần 2-methylketone thoát từ dịch nuôi cấy Plasmid pETDuet-1-ALT2 biến nạp đun nóng dịch ni cấy tế bào vi khuẩn E coli C41(DE3) mang vector trống pETDuet-1 không chứa gen ALT2, có lượng khơng đáng kể 2-nonanone (9C) 2-tridecanone (13C) vào tế bào khả nạp E coli C41(DE3) Dịng tế bào vi khuẩn E coli C41(DE3) có mang plasmid pETDuet-1-ALT2 có khả mọc mơi trường LB có bổ sung ampicillin chọn để ni cấy cảm ứng biểu tái tổ hợp protein ALT2 IPTG Kết Hình cho thấy phát hiện, đồng thời khơng phát 2-undecanone (11C) (Hình 9D, E) Kết phân tích GC-FID cho thấy khơng có khác biệt rõ ràng sắc ký đồ mô tả hợp chất methylketone từ dịch ni cấy tế bào E coli C41(DE3)/pETDuet-1 xử lý 75 oC Trang 94 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SỐ T3- 2015 với dịch nuôi cấy tế bào E coli C41(DE3)/pETDuet-1 chưa xử lý nhiệt độ, đề nghị khơng có có 3-ketoacid diện dịch mơi trường nuôi cấy tế bào E coli C41(DE3)/pETDuet-1 Những kết thu từ thí nghiệm đối chứng lần củng cố liệu thực nghiệm công bố Yu (2010) Pulsifer (2014), chứng minh chủng vi khuẩn E coli không biến nạp gene mã hóa enzyme 3-ketoacyl-ACP thioesterase (ShMKS2 ALT2) khơng sinh tạo lượng không đáng kể 3-ketoacid mơi trường ni cấy Trong đó, dịch môi trường nuôi cấy tế bào E coli C41(DE3) có mang plasmid pET-Duet-1-ALT2 cảm ứng biểu tái tổ hợp protein ALT2 IPTG đun nóng 75 oC, sinh lượng lớn sản phẩm cuối methylketone chuỗi carbon ngắn trung bình bao gồm 2-nonanone (9C), 2-undecanone (11C) 2tridecanone (13C) (Hình 9B) so với mẫu chưa xử lý nhiệt độ (Hình 9C) với mẫu đối chứng âm (Hình 9D) Sự diện 2heptanone (7C) chưa khẳng định thí nghiệm cịn thiếu chất chuẩn tương ứng Như vậy, tế bào vi khuẩn E coli C41(DE3)/pETDuet-1-ALT2, enzyme ALT2 sử dụng chất sẵn có tế bào vi khuẩn để tổng hợp tiết môi trường nuôi cấy 3-ketoacid decarboxyl hóa 3ketoacid nhiệt độ cao dẫn đến tạo thành sản phẩm cuối methylketone tương ứng Trong nghiên cứu Pulsifer cộng (2014), ALT2 biểu tế bào vi khuẩn E coli K27 khuyết gen FadD, gen mã hóa enzyme acyl-CoA synthetase [6] Ở chủng vi khuẩn khuyết enzyme acyl-CoA synthetase, acid béo tự tạo tích lũy phóng thích mơi trường ni cấy thay hoạt hóa thành acyl-CoA phân hủy theo đường β-oxy hóa Nhóm nghiên cứu Pulsifer sử dụng chủng vi khuẩn để biểu enzyme acyl-lipid thioesterase ALT nhằm gia tăng tiết môi trường nuôi cấy acid béo tự tổng hợp enzyme ALT khảo sát Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu sau chứng minh ALT2 khơng thể hoạt tính acyl-ACP thioesterase với chất thử nghiệm lauroyl (12:0)-ACP ALT1, [6] Như vậy, ý nghĩa việc sử dụng chủng E coli K27 khuyết gen FadD so sánh với việc sử dụng dòng tế bào E coli khác không mang đột biến gen làm tế bào chủ biểu gene ALT2 chưa thể rõ qua liệu thực nghiệm công bố Pulsifer cộng Kết kiểm tra biểu protein ALT2 phương pháp điện di SDS-PAGE cho thấy mẫu protein tổng số protein không tan thu nhận từ tế bào E coli C41(DE3)/pETDuet1-ALT2 cảm ứng biểu IPTG xuất vạch đậm mẫu protein tan xuất vạch nhạt nằm vạch 14 22 kDa, phù hợp với kích thước dự đốn protein ALT2 (17 kDa) chủng đối chứng E coli C41(DE3) chứa vector pETDuet-1 không mang gene ALT2 không cho vạch tương ứng vị trí Bên cạnh đó, khơng cảm ứng biểu IPTG, chủng E coli C41(DE3)/pETDuet-1ALT2 không biểu protein ALT2 này, chứng tỏ protein ALT2 biểu có cảm ứng IPTG Điều đáng ý kết chạy điện di phân tích protein SDS-PAGE protein ALT2 đa số pha không tan diện pha tan hoạt tính enzyme ALT2 thể rõ qua kết phân tích sản phẩm cuối methylketone tạo kỹ thuật GCFID (Hình 9) Những kết cung cấp thêm sở khoa học minh chứng cho cần thiết tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa khả tổng hợp methylketone chủng vi khuẩn nghiên cứu Trang 95 Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 Hình Sắc ký đồ mô tả hợp chất methylketone từ dịch ni cấy tế bào E coli C41(DE3) biểu vector pETDuet-1 vector pETDuet-1-ALT2 A, chất chuẩn methylketone B, dịch nuôi cấy tế bào E coli C41(DE3)/pETDuet-1-ALT2 xử lý 75 oC C, dịch nuôi cấy tế bào E coli C41(DE3)/pETDuet-1-ALT2 chưa xử lý nhiệt độ D, dịch nuôi cấy tế bào E coli C41(DE3)/pETDuet-1 xử lý 75 oC E, dịch nuôi cấy tế bào E coli C41(DE3)/pETDuet-1 chưa xử lý nhiệt độ Hình 10 Kết kiểm tra biểu protein ALT2 phương pháp điện di SDS-PAGE Trang 96 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 18, SOÁ T3- 2015 KẾT LUẬN Bằng kỹ thuật sinh học phân tử, tạo thành công dịng tế bào E coli C41(DE3) có mang vector tái tổ hợp pETDuet-1-ALT2 Dòng tế bào biểu tái tổ hợp enzyme acyl thioesterase (ALT2) có khả sử dụng chất 3-ketoacyl-ACP sinh đường sinh tổng hợp acid béo tế bào E coli để tạo thành 3-ketoacid chuỗi ngắn trung bình Sự tổng hợp protein ALT2 kiểm chứng điện di SDS-PAGE sản phẩm 3-ketoacid chuỗi ngắn trung bình xác định cách gián tiếp thông qua xác định hợp chất methylketone chuỗi ngắn trung bình tương ứng tạo thành sau đun nóng dịch mơi trường ni cấy nhiệt độ cao Hiện nay, nhóm nghiên cứu thực biểu gene ShMKS2G129W vào vùng MCS1 vector tái tổ hợp pETDuet-1-ALT2 khảo sát điều kiện nuôi cấy cảm ứng khác nhằm tối ưu hóa khả sinh tổng hợp methylketone chủng vi khuẩn, đặc biệt methylketone chuỗi ngắn hướng đến quy mô sản xuất lớn cần cho ứng dụng rộng rãi nhóm hợp chất Lời cảm ơn: Nghiên cứu tài trợ Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 106-NN.02-2013.35 Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn PTN Phân tích trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên ,ĐHQG-HCM hỗ trợ phân tích mẫu kỹ thuật GC-FID Cloning and expression of the acyl thioesterase (ALT2) gene in Escherichia coli for producing short- and medium-chain 2-methylketones Khuat Le Uyen Vy Do Phuong Thao Nguyen Thi Hong Thuong University of Science, VNU-HCM ABSTRACT 2-Methylketones are organic compounds that are more widely used in the food industry and cosmetics Some of methylketones found in plants act as pheromones and natural insecticides Recently, methylketones have been recognized as strong candidates for the production of renewable energy as they possess not only favourable cetane numbers but also lower hydrophilicity and melting points than fatty acids which have been used in biodiesel production In addition, short chain methylketones have much lower Trang 97 Science & Technology Development, Vol 18, No.T3- 2015 methylketones Methylketones released in melting points than long chain methylketones the growth medium of E coli expressing ALT2 In this study, we cloned and expressed in were extracted by hexane and analyzed by Escherichia coli C41(DE3) cells a gene for gas chromatography with the flame ionization acyl thioesterase (ALT2) isolated from detector (GC-FID) The results showed that Arabidopsis thaliana The ALT2 enzyme the E coli C41(DE3) cells expressing ALT2 could hydrolyze 3-ketoacyl-ACP (also called recombinantly produced 2-nonanone (9C), 2β-ketoacyl-ACP) intermediates in the fatty undecanone (11C) and 2-tridecanone (13C) acid biosynthetic pathway into the in the spent medium when were induced with corresponding 3-ketoacid The resulting 30.25 mM IPTG at 37 oC for 3.5 hours ketoacids are unstable compounds that will be decarboxylated to produce n-1 Keywords: 2-methylketones, acyl thioesterase (ALT2), Arabidopsis thaliana, pETDuet-1, E coli C41(DE3), GC-FID TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] F.W Forney, A.J Markovetz, The biology of methyl ketones, Journal of Lipid Research, 12, 4, 383-395 (1971) [2] M.S Angela, D.T Liane, L.J Larry, (S)-2pentadecyl acetate and 2-pentadecanone components of aggregation pheromone of Drosophila busckii, Journal of Chemical Ecology, 15, 11, 2577-2588 (1989) [3] G.F Antonious, Persistence of 2-tridecanone on the leaves of seven vegetables, Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 73, 6, 1086-1093 (2004) [4] G Yu, T.T.H Nguyen, Y Guo, I Schauvinhold, M.E Auldridge, N Bhuiyan, E Fridman, Y Iijima, J.P Noel, E Pichersky, The enzymatic functions of the wild tomato Solanumhabrochaites glabratum methylketone synthases and 2, Plant Physiology, 154, 1, 67-77 (2010) [5] E.B Goh, E.E.K Baidoo, J.D Keasling, H.R Beller, Engineering of bacterial methyl ketone synthesis for biofuels, Applied and Trang 98 Environmental Microbiology, 78, 1, 70-80 (2012) [6] I.P Pulsifer, C Lowe, S.A Narayaran, A.S Busuttil, S.J Vishwanath, F Domergue, O Rowland, Acyl-lipid thioesterase 1-4 from Arabidopsis thaliana from a novel family of fatty acyl-acyl carrier protein thioesterases with divergent expression patterns and substrate specificities, Plant Molecular Biology, 84, 4, 549-563 (2014) [7] M.E Auldridge, Y Guo, M.B Austin, J Ramsey, E Fridman, E Pichersky, J.P Noel, Emergent decarboxylase activity and attenuation of alpha/beta-hydrolase activity during the evolution of methylketone biosynthesis in tomato, Plant Cell, 24, 4, 1596-1607 (2012) [8] J Park, M Rodríguez-Moyá, M Li, E Pichersky, K.Y San, R Gonzalez, Synthesis of methyl ketones by metabolically engineered Escherichia coli, J Ind Microbiol Biotechnol, 39, 1703-1712 (2012) ... thioesterase (ALT2) gene in Escherichia coli for producing short- and medium-chain 2- methylketones Khuat Le Uyen Vy Do Phuong Thao Nguyen Thi Hong Thuong University of Science, VNU-HCM ABSTRACT 2- Methylketones... recombinantly produced 2- nonanone (9C), 2? ?-ketoacyl-ACP) intermediates in the fatty undecanone (11C) and 2- tridecanone (13C) acid biosynthetic pathway into the in the spent medium when were induced... medium of E coli expressing ALT2 In this study, we cloned and expressed in were extracted by hexane and analyzed by Escherichia coli C41(DE3) cells a gene for gas chromatography with the flame