ÐẠI HỌC ÐÀ NẴNG TRƯỜNG ÐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐINH THỊ MỸ NHUNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalist L ) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Mã số 8420114[.]
ÐẠI HỌC ÐÀ NẴNG TRƯỜNG ÐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐINH THỊ MỸ NHUNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalist L.) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Đà Nẵng, Năm 2022 Cơng trình hồn thành TRƯỜNG ÐẠI HỌC SƯ PHẠM Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Châu Tuấn Phản biện 1: TS Bùi Thị Thơ Phản biện 2: TS Vũ Thị Bích Hậu Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Sinh học thực nghiệm họp Trường Đại học Sư phạm vào ngày 25 tháng 06 năm 2022 Có thể tìm luận văn tại: Thư viện Trường Đại học Sư phạm – ĐHĐN Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – ĐHĐN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hiện nay, nhu cầu thị trường thuốc cảnh gia tăng Người tiêu dùng hướng đến sản phẩm có giá trị dinh dưỡng, dược liệu cao để nâng cao sức khỏe Bên cạnh có giá trị làm thuốc, cảnh có mùi hương thơm, tạo cảm giác thoải mái cho người sử dụng ưa chuộng Cây hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) lồi thực vật có hoa thuộc họ Hoa mơi, có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải Đây loại dùng thường xuyên cảnh quan ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm (Mehrabani cs, 2016) Khi trồng, tỏa mùi hương thơm ngát, dễ chịu, khuếch tán rộng khơng khí Mùi hương hương thảo giúp người có tinh thần thoải mái, giải tỏa căng thẳng Ngồi ra, cịn sử dụng sản xuất nước hoa, dược liệu loại gia vị, chất chống oxy hóa chế biến thực phẩm (Dellacassa cs, 1999; Porte cs, 2000) Tinh dầu hương thảo hỗ trợ tăng cường tuần hồn máu, giúp máu lưu thơng tốt cải thiện trí nhớ Tại Việt Nam, hương thảo loài nhập nội trồng số tỉnh miền Trung miền Nam Nguồn giống trồng Việt Nam chủ yếu từ hạt, tỉ lệ nảy mầm thấp (10 - 20%) (Kiuru cs, 2015) phải nhập nên giá thành cao Bên cạnh đó, giống hương thảo sản xuất giâm cành (Mehrabani cs, 2016) Tuy nhiên, giâm cành hương thảo cho hệ số nhân giống thấp, số lượng giống giống có chất lượng khơng cao Vì vấn đề cần thiết đặt phải tìm phương thức sản xuất giống hương thảo hữu hiệu để sản xuất hương thảo quy mô lớn nhằm đáp ứng nhu cầu ngày cao nguồn dược phẩm, hương liệu cảnh từ loài Việc ứng dụng tiến khoa học kĩ thuật nhằm trì đa dạng phát triển bền vững loài thực từ nhiều năm nước Công nghệ sinh học thực vật công cụ quan trọng nhân giống phát triển nhiều loài trồng có giá trị kinh tế cao Cơng nghệ ni cấy mô tế bào thực vật xem phương thức có tiềm để chọn lựa, nhân nhanh, bảo tồn phát triển loại trồng có giá trị Việt Nam.Trong năm qua, nhu cầu hương thảo sử dụng dược liệu cảnh ngày cao, nhiên việc nghiên cứu để sản xuất giống chưa quan tâm mức Xuất phát từ sở đây, tiến hành thực đề tài: Nghiên cứu sản xuất giống hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) kỹ thuật nuôi cấy mô Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu tổng quát Xây dựng quy trình sản xuất giống hương thảo ni cấy mơ với hệ số nhân cao, chất lượng giống tốt 2.2 Mục tiêu cụ thể - Xác định loại nồng độ chất ĐHST thích hợp cho nhân nhanh chồi, tạo rễ in vitro hương thảo - Xác định điều kiện thích hợp để ươm trồng, tạo giống hương thảo nuôi cấy mô vườn ươm Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học - Kết nghiên cứu đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học sản xuất giống hương thảo nuôi cấy mơ, góp phần làm phong phú sở liệu kĩ thuật nhân giống để phát triển dược liệu cảnh - Là nguồn tài liệu tham khảo có giá trị cho cơng tác giảng dạy, học tập nghiên cứu khoa học lĩnh vực công nghệ sinh học, sinh học, nông nghiệp 3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Kết nghiên cứu đề tài sở để chủ động sản xuất nhanh, liên tục giống hương thảo có chất lượng tốt, giá thành rẻ - Kết nghiên cứu sở cho việc chủ động mở rộng sản xuất hương thảo tự nhiên, đáp ứng kịp thời đầy đủ yêu cầu phát triển sản phẩm làm thuốc, thực phẩm trang trí Việt Nam Bố cục đề tài Luận văn gồm chương: Chương Tổng quan tài liệu Chương Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu Chương Kết nghiên cứu thảo luận Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu hương thảo 1.1.1 Đặc điểm sinh học hương thảo 1.1.2 Giá trị sử dụng hương thảo 1.1.3 Thành phần hóa học có hoạt tính dược học hương thảo 1.2 Nghiên cứu nhân giống in vitro thực vật 1.2.1 Cở sở khoa học nhân giống in vitro 1.2.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro 1.2.3 Ưu điểm hạn chế nhân giống in vitro 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nhân giống in vitro 1.3 Tình hình nghiên cứu hương thảo 1.3.1 Nghiên cứu Việt Nam 1.3.2 Nghiên cứu Thế Giới Chương ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) thuộc họ Hoa môi - Nguyên liệu nghiên cứu: Đoạn thân chồi hương thảo in vitro nảy mầm từ hạt, cung cấp phịng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật, khoa Sinh - Môi trường, Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng 2.2 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu nhân giống in vitro hương thảo Phòng thí nghiệm Ni cấy mơ tế bào thực vật, khoa Sinh - Môi trường, Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng Nghiên cứu ươm trồng hương thảo in vitro để tạo giống vườn ươm Bán đảo Sơn Trà - Đà Nẵng - Thời gian thực hiện: từ 7/2021 đến 6/2022 2.3 Nội dung nghiên cứu + Nghiên cứu hồn thiện quy trình nhân giống in vitro hương thảo điều kiện phòng thí nghiệm - Nghiên cứu ảnh hưởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi in vitro - Nghiên cứu ảnh hưởng chất ĐHST đến khả tạo rễ in vitro, hình thành hồn chỉnh + Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất giống hương thảo điều kiện vườn ươm Đà Nẵng - Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện ươm trồng đến khả sống sót in vitro vườn ươm - Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện ươm trồng đến khả sinh trưởng in vitro vườn ươm 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp nhân chồi in vitro hương thảo từ đoạn thân Hạt sau khử trùng nuôi cấy môi trường MS để hạt nảy mầm, tạo in vitro Sau tuần nuôi cấy, in vitro nảy mầm từ hạt sử dụng làm nguyên liệu để tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in vitro Đoạn thân có mắt (dài 0,5 cm) in vitro (nảy mầm từ hạt) ni cấy mơi trường MS nhân chồi có 3% sucrose; 0,8% agar; có bổ sung chất ĐHST khác nhau: BAP (0,25 – 2,0 mg/L); KIN (0,25 – 2,0 mg/L); TDZ (0,25 – 2,0 mg/L); phối hợp BAP (0,5 – 2,0 mg/L ) 0,5 mg/L NAA Đánh giá ảnh hưởng chất ĐHST đến khả tạo chồi in vitro thông qua tiêu sau: số chồi/mẫu, chiều dài chồi (cm), chất lượng chồi sau tháng nuôi cấy 2.4.2 Phương pháp nhân chồi in vitro hương thảo từ protocorm Protocorm (1,5 tháng tuổi) hình thành từ đoạn thân hương thảo sử để làm nguyên liệu nhân nhanh chồi Các protocorm tách thành khối nhỏ khoảng – mm ni cấy mơi trường MS có 3% sucrose; 0,8% agar; có bổ sung chất ĐHST khác nhau: BAP (0,5 – 2,0 mg/L); KIN (0,5 - mg/L); Đánh giá ảnh hưởng chất ĐHST đến khả phát sinh chồi in vitro từ từ protocorm thông qua: tỉ lệ protocorm tạo chồi, số chồi/protocorm sau tháng nuôi cấy 2.4.3 Phương pháp tạo rễ in vitro hương thảo Sau thời gian nuôi cấy, cụm chồi in vitro đạt yêu cầu chiều cao chuyển sang môi trường rễ Các chồi in vitro (cao khoảng 2-3 cm) nuôi cấy môi trường MS có 3% sucrose; 0,8% agar; bổ sung chất ĐHST khác nhau: IBA (0,25 – mg/L); NAA ( 0,25 – 0,75 mg/L); Đánh giá ảnh hưởng chất ĐHST đến khả tạo rễ in vitro thông qua thời gian chồi rễ, số rễ/chồi, chiều dài rễ sau tuấn nuôi cấy Tất môi trường nuôi cấy điều chỉnh pH=5,8, khử trùng 1210C, áp suất 1atm, 20 phút Các mẫu nuôi cấy in vitro đặt phịng ni có nhiệt độ 25 ± 20C; cường độ chiếu sáng 3000 lux, thời gian chiếu sáng 16 h/ngày; 2.4.4 Phương pháp tạo giống hương thảo vườn ươm Cây in vitro hoàn chỉnh, sau tuần ni cấy mơi trường rễ thích hợp (cây cao cm, rễ dài - 1,5 cm) chuyển trồng vườn ươm Bán đảo sơn Trà - Đà Nẵng điều kiện ươm trồng khác Các chai lọ chứa in vitro đặt vườn ươm khoảng thời gian khác nhau: 5, 7, 10, 15 ngày để làm thích nghi cho in vitro với điều kiện tự nhiên Sau làm thích nghi, in vitro lấy khỏi chai lọ nuôi cấy, rửa agar môi trường Để in vitro nước, tiến hành ươm trồng hương thảo in vitro điểu kiện ươm trồng khác vườn ươm: chất trồng, nước tưới, độ che sáng, dinh dưỡng - Phương pháp tạo chất trồng: Sử dụng loại chất khác như: Đất cát, xơ dừa, tro trấu, phân chuồng hoai mục Các chất xử lý với chế phẩm Tricoderma để ức chế vi sinh vật gây bệnh trước phối trộn theo công thức chất trồng khác Cây in vitro trồng công thức chất khác Sau tháng trồng, đánh giá khả sinh trưởng thông qua tỉ lệ (%) sống; chiều cao - Phương pháp tưới nước: Cây in vitro trồng chất phù hợp Nước tưới sử dụng nguồn nước tự nhiên Bán đảo Sơn trà Tưới nước theo cách tưới phun, thời gian tưới phút, theo công thức tưới: lần/ngày; lần/ngày; lần/2 ngày Sau tháng trồng, đánh giá khả sinh trưởng thông qua chiều cao cây, chất lượng - Phương pháp che sáng: Sử dụng lưới che sáng để tạo độ che sáng tư nhiên khác nhau: 30, 40, 50, 70% Cây in vitro ươm trồng độ che sáng khác nhà lưới Sau tháng trồng, đánh giá khả sinh trưởng thông qua: chiều cao cây, chất lương 2.4.5 Phương pháp xử lí số liệu Mỗi thí nghiệm bố trí lặp lại lần Số liệu thực nghiệm tính tốn phân tích thống kê Ducan’s test (p