Bài viết Hoạt tính kháng nấm của tinh dầu vỏ cam và vỏ bưởi lên nấm Notryosphaeria dothidea gây bệnh thối trái xoài được thực hiện nhằm khảo sát khả năng ức chế nấm Botryosphaeria gây bệnh thối trái trên xoài (Mangifera indica L.) của tinh dầu vỏ cam (Citrus sinensis L. Osbeck) và tinh dầu vỏ bưởi (Citrus grandis L. Osbeck) bằng phương pháp thử hoạt tính kháng nấm, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), nồng độ gây chết tối thiểu 90 % nấm bệnh (MLC90) và khả năng phòng trừ bệnh của tinh dầu trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Tuyển tập Hội nghị Nấm học Toàn quốc lần thứ doi: 10.15625/vap.2022.0134 HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA TINH DẦU VỎ CAM VÀ VỎ BƯỞI LÊN NẤM Botryosphaeria dothidea GÂY BỆNH THỐI TRÁI XOÀI Trần Thị Thanh Trúc1, Nguyễn Thị Pha1, Nguyễn Quốc Khương2, Đỗ Thị Xuân1* Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ *Email: dtxuan@ctu.edu.vn TĨM TẮT Trong bảo quản xồi sau thu hoạch, xoài dễ bị nấm bệnh công bệnh lan truyền nhanh gây ảnh hưởng đến trình tồn trữ chất lượng xồi Do nghiên cứu thực nhằm khảo sát khả ức chế nấm Botryosphaeria gây bệnh thối trái xoài (Mangifera indica L.) tinh dầu vỏ cam (Citrus sinensis L Osbeck) tinh dầu vỏ bưởi (Citrus grandis L Osbeck) phương pháp thử hoạt tính kháng nấm, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), nồng độ gây chết tối thiểu 90 % nấm bệnh (MLC90) khả phòng trừ bệnh tinh dầu điều kiện phịng thí nghiệm Kết nghiên cứu cho thấy tinh dầu bưởi cho hiệu kháng nấm B dothidea CT2 tốt với giá trị MIC đạt 150 µL/mL tinh dầu cam đạt MIC 300 µL/mL Nồng độ gây chết tối thiểu MLC90 tinh dầu bưởi cam đạt 650 µL/mL Phương pháp xử lí tinh dầu bưởi nồng độ 500 µL/mL kết hợp với chủng nấm bệnh đồng thời cho hiệu giảm bệnh đạt cao giúp bảo quản xoài với bệnh thối trái nấm B dothidea CT2 gây so với nghiệm thức đối chứng không xử lí tinh dầu Kết nghiên cứu cho thấy hai loại tinh dầu thể khả kháng nấm B dothidea CT2 gây thối xoài cát giai đoạn tồn trữ điều kiện in-vitro Từ khoá: Bệnh thối trái xoài, Botryosphaeria sp., tinh dầu bưởi, tinh dầu cam GIỚI THIỆU Tại Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL), xoài (Mangifera indica L.) loại trái có giá trị kinh tế cao tiêu thụ nước lẫn xuất Các bệnh nấm gây hại trái xoài ảnh hưởng nghiêm trọng đến thời gian bảo quản chất lượng xoài Trong đó, bệnh thối trái nấm Botryosphaeria tác nhân quan trọng gây ảnh hưởng đến chất lượng nơng sản q trình bảo quản sau thu hoạch giới [1] Các nghiên cứu trước cho bệnh thối trái xoài tác nhân nấm Colletotrichum spp nên đa số nghiên cứu trước tập trung vào nấm Colletotrichum gây bệnh trái [2, 3] Tuy nhiên, kết phân lập định danh nấm gây bệnh thối trái xoài xác định nấm gây bệnh thối trái loại xoài ĐBSCL thuộc chi Botryosphaeria (số liệu chưa cơng bố) Do thơng tin khả phịng trừ nấm Botryosphaeria trái xồi giai đoạn sau thu hoạch hạn chế Việc sử dụng chiết xuất thực vật bảo quản phòng trừ bệnh thối trái được xem giải pháp thay an tồn để kiểm sốt bệnh hại vi sinh vật gây Hiệu tinh dầu thực vật chứng minh làm giảm tỉ lệ bệnh sau thu hoạch, kéo dài thời gian bảo quản cải thiện chất lượng trái [4] Một số nghiên cứu trước kết luận tinh dầu vỏ trái có múi cam, bưởi có khả ức chế sinh trưởng số loài nấm bệnh Colletotrichum gloeosporioid [5], Aspergillus niger, A flavus, Penicillium chrysogenum P verrucosum [6] Botryosphaeria dothidea [7, 8] Tuy nhiên, ảnh hưởng tinh dầu từ vỏ trái có múi lên nấm 35 Trần Thị Thanh Trúc cs B dothidea gây hại xoài giai đoạn sau thu hoạch bảo quản Việt Nam chưa nghiên cứu Tại ĐBSCL, diện tích, sản lượng cam sành bưởi sản xuất phổ biến xem loại trồng chủ lực vùng [9] Vì nguồn nguyên liệu để ly trích tinh dầu phục vụ q trình tồn trữ bảo quản trái xoài lớn Do nghiên cứu thực nhằm đánh giá hiệu tinh dầu vỏ cam vỏ bưởi ức chế nấm B dothidea gây bệnh thối trái xoài giai đoạn sau thu hoạch bảo quản VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Tinh dầu cam tinh dầu bưởi li trích từ vỏ cam sành vỏ bưởi phương pháp lôi nước [10], với tổng cộng loại tinh dầu sử dụng cho thí nghiệm bao gồm tinh dầu bưởi, tinh dầu cam tinh dầu phối trộn cam bưởi với tỉ lệ 1:1 (w/w) Bảng Tóm tắt thơng tin dịng nấm bệnh sử dụng nghiên cứu Nấm gây bệnh thối trái Nguồn phân lập Địa điểm thu mẫu Thời gian phát triển tơ nấm đĩa thạch CT2 Xoài cát chu Bình Thủy - Cần Thơ ngày CT3.1 Xồi cát Hòa Lộc Ninh Kiều - Cần Thơ ngày CT6 Xài cát Hòa Lộc Ninh Kiều - Cần Thơ ngày ĐT Xoài thơm Tp Sa Đéc - Đồng Tháp ngày Tên tham khảo Botryosphaeria dothidea CT2 Botryosphaeria dothidea CT3.1 Botryosphaeria dothidea CT6 Botryosphaeria dothidea ĐT Bốn dòng nấm bệnh CT2, CT3.1, CT6 ĐT gây bệnh thối trái phân lập bảo quản Phịng thí nghiệm Vi sinh vật Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Thông tin chi tiết nguồn gốc đặc điểm dịng nấm trình bày Bảng Hình Bốn dịng nấm định danh hình thái dựa vào khóa phân loại Phillips cs (2013) [11] định danh phương pháp sinh học phân tử đoạn gen 28S vùng ITS rRNA Sự tương đồng trình tự dịng nấm so sánh với trình tự sở liệu Ngân hàng Gen NCBI CT2a CT2b CT3.1a CT3.1 b ĐTa ĐTb CT6a CT6b Hình1 Hình thái màu sắc tản nấm Botryosphaeria dothidea Hình Hình thái màu sắc tản nấm Botryosphaeria dothidea môi trường PDA mơi trường PDA Chú thích: CT2a, CT3.1a, ĐTa, CT6a mặt tản nấm; CT2b, CT3.1, ĐTb, CT6b mặt tản nấm Chú thích: CT2a, CT3a, ĐTa, CT6a mặt tản nấm; CT2b, CT3b, ĐTb, CT6b mặt tản nấm 36 Hoạt tính kháng nấm tinh dầu vỏ cam vỏ bưởi nấm Botryosphaeria dothiea… 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp lây bệnh nhân tạo điều kiện phịng thí nghiệm Bốn dịng nấm bệnh ni môi trường PDB lỏng (Potato Dextrose Broth chứa 200 g khoai tây 20 g D-glucose L nước cất chuẩn pH 5,6 khử trùng 121 oC 20 phút) thời gian ngày sau tiến hành cắt nhuyễn tản nấm điều kiện vơ trùng để thu dung dịch tơ nấm Sau dung dịch tơ nấm điều chỉnh mật độ 106 CFU/mL (Do Thi Xuan cs., 2020) [12] Các trái xồi giai đoạn sinh lí khơng có biểu bệnh đồng khử trùng bề mặt ethanol 70 %, tạo vết thương nhân tạo cách dùng bó kim (11 mũi kim/bó) vơ trùng châm vào vỏ xoài với độ sâu khoảng mm, châm điểm lên trái xồi vị trí đầu, chóp trái (Hình 2) Chủng bệnh nhân tạo cách nhỏ 30 µL dung dịch chứa tơ nấm lên vết thương tạo trái xoài Sau trái xồi cho vào túi vơ trùng với thấm nước cất vô trùng để tạo độ ẩm Mẫu xoài đối chứng thực tương tự sử dụng mơi trường PDB Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với nghiệm thức, ba lần lặp lại cho nghiệm thức lặp lại trái xoài xử lý với nấm bệnh Các nghiệm thức bao gồm: (i) NT1: Đối chứng; (ii) NT2: Xoài cát + CT2; (iii) NT3: Xoài cát + CT3.1; (iv) NT4: Xoài cát + CT6; (v) NT5: Xoài cát + ĐT Xoài chủng bệnh ủ nhiệt độ phòng điều kiện tối, ghi nhận thời gian xuất bệnh, xác định đường kính vết bệnh, xác định tỉ lệ bệnh trái xoài sau ngày chủng bệnh (NCB) Tỉ lệ bệnh tính theo cơng thức: Tỉ lệ bệnh (%) = (tổng số vết bệnh/tổng số vết thương xử lý) x 100 2.2.2 Hiệu kháng nấm tinh dầu phương pháp khuếch tán đĩa thạch Chuẩn bị nguồn nấm bệnh: bốn dịng nấm bệnh ni mơi trường PDA nấm ngày tuổi tiến hành cắt khối agar (đường kính mm) chứa chóp tơ nấm sử dụng cho thí nghiệm Tinh dầu vỏ cam tinh dầu vỏ bưởi pha loãng với DMSO để nồng độ 250, 500 1000 µL/mL Thuốc kháng nấm Validan % (Tập đoàn Lộc Trời) với hoạt chất validamycin A % nghiên cứu có tác dụng ức chế nấm bệnh [13] pha lỗng nước cất vơ trùng theo khuyến cáo sử dụng mẫu đối chứng dương Dung mơi hịa tan tinh dầu DMSO sử dụng làm đối chứng âm Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm thực theo phương pháp Sharma cs (2006) [14] có hiệu chỉnh sau: đĩa Petri (đường kính 90 mm) tiến hành tạo giếng thạch với đường kính mm/giếng giếng/đĩa Các giếng tạo cách mép đĩa Petri khoảng 15 mm Ở nồng độ tinh dầu khác nhau, giếng cho vào 30 µL tinh dầu đặt khối nấm bệnh tâm đĩa Petri cho tinh dầu mẫu đối chứng thực tương tự sử dụng 30 µL DMSO cho đối chứng âm 30 µL validan % cho đối chứng dương Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với hai nhân tố loại tinh dầu (tinh dầu vỏ cam, vỏ bưởi phối trộn tinh dầu cam bưởi) (A) nồng độ tinh dầu (250, 500 1.000 µL/mL) (B) với lần lặp lại cho nghiệm thức tương đương với đĩa Petri, nghiệm thức đối chứng cấy nấm bệnh Các đĩa Petri sau ủ nhiệt độ phịng, điều kiện tối thời gian 24 Khả ức chế phát triển tơ nấm xác định theo công thức Pandey cs (1982) [15]: Phần trăm ức chế (%) = 𝑑𝑐−𝑑𝑡 𝑑𝑐 𝑥 100 37 Trần Thị Thanh Trúc cs đó: Dc: Đường kính nấm phát triển mẫu đối chứng âm (mm), Dt: Đường kính nấm nghiệm thức có chứa tinh dầu mẫu đối chứng dương (mm) 2.2.3 Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ gây chết tối thiểu (MLC) tinh dầu với nấm B dothidea CT2 Từ kết kháng nấm tinh dầu thí nghiệm khuếch tán đĩa thạch, dòng nấm B dothidea CT2 gây bệnh cho xoài nặng chọn lại để thực khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ gây chết tối thiểu (MLC) tinh dầu nấm bệnh Nấm nuôi môi trường PDA sau ngày sử dụng cho thí nghiệm Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với tinh dầu cam, tinh dầu bưởi phối trộn loại tinh dầu Thí nghiệm thực theo phương pháp Ranasinghe cs (2002) [16] có chỉnh sửa tiến hành sau: + Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Tinh dầu pha loãng để đạt nồng độ cuối môi trường 0, 100, 150, 200, 250, 300, 350 µL/mL, hút 10 mL tinh dầu pha lỗng vào ống falcon 50 mL tiến hành cho khối agar (đường kính mm) chứa nấm bệnh vào ống falcon Nghiệm thức đối chứng sử dụng PDB thay cho tinh dầu (đối chứng âm), đối chứng dương sử dụng thuốc diệt nấm validan nghiệm thức đối chứng âm sử dụng Tween 80 Mẫu đặt máy lắc nhiệt độ phòng với tốc độ 140 vòng/phút ủ ngày Tại thời điểm kết thúc thí nghiệm, tản sợi nấm thu vào giấy lọc whatman (đường kính lỗ lọc 45 µm) cân trước sấy 105 oC thời gian 48 Sau xác định sinh khối khơ nấm Nồng độ MIC xác định nồng độ mà tinh dầu làm cho sinh khối nấm giảm so với nghiệm thức đối chứng + Nồng độ gây chết tối thiểu (MLC): Tinh dầu pha lỗng mơi trường PDB để đạt dãy nồng độ 0, 450, 500, 550, 600 650 µL/mL, hút 10 mL mơi trường nồng độ tinh dầu cho vào ống falcon 50 mL tiến hành cho khối agar chứa tơ nấm chuẩn bị vào ống li tâm 50 mL Các ống li tâm lắc 24 với tốc độ 140 vòng/phút Sau 24 ủ lắc, chuyển khối agar chứa nấm từ môi trường lỏng lên đĩa PDA để quan sát phát triển nấm B dothidea thời gian 72 Chỉ tiêu đánh giá: Phần trăm ức chế phát triển nấm đối chứng tính tốn theo cơng thức Baratta cs (1998) [17]: Phần trăm ức chế (%) = 𝐶−𝑇 𝐶 𝑥 100 đó: C khối lượng tơ nấm đường kính tản nấm PDA mẫu đối chứng; T khối lượng tơ nấm đường kính tản nấm PDA nghiệm thức tinh dầu, Tween 80 hay validan 2.2.4 Khảo sát hiệu phòng trừ nấm B dothidea CT2 tinh dầu lên xoài giai đoạn tồn trữ Chuẩn bị vật liệu: Trái xoài cát chu chuẩn bị mơ tả nội dung thí nghiệm Mục 2.2.1 Ba loại tinh dầu pha loãng với nồng độ 500 µL/mL Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với lần lặp lại cho nghiệm thức Cho 30 µL dung dịch huyền phù nấm B dothidea CT2 thời điểm trước, sau xử lý tinh dầu 24 Mẫu xoài đối chứng xử lý tương tự chủng với 30 µL mơi trường PDB vết thương nhân tạo Xoài ủ nhiệt độ 38 Hoạt tính kháng nấm tinh dầu vỏ cam vỏ bưởi nấm Botryosphaeria dothiea… phòng điều kiện tối theo dõi thời gian xuất bệnh, ghi nhận màu sắc trái xoài sau ngày chủng bệnh, đo đường kính vết bệnh, tỷ lệ bệnh hiệu giảm bệnh Hiệu giảm bệnh tính theo cơng thức Ahmed cs (1999) [18]: Hiệu giảm bệnh (%) = [(C-T)] x 100)/C đó: C: Đường kính vết bệnh lớn nghiệm thức đối chứng, T: Đường kính vết bệnh lớn tương ứng nghiệm thức xử lý 2.2.5 Thống kê phân tích số liệu Kết xử lý phần mềm Excel, thống kê phần mềm SPSS 20, phân tích ANOVA với độ tin cậy 95 %, so sánh trung bình phương pháp kiểm định Duncan KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khả lây bệnh nhân tạo nấm B dothidea điều kiện phịng thí nghiệm Kết lây bệnh cách tạo vết thương cho thấy trái xồi có dấu hiệu bệnh ngày sau chủng bệnh (NSKCB) biểu rõ thời điểm NSKCB nhân tạo vị trí có vết thương Các vết bệnh có hình trịn, khơ, có màu nâu đen đến đen, lõm xuống lan xung quanh, thịt bắt đầu nhũn Tại thời điểm NSKCB bốn dịng nấm có mức độ biểu bệnh khác nhau, đường kính vết bệnh từ 14 - 26,25 mm/vết bệnh (Hình 2; Bảng 2) Thịt trái vị trí vết bệnh ban đầu bị chai sượng, bên thịt có sọc đen chạy dọc theo trái Vùng vỏ quanh vết bệnh bị úng sậm màu, sau lan rộng thành vùng đen trịn, cuối trái bị thối hoàn toàn Kết phù hợp với mô tả Phillips cs (2013) [11] bệnh thối trái B dothidea gây Điều cho thấy sau thử lại độc tính gây bệnh dịng nấm có khả gây bệnh xồi khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (Bảng 1) Bảng Số vết bệnh đường kính vết bệnh xồi nấm B dothidea gây Tỷ lệ bệnh (%) Đường kính vết bệnh (mm) B dothidea CT2 100 26,25a B dothidea CT3.1 100 21,48ab B dothidea CT6 100 19,67ab B dothidea ĐT 100 14,0b 0,0c Chủng nấm B dothidea Đối chứng F CV (%) * 8,4 Chú thích: Các chữ theo sau số liệu cột giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với phép kiểm định Duncan, mức ý nghĩa 95 %.*: Khác biệt mức ý nghĩa % 39 Trần Thị Thanh Trúc cs Hình Biểu bệnh xoài sau năm ngày chủng bệnh ĐC: Nghiệm thức đối chứng sử dụng môi trường PDB; CT2, CT3.1, CT6 ĐT: Các dòng nấm Botryosphaeria dothidea với ký hiệu tương ứng 3.2 Hiệu ức chế tinh dầu nấm B dothidea phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kết cho thấy tinh dầu bưởi cho hiệu ức chế phát triển nấm B dothide CT2, B dothide CT3.1 B dothide ĐT đạt cao tinh dầu phối trộn cam bưởi có hiệu ức chế B dothidea CT2 đạt thấp khác biệt có ý nghĩa thống kê so với loại tinh dầu lại (p