Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Vỏ Quả Măng Cụt Xanh 6733353.Pdf

Output file i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐỖ VĂN ĐĂNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỎ QUẢ MĂNG CỤT XANH (Garcinia Mangostana L ) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2011 i[.]

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐỖ VĂN ĐĂNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỎ QUẢ MĂNG CỤT XANH (Garcinia Mangostana L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2011 i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đỗ Văn Đăng NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỎ QUẢ MĂNG CỤT XANH (Garcinia Mangostana L.) Chuyên ngành Mã số : : Hóa học hữu 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN VĂN ĐẬU Hà Nội – 2011 ii MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU i DANH MỤC HÌNH VẼ v DANH MỤC SƠ ĐỒ vi LỜI MỞ ĐẦU .1 CH ƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vài nét họ bứa (Clusiaceae) 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Một số chi họ bứa (Clusiaceae) .3 1.2 Cây măng cụt (Garcinia mangostana L.) 1.2.1 Đặc điểm thực vật 1.2.2 Nguồn gốc phân bố 1.2.3 Hóa thực vật măng cụt .6 1.2.3.1 Tinh dầu 1.2.3.2 Các axit phenolic tách từ măng cụt 1.2.3.3 Các xanthon tách từ vỏ măng cụt 1.3 Công dụng hoạt chất sinh học 13 1.3.1 Ứng dụng y học dân gian 13 1.3.2 Các hoạt tính sinh học măng cụt (Garcinia mangostana L.) .14 1.3.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa 14 1.3.2.2 Hoạt tính kháng ung thư .16 1.3.2.3 Hoạt tính chống viêm chống dị ứng 18 72 1.3.2.4 Hoạt tính chống khuẩn, chống nấm chống virut 20 1.3.2.5 Hoạt tính chống sốt rét 22 CHƢƠNG NHIỆM VỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN 23 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 2.2.1 Phƣơng pháp chiết phân tách hợp chất mẫu thực vật 23 2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách phân lập sắc ký 23 2.2.2.1 Sắc ký lớp mỏng 23 2.2.2.2 Sắc ký cột .24 2.2.2.3 Phương pháp kết tinh lại 25 2.2.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu cấu trúc (các phƣơng pháp phổ) 25 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM .26 3.1 Thiết bị hóa chất .26 3.2 Nguyên liệu thực vật 26 3.3 Điều chế phần chiết từ vỏ măng cụt xanh .26 3.4 Phân tích cặn GMD 27 3.4.1 Phân tích cặn GMD TLC 27 3.4.2 Phân tách cặn GMD CC .28 3.4.3 Hằng số vật lý kiện phổ chất phân lập đƣợc từ phần chiết điclometan ( GMD) 29 3.4.3.1 Chất D1 29 3.4.3.2 Chất D2 29 3.4.3.3 Chất D3 29 3.5 Phân tích cặn GMB 30 73 3.5.1 Phân tích cặn GMB TLC 30 3.5.2 Phân tách cặn GMB CC 30 3.5.3 Hằng số vật lý kiện phổ chất phân lập đƣợc từ phần chiết nBuOH…………………………………………………………………………….31 3.6 Thử hoạt tính sinh học 31 3.6.1 Hoạt tính chống oxi hóa DPPH .32 3.6.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng sinh 33 3.6.2.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 33 3.6.2.2 Các chủng vi sinh vật kiểm định .33 3.6.2.3 Môi trường nuôi cấy 34 3.6.2.4 Cách tiến hành .34 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Điều chế phần chiết 36 4.2 Phân tích phân tách cặn chiết diclometan (GMD) 38 4.2.1.Phân tích cặn chiết điclometan (GMD) TLC 38 4.2.2 Phân tách cặn chiết điclometan (GMD) CC 39 4.3 Phân tích phân tách cặn chiết n- BuOH 40 4.3.1 Phân tích cặn n- BuOH TLC 40 4.3.2 Phân tích cặn n- BuOH CC 41 4.4 Hằng số vật lý chất phân lập đƣợc từ phần chiết 42 4.4.1 Chất D1 42 4.4.2 Chất D2 43 4.4.3.Chất D3 43 4.4.4 Chất D4 43 74 4.5 Xác định cấu trúc chất phân lập 43 4.5.1 Chất D1 43 4.5.2 Chất D2 45 4.5.3 Chất D3 46 4.5.4 Chất D4 48 4.6 Kết thử hoạt tính kháng sinh chống oxi hóa số xanthone 51 4.6.1 Hoạt tính chống oxy hóa DPPH 51 4.6.2 Hoạt tính kháng sinh 52 KẾT LUẬN .54 HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 63 75 DANH MỤC BẢNG BIỂU TÊN BẢNG BIỂU TRANG Các xanthon tách từ vỏ măng cụt 09 STT Bảng 1.1 Bảng Bảng 4 Bảng Bảng 4.4 Bảng Hiệu suất phần chiết từ vỏ măng cụt Kết phân tích cặn chiết điclometan TLC Quá trình phân tách cặn chiết điclometan (GMD) CC Kết phân tích cặn chiết n- BuOH TLC Quá trình phân tách cặn chiết n- butanol (GMB) CC Các liệu phổ 1H- 13C NMR 36 38 39 41 41 Bảng Bảng Kết thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH 52 Bảng Kết thử hoạt tính kháng sinh 52 hợp chất (D1-4) iv 50 DANH MỤC HÌNH VẼ TÊN HÌNH VẼ STT Hình ảnh măng cụt ( Garcinia TRANG Hình 1.1 Hình 1.2 Hình Khung xanthon 08 Hình Sắc ký lớp mỏng 24 Hình 2 Sắc ký cột 25 Hình Phổ 1H- NMR D1 44 Hình Phổ 1H- NMR D3 47 Hình Phổ 1H- NMR D4 49 Mangostana L.) Hình ảnh măng cụt ( Garcinia Mangostana L.) v 05 06 DANH MỤC SƠ ĐỒ TÊN SƠ ĐỒ STT Quy trình chiết lớp chất vỏ TRANG Sơ đồ Sơ đồ Quá trình phân tách cặn GMD 40 Sơ đồ Quá trình phân tách cặn GMB 42 măng cụt xanh vi 37 LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, với phát triển khoa học công nghệ, mức sống ngƣời ngày đƣợc nâng cao Đặc biệt, lĩnh vực y – dƣợc học, từ năm đầu kỉ XIX, việc kết hợp phƣơng pháp khoa học kỹ thuật loại thực vật xuất phát từ thiên nhiên đƣa ngƣời tiến bƣớc lớn việc phát minh nhiều loại thuốc, có khả chữa nhiều bệnh đƣợc cho nan y kỉ trƣớc Xanthon khám phá mang tính tích cực ngƣời Giới khoa học tiếp tục nghiên cứu sâu xanthon lợi ích bất ngờ cho thể ngƣời khả tham gia vào nhiều vấn đề sức khỏe Trong cơng nghệ thực phẩm xanthon thành phần tốt từ trƣớc đến mà có đƣợc Nó đƣợc ví nhƣ dƣỡng chất thực vật đa lĩnh vực dinh dƣỡng Bên cạnh đó, xanthon cịn mang lại nhiều hoạt tính sinh học, bật hoạt tính chống oxy hóa Theo nhƣ nhiều nguồn thơng tin thu thập giới nhƣ nƣớc, măng cụt “mƣời siêu trái cây”, mệnh danh „‟ nữ hồng trái cây‟‟, đƣợc xếp vào nhóm thực phẩm chức năng, chứa lƣợng lớn loại xanthon Điều giải thích từ hàng nghìn năm nay, chất pha chế từ măng cụt đƣợc sử dụng rộng khắp toàn giới nhƣ phƣơng thuốc chữa bệnh hay loại thuốc bổ, có tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, giảm đau, kháng nấm, giúp hệ tiêu hóa tốt vv Gần đây, ngƣời ta khám phá khả chữa bệnh tim, tác dụng bảo vệ gan, mật, hay chống đƣợc bệnh nhƣ ung thƣ, HIV Tuy nhiên, điều đặc biệt chỗ, hoạt tính trái măng cụt xuất phát chủ yếu từ vỏ măng cụt – phần mà thƣờng loại bỏ sau lấy phần thịt Năm 2002, Ho cộng nhận garcinone E gây hiệu độc tố tế bào mạnh mẽ dịng tế bào ung thƣ biểu mơ gan Họ nghiên cứu hiệu độc tố tế bào xanthon đƣợc tách từ vỏ măng cụt nhận thấy garcinone E độc tố tốt Chính vậy, garcinone E đƣợc thử nghiệm chống lại dòng tế bào ung thƣ gan HCC36, TONG, HA22T, Hep3B, HepG2 SK-Hep-1; dòng tế bào ung thƣ phổi NCI-Hut 125, CH27 LC-1, H2891 Calu-1; dòng tế bào ung thƣ dày AZ521, NUGC-3, KATO-III AGS Garcinone E tỏ rõ phân bố lớn hiệu phụ thuộc liều lƣợng thời gian độc tố tế bào chống lại dòng tế bào ung thƣ khác nhau; ngoại trừ tế bào ung thƣ phổi CH27 LC-1, tất dòng tế bào đƣợc kiểm nghiệm bị tiêu diệt Chỉ số liều lƣợng gây chết ngƣời garcinone 50% (LD50) chống lại dòng tế bào khoảng từ 0,1–5,4 μM Hiệu chống ung thƣ garcinone E theo thứ tự nhƣ sau: SK-hep-1 > HA22T > HepG2 > Hep3B > HCC36 Năm 2003, Matsumoto cộng nghiên cứu ảnh hƣởng xanthon (α, β γ-mangostin, mangostinone, garcinone E 2-isoprenyl-1,7dihydroxyl-3-methoxy xanthon) đƣợc tách từ vỏ măng cụt với khả ức chế phát triển tế bào dòng tế bào mắc bệnh bạch cầu ngƣời HL60 Họ khảo sát hiệu độc tố tế bào 72h tính từ sau ủ bệnh với xanthon hay 40 μM Tất xanthon hiệu ức chế hoàn toàn, nhƣng α, β γmangostin hiệu hoàn toàn từ 10 μM trở Hợp chất có hàm lƣợng lớn cặn α-mangostin, chất có hoạt tính ức chế cao (IC50 10 μM) Sau này, α- mangostin đƣợc phát có hiệu dòng tế bào mắc bệnh bạch cầu khác: K562, NB4 U937 Những dòng tế bào thƣờng bị α- mangostin ức chế 5–10 μM Năm 2005, Matsumoto cộng nghiên cứu khả chống tăng trƣởng prenyl xanthon (α, β, γ-mangostin methoxyl-β- mangostin) tế bào ung thƣ ruột ngƣời DLD-1 Ngoại trừ methoxyl-β- mangostin, xanthon lại ức chế mạnh mẽ phát triển tế bào 20 μM 72h; khả chống ung thƣ chúng phụ thuộc vào số nhóm hydroxy 17 Năm 2006, Suksamrarn cộng tách đƣợc prenyl xanthon từ vỏ măng cụt (mangostenones C, D E), với 16 xanthon đƣợc biết đến trƣớc Khả gây độc tố tế bào xanthon đƣợc kiểm nghiệm chống lại dòng tế bào ung thƣ khác nhau: ung thƣ biểu bì mồm (KB), ung thƣ vú (BC-1), ung thƣ phổi (NCI-H187) Mangostenone C đƣợc chứng minh hiệu độc tố tế bào chống lại dòng tế bào này, với IC50 theo thứ tự 2,8, 3,53, 3,72 μg/mL Tuy nhiên, α-mangostin hiệu với tế bào BC-1 (IC50 0,92 μg/mL), tốt thuốc ellipticine (IC50 1,46 μg/mL); α-mangostin có hiệu độc tố tế bào chống lại tế bào KB (IC50 2,08 μg/mL); gartanin ức chế tăng trƣởng NCI-H187 (IC50 1,08 μg/mL) Năm 2007, Nakagawa cộng đánh giá hoạt tính α-mangostin thơng qua thí nghiệm với tế bào DLD-1 Kết số lƣợng tế bào quan sát đƣợc bị giảm nhờ xử lý với mangostin 20 μM Hiệu rõ rệt xử lý kết hợp mangostin 2,5 μM với 5-fluorouracil 2,5 μM (5-FU) Tóm lại, kết α-mangostin chất tƣơng tự “ ứng cử viên” việc chữa điều trị ung thƣ 1.3.2.3 Hoạt tính chống viêm chống dị ứng Có chứng khả chống viêm chống dị ứng măng cụt mẫu thí nghiệm khác nhau, ví dụ nhƣ tế bào RBL-2H3 (2002) tế bào u thần kinh đệm chuột (2002, 2004, 2006), động mạch chủ ngực loài thỏ khí quản chuột lang (1996) vài mẫu thí nghiêm loài gặm nhấm (1979, 2004) [11- 13,18,20,21,33-36, 43-48] Năm 1979, Shankaranarayan cộng tạo dẫn xuất tổng hợp từ xanthon (3-O-methyl mangostin, 3,6-di-O-methyl mangostin, mangostin triaxetat, 1-isomangostin, mangostin-3,6-di-O-(tetra axetyl)-glucosid mangostin-3,6-di-O-glucosid) từ α-mangostin, đƣợc sử dụng nghiên cứu dƣợc lý, giống nhƣ α-mangostin Khả hoạt động miệng bụng 18 (50 mg/kg) α-mangostin, 1-isomangostin mangostin triaxetat thể hoạt tính chống viêm lồi gặm nhấm, đƣợc kiểm nghiệm dùng chích qua màng phúc mô hay cho uống nơi chuột bị gây phù chân carrageenan, hay cách cấy cục bơng gịn dƣới da Các chất khơng có hiệu ứng ổn định màng tế bào Trong phần tác dụng lên hệ trung ƣơng, thấy mangostin ức chế tổng hợp COX-2, chế chống viêm Năm 2002, Nakatani cộng sử dụng dịch chiết etanol 100 %, 70 %, 40 % nƣớc, tìm thấy dung dịch etanol 40% ức chế phóng thích histamin qua trung gian IgE Dung dịch ức chế tổng hợp prostaglandin E-2 (PGE-2) Phản ứng phản qua da thụ động bị ức chế đáng kể dịch chiết 40% Tác dụng chống dị ứng dung dịch mạnh dung dịch loại ngấy (Rubus suavissimus) thƣờng dùng Nhật Gần đây, năm 2008, Chen cộng chứng minh α γmangostin ức chế hiệu trình sản xuất NO độc tố tế bào đến tế bào RAW 264,7 Số lƣợng sản xuất NO đến 25 μM đƣợc xác định liên lục, số IC50 α γ-mangostin 12,4 10,1 μM Hai hợp chất α γmangostin khử cách hiệu trình tổng hợp PGE2 (IC50 11,08 4,5 μM) Hiệu xanthon đƣợc thông qua cách xác định cảm ứng iNOS (nitric oxide synthase) enzym COX Cơ quan cảm nhận IgE gây hoạt động truyền tính trạng tín hiệu tế bào, dẫn tới giải phóng chất trung gian gây bị viêm, ví dụ nhƣ histamin Đây khả quan trọng vài giả thiết dị ứng Dựa thơng tin đó, Itoh cộng (2008) giải thích xanthon đƣợc tách từ măng cụt (α, β γ- mangostin), ngăn cản trình hạt nhỏ bạch cầu hoạt động Ag gián tiếp IgE tế bào bạch cầu RBL-2H3 chuột Các tác giả giải thích chế ức chế trình hạt nhỏ nhờ xanthon ngăn cản đƣờng chạy SYK/PLCγs/PKC 19 Tất liệu kể xanthon đƣợc tách từ măng cụt mục tiêu hợp chất chống viêm chống dị ứng 1.3.2.4 Hoạt tính chống khuẩn, chống nấm chống virut [13,18] Năm 1983, Sundaram cộng nghiên cứu hoạt tính chống vi khuẩn chống nấm α–mangostin dẫn xuất Họ nhận thấy vi khuẩn S aureus, P aeruginosa, Salmonella typhimurium Bacillus subtilis dễ bị tổn thƣơng cao xanthon này; ngƣợc lại vi khuẩn Pro-teus sp, Klebsiella sp Escherichia coli bị tổn thƣơng mức độ Về nấm, α–mangostin dẫn xuất có tác dụng ức chế mạnh mẽ với loại Epidermophyton floccosum, Alternaria solani, Mucor sp., Rhizupus sp Cunninghamella echinulata, ngƣợc lại Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Penicillium sp., Fusarium roseum Curvularia lunata bị tổn thƣơng nhẹ Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, nồng độ thấp hợp chất chống vi khuẩn gây ức chế tăng trƣởng quan sát đƣợc vi sinh vật sau giai đoạn ủ bệnh) α–mangostin 12,5 50 μg/mL vi khuẩn, μg/mL nấm Sự xếp khả kháng khuẩn kháng nấm nhƣ sau: α–mangostin > isomangostin > 3-O-metyl mangostin > 3,6-di-O-metyl mangostin Mangostin triaxetat khơng có hoạt tính Năm 1986, Mahabusarakam cộng điều tra hoạt tính chống khuẩn mangostin, gartanin, γ-mangostin, 1-isomangostin 3-isomangostin đƣợc tách từ trái măng cụt chống lại S aureus, chủng bình thƣờng lẫn chủng kháng penicillin Chỉ số MIC (μg/mL) hợp chất đƣợc xếp theo thứ tự sau: chủng bình thƣờng methicillin (3,9) > α–mangostin (15,6) > γmangostin (31,2) > 1-isomangostin (62,5) > 3-isomangostin (125) > gartanin (250); chủng kháng penicillin α–mangostin (1,56-12,5) > methicillin (1,56-12,5) > 1-isomangostin (125) > 3-isomangostin (250), γ-mangostin (250) gartanin (250) Thêm vào đó, hoạt tính mangostin, gartanin γ-mangostin 20 chống lại Candida albicans, Cryptococcus neoformans, T mentagrophytes Microsporum gypseum đƣợc kiểm nghiệm; kết có hoạt tính trung bình chống lại T mentagrophytes, Microsporum gypseum nhƣng lại khơng thể hoạt tính chống lại C albicans, C neoformans Năm 1996, Linuma cộng nghiên cứu hiệu ức chế vài xanthon, đƣợc tách từ vỏ măng cụt, chống lại tăng trƣởng S.aureus đề kháng methicillin (MRSA–methicillin resistant S.aureus) α–mangostin ức chế hiệu rõ rệt, với số MIC từ 1,57-12,5 μg/mL Năm 2003, Saksamrarn cộng nghiên cứu khả chống vi trùng lao prenyl xanthon lấy từ vỏ măng cụt Trong số chúng, α βmangostin garcinone B thể hiệu ức chế thuyết phục chống lại vi trùng lao Mycobacterium tuberculosis, với số MIC 6,25 μg/mL, ngƣợc lại, demthylcalabaxanthon trapezifolixanthon có số MIC 12,5 μg/mL, γmangostin, garcinone D, mangostanin, mangostenone A tovophyllin B có số MIC 25 μg/mL Các xanthon có khả chống lại vi trùng lao thấp mangostenol mangostanol có số MIC lần lƣợt 100 μg/mL 200 μg/mL Năm 1994, Phongpaichit cộng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn α γ-mangostin hỗn hợp mangostin 49 chủng MRSA, đƣợc lấy từ bệnh nhân bệnh viện Songklanagarind; 50 chủng MRSA, 13 chủng Enterococcus spp, đƣợc lấy từ bệnh nhân bệnh viện Maha-raj Nakorn Chiang Mai Hỗn hợp mangostin có hiệu thuyết phục chống lại MRSA (MIC 1,48 μg/mL), α γ-mangostin lần lƣợt 3,12 2,26 μg/mL Đối với tất chủng Enterococcus spp, mangostin ức chế tăng trƣởng chúng μg/mL Vài sản phẩm tự nhiên đƣợc xác định nhờ vào khả ức chế trạng thái khác chu kỳ virut làm khả miễn dịch ngƣời (HIV-1) Năm 1996, Chen cộng cặn chiết etanol trái măng cụt ức chế hiệu với HIV-protease Hai xanthon đƣợc tách từ cặn 21 α β-mangostin, theo thứ tự thể số IC50 5,12 ± 0,41 4,81 ± 0,32 μM Tính chất ức chế khơng cạnh tranh Gần đây, năm 2007, Rassameemasmaung cộng nghiên cứu hiệu loại thuốc súc miệng từ dƣợc thảo có chứa thành phần chiết từ vỏ măng cụt, thông qua thử nghiệm 60 ngƣời, đƣợc chẩn đoán mắc phải bệnh viêm lợi kinh niên mức độ nhẹ nhàng hay vừa phải Kết có tác dụng chống lại hợp chất chứa lƣu huỳnh dễ bay hơi, bệnh bựa chảy máu Chính vậy, phần chiết từ vỏ măng cụt đƣợc sử dụng nhƣ tác nhân bổ sung việc điều trị thở thối 1.3.2.5 Hoạt tính chống sốt rét [13] Một vài xanthon đƣợc tách từ măng cụt hoạt tính chống sốt rét chống lại plasmodium falciparum phịng thí nghiệm β-mangostin αmangostin thể giá trị IC50 theo thứ tự lần lƣợt 5,1 μM, mangiferina - xanthon glucosid, lại thể số IC50 cao 50 μM (2005) Mặt khác Mahabusarakam cộng ( 2006) lại nhận α – mangostin lại thể số IC50 17 μM chống lại P.falciparum 22 CHƯƠNG NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN 1- Xây dựng quy trình chiết thích hợp để điều chế phần chiết chứa hợp chất hữu thiên nhiên từ vỏ măng cụt xanh 2- Nghiên cứu quy trình phân tích phân tách phần chiết nhận đƣợc từ vỏ măng cụt xanh 3- Phân lập hợp chất phần chiết nhận đƣợc 4- Xác định cấu trúc hợp chất đƣợc phân lập 5- Thử hoạt tính kháng sinh chống oxi hóa số hợp chất phân lập đƣợc 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp chiết phân tách hợp chất mẫu thực vật Ngâm chiết mẫu thực vật phơi khô EtOH Để tăng hiệu suất chiết tiến hành ngâm chiết nhiều lần, lần ngâm ngày Phần chiết EtOH sau đƣợc phân bố H2O dung môi hữu khác nhằm làm giàu lớp chất theo độ phân cực tăng dần 2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách phân lập sắc ký 2.2.2.1 Sắc ký lớp mỏng Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi ngành khoa học hoá học, sinh học, hố dƣợc với nhiều mục đích khác đặc tính ƣu việt nó: độ nhạy cao, lƣợng mẫu phân tích nhỏ (thƣờng từ đến 100x10-6 g), tốc độ phân tích nhanh, kỹ thuật phân tích dễ thực Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) đƣợc dùng để phân tích định tính hay định lƣợng kiểm tra độ tinh khiết hợp chất nhƣ hỗ trợ 23 cho phƣơng pháp sắc ký cột để xác định kiểm sốt điều kiện phân tách Đối với sắc kí mỏng, việc lựa chọn dung môi hay hệ dung mơi chạy sắc kí cho Rf tốt quan trọng Cụ thể với yêu cầu khảo sát hỗn hợp chọn dung mơi cho vệt trịn, sắc nét, rải tồn có Rf xa tốt b Rf  a a b Hình 2.1 Sắc ký lớp mỏng 2.2.2.2 Sắc ký cột Sắc ký cột thƣờng (CC) đƣợc thực dƣới trọng lực dung môi silica gel theo chế sắc ký hấp phụ đƣợc sử dụng để phân tách phần chiết, phân lập tinh chế hợp chất Sắc ký cột nhanh (FC) đƣợc thực dƣới áp lực khơng khí nén để dung mơi rửa giải qua cột nhanh Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) đƣợc thực để tinh chế lƣợng nhỏ mẫu chất 24 Hình 2.2 Sắc ký cột 2.2.2.3 Phương pháp kết tinh lại Phƣơng pháp đƣợc sử dụng để tách làm chất rắn Việc làm chất rắn kết tinh dựa khác độ tan hợp chất mục tiêu tạp chất dung môi hệ dung môi chọn 2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc (các phương pháp phổ) Các phƣơng pháp phổ phƣơng pháp đại hữu hiệu để xác định cấu trúc hợp chất hữu bao gồm: - Phổ khối lƣợng va chạm điện tử (EI-MS); - Phổ khối lƣợng phun bụi điện tử (ESI-MS); - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chƣơng trình DEPT; 25 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 3.1 Thiết bị hóa chất Sắc ký lớp mỏng (TLC) đƣợc thực mỏng tráng sẵn silica gel Merck (Darmstadt, CHLB Đức) DC-Alufolien 60 F254 có chiều dày 0,2 mm nhôm Sắc ký cột thƣờng (CC), sắ c ký cô ̣t nhanh (FC) sắc ký cột tinh chế (MiniC) đƣợc thực silica gel Merck (Darm-Stadt, CHLB Đƣ́c) cỡ ̣t 63-200 μm, 63-100 μm và 40-63 μm Phổ khối lƣợng va chạm điện tử (EI-MS) đƣợc ghi thiết bị LC-MSOrbitrap-XL (Thermo Scientific) Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chƣơng trình DEPT phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR) HMBC đƣợc ghi thiết bị Bruker AV 500 spectrometer Độ chuyển dịch hóa học (δ) đƣợc biểu diễn theo ppm Tetrametylsilan (TMS) chất chuẩn nội zero 3.2 Nguyên liệu thực vật Mẫu nghiên cứu vỏ măng cụt có nguồn gốc từ miền Nam, đƣợc thu gom vào tháng năm 2010 Sau bỏ cuống, tách bỏ phần thịt quả, vỏ măng cụt đƣợc rửa sạch, đem phơi khô nhiệt độ thƣờng, bóng râm Sau đó, mẫu khơ đƣợc đem nghiền thành dạng bột nhỏ, thu đƣợc 2,0 kg bột 3.3 Điều chế phần chiết từ vỏ măng cụt xanh Phần tổng quan thành phần hóa học măng cụt nói chung cho thấy vỏ măng cụt chủ yếu có chứa xanthon, hợp chất có độ phân cực khá, việc chiết chủ yếu đƣợc thực dung mơi có độ phân cực trung bình trở lên nhƣ điclometan,n-butanol, etyl axetat, axeton 26 2,0 kg vỏ măng cụt đƣợc ngâm etanol 96 % nhiệt độ phịng ngày Sau đó, lọc lấy dịch chiết, bã nguyên liệu lại đƣợc ngâm tiếp với etanol Quá trình đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ lần Dịch chiết sau lần đƣợc gom lại, đem cất loại dung môi dƣới áp suất thấp nhiệt độ khoảng 40 – 500C đến thu đƣợc khối sệt Pha khối sệt với nƣớc cất theo tỉ lệ 1:1 ( khoảng 0,3 l nƣớc cất), nhằm giải phóng chất phân cực khỏi dịch chiết chiết chúng dung môi theo độ phân cực tăng dần, trƣớc hết điclometan , sau đến nbutanol Dịch chiết điclometan n- butanol đƣợc xử lí nhƣ sau: làm khơ với Na2SO4, sau đem cất loại dung mơi dƣới áp suất giảm nhiệt độ 40-55 C, thu đƣợc cặc chiết dạng sệt, kí hiệu lần lƣợt GMD GMB Sơ đồ chiết hiệu suất phần chiết đƣợc trình bày chƣơng 4: Kết thảo luận 3.4 Phân tích cặn GMD 3.4.1 Phân tích cặn GMD TLC Hịa tan lƣợng nhỏ cặn diclometan etyl axetat Sau đó, dùng capilla để hút chất, chấm lên mỏng (DC-Alufolien 60 F254 dày 0,2 mm) cho vết chất cách mép dƣới 1,0 cm cách mép bên 0,5 cm Sau sử dụng qua nhiều hệ dung môi tỉ lệ khác (điclometan/n-hexan (9:1; 7:1; 5:1, v/v); etyl axetat/n-hexan; điclometan/etyl axetat; chlorofom/nhexan; ), nhận thấy hệ dung môi điclometan : axeton (22:1, v/v) n- hexan/ acetone cho tách tốt cặn điclometan Phát vết chất dƣới ánh sáng thƣờng , sau soi mỏng dƣới đèn tử ngoại UV (λ = 254 nm), cuối phun mỏng với dung dịch vanilin/H2SO4, FeCl3 hơ mỏng bếp điện để nhận biết vệt chất 27 Kết khảo sát mỏng cặn chiết chiết GMD xem chƣơng 4: Kết thảo luận 3.4.2 Phân tách cặn GMD CC Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có đƣờng kính cm, cao 80 cm, lót đáy cột miếng bơng thủy tinh cho dung dịch rửa giải Tẩm mẫu: Hòa tan 15 gam cặn điclometan etyl axetat, sau tẩm với 11.5 gam silicagel (cỡ hạt 40- 63 μm, Merck) cách trộn vào nhau, etyl axetat bay hết thu đƣợc bột mịn tơi màu vàng thẫm Nhồi cột: Tiến hành nhồi cột theo phƣơng pháp nhồi ƣớt Silicagel đƣợc khuấy ngâm dung mơi n- Hexan cho trƣơng nở Sau đó, vừa khuấy vừa đổ nhanh hỗn hợp silicagen dung mơi n- Hexan lên cột sắc kí, đồng thời mở khóa phía dƣới cho dung mơi chảy Trong q trình nhồi cột có sử dụng bóp gõ nhẹ dọc theo cột loại bỏ bọt khí cho n- Hexan chảy qua nhiều lần để cột đƣợc nén Chạy sắc kí cột: Khi dung mơi cột xuống đến cách bề mặt silicagen đƣợc nén khoảng 4cm đƣa mẫu tẩm lên cột Sau đặt miếng bơng thấm lên bề mặt chất để tránh khuếch tán ngƣợc chất tẩm Tiến hành rửa giải dung môi theo gradient, tăng dần độ phân cực: với 100 % nHexan, hỗn hợp n- Hexan : axeton theo tỉ lệ tăng dần axeton, cuối dội cột với axeton Tốc độ rửa giải cỡ khoảng 5-6 ml/phút Dung dịch rửa giải đƣợc thu vào ống nghiệm đánh số thứ tự Khảo sát phân đoạn rửa giải: Qua kiểm tra SKLM, ống nghiệm có sắc ký đồ giống đƣợc gom lại, thu đƣợc phân đoạn, kí hiệu GMD I→ VII Tiến hành rửa chất với kỹ thuật kết tinh lại, thu đƣợc chất tinh khiết phân đoạn GMD I, kí hiệu D1 28 Tiếp tục chạy sắc kí cột (với cột nhỏ hơn) phân đoạn GMD III với hệ dung môi n- hexan/acetone, tiến hành rửa chất với kỹ thuật kết tinh lại chúng tơi thu đƣợc chất tinh khiết kí hiệu D2 D3 Kết chạy sắc ký cột xem chƣơng 4: Kết thảo luận 3.4.3 Hằng số vật lý kiện phổ chất phân lập từ phần chiết điclometan ( GMD) 3.4.3.1 Chất D1 Tinh thể hình que, màu vàng tƣơi; nhiệt độ nóng chảy 167-169 0C (kết tinh lại hệ dung môi n-hexan/axeton); Rf = 0,78 (TLC, silicagel, điclometan/axeton (20:1), v/v); dƣới ánh sáng thƣờng có màu vàng nhạt, phun với vanilin/H2SO4 đặc + t0 cho màu vàng tƣơi Phổ 1H-NMR (500 MHz, Me2CO-d6, , ppm): 12.33(1H; s; OH-1); 11.30(1H; s; OH-8); 7.31(1H; d; J= 8.8 Hz; H-6); 6.62(1H; d; J= 8,8 Hz; H-7); 5.28 5.24(2H; m; H-12 H-17); 3.66(2H;d; J= 7,0 Hz; H-16); 3.45(2H; d; J= 7,0 Hz; H-11); 1.85(3H; s; H-20); 1.80(3H; s; H-14); 1.67(3H; s; H-19); 1.66(3H; s; H-15) 3.4.3.2 Chất D2 Tải FULL (80 trang): https://bit.ly/3fQM1u2 Dự phòng: fb.com/KhoTaiLieuAZ Tinh thể hình kim màu vàng, Đnc 1660- 1670C (kết tinh n-hexanaxeton); Rf 0,66 (hệ dung môi: n-hexan- etyl axetat, 7:3, v/v); phát quang màu tím dƣới ánh sáng tử ngoại; cho màu vàng đậm với thuốc thử vanilin/H2SO4+ T0 Phổ 1H- NMR (500MHz, MeOD, δ, ppm): 12.32(1H; s; OH-1); 7.37(1H; d,d; J= 1.5Hz, 8.0 Hz; H-6); 7.25(1H; t; J= 8.0 Hz; H-8); 5.3(1H; m, H12);5.24(1H; m; H- 17); 3.79(2H; d; J= 7.0 Hz; H- 16); 3.57(2H; d;J= 7.0 Hz; H11); 1.79(3H; s; H- 15); 1.65(3H; s; H- 14); 1.86(3H; s; H- 20); 1.65(3H; s; H-19) 3.4.3.3 Chất D3 29 Tinh thể hình kim, màu vàng óng, nhiệt độ nóng chảy 180-181 0C (kết tinh lại hệ dung môi metanol/nƣớc); Rf = 0,67 (TLC, silicagel, n-hexan/etyl axetat (1:1), v/v); dƣới ánh sáng thƣờng có màu vàng, phun với vanili/H2SO4 đặc + t0 cho màu vàng đậm Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD, , ppm): 6,74(1H; s; H-5); 6,28 (1H; s; H-4); 5,25(2H; m; H-12 H-17); 4,12(1H; br S; H-16); 4,11(1H; br S; H-11); 3,78(3H; s; OCH3- 7); 1,85(3H; s; H-20); 1,80(3H; s; H-15); 1,70(3H;s; H-14); 1,68 (3H; s; H-19) Phổ MS, m/z, %: 411 (M+, 40), 352 (100), 219 (15), 149 (50), 114 (40) 3.5 Phân tích cặn GMB 3.5.1 Phân tích cặn GMB TLC Dùng capilla để hút chất, chấm lên mỏng (DC-Alufolien 60 F254 dày 0,2 mm) cho vết chất cách mép dƣới 1,0 cm cách mép bên 0,5 cm Sau sử dụng qua nhiều hệ dung môi tỉ lệ khác (điclometan/axetone (9:1; 7:1; 5:1, v/v); diclometan/etylaxetat; điclometan/Metanol ), nhận thấy hệ dung môi điclometan : MeOH (9:1, v/v) cho tách tốt cặn Tải FULL (80 trang): https://bit.ly/3fQM1u2 Dự phòng: fb.com/KhoTaiLieuAZ 3.5.2 Phân tách cặn GMB CC Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có đƣờng kính cm, cao 80 cm, lót đáy cột miếng bơng thủy tinh cho dung dịch rửa giải Tẩm mẫu: Hòa tan 15 gam cặn n- BuOH MeOH, sau tẩm silicagel (cỡ hạt 40-63 μm, Merck) cách trộn vào nhau, MeOH bay hết thu đƣợc bột mịn tơi màu vàng thẫm Nhồi cột: Tiến hành nhồi cột theo phƣơng pháp nhồi ƣớt 100 gam silicagel đƣợc khuấy ngâm dung môi điclometan cho trƣơng nở 15 phút Sau đó, vừa khuấy vừa đổ nhanh hỗn hợp silicagen dung môi điclometan lên 30 cột sắc kí, đồng thời mở khóa phía dƣới cho dung mơi chảy Trong q trình nhồi cột có sử dụng bóp gõ nhẹ dọc theo cột loại bỏ bọt khí cho điclometan chảy qua nhiều lần để cột đƣợc nén Chạy sắc kí cột: Khi dung môi cột xuống đến cách bề mặt silicagen đƣợc nén khoảng 4cm đƣa mẫu tẩm lên cột Sau đặt miếng bơng thấm lên bề mặt chất để tránh khuếch tán ngƣợc chất tẩm Tiến hành rửa giải dung môi theo gradient, tăng dần độ phân cực: với 100 % điclometan, hỗn hợp điclometan : MeOH theo tỉ lệ tăng dần MeOH, cuối dội cột với MeOH Tốc độ rửa giải cỡ khoảng 5-6 ml/phút Dung dịch rửa giải đƣợc thu vào ống nghiệm đánh số thứ tự Khảo sát phân đoạn rửa giải: Qua kiểm tra SKLM, ống nghiệm có sắc ký đồ giống đƣợc gom lại, thu đƣợc phân đoạn, kí hiệu GMB I-IV Tiến hành rửa chất với kỹ thuật kết tinh lại, thu đƣợc chất tinh khiết phân đoạn GMB II, kí hiệu D4 Kết chạy sắc ký cột xem chƣơng 4: Kết thảo luận 3.5.3 Hằng số vật lý kiện phổ chất phân lập từ phần chiết n-BuOH Chất D4: Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt; màu vàng nhạt với thuốc thử Vanilin/ H2SO4 đặc, t0, màu nâu đen với FeCl3 nhiệt độ phòng Phổ 1H- NMR(500MHz, CDCl3, δ, ppm): 13.68(1H; s; OH-1); 6.83(1H; d; j= 3.6 Hz; H-4); 6.24(1H; s; H-5); 6.72(1H; d; J= 10 Hz; H-16); 5.56(1H; d; J= 10 Hz; H-17); 5.26(1H; m; J= Hz, 3.6 Hz; H-12); 4.08(2H; d; J= Hz; H-11); 3.80(3H; s; H-22); 1.83(3H; s; H-15); 1.69(3H; s; H-14); 1.46(6H; s; H-20, H-21) Phổ 13C- NMR(500 MHz, CDCl3, ppm): 182(C-9); 159.91(C- 3); 157.96(C1); 156.31(C-4a); 155.77(C-10a); 154.56(C-6,7); 142.71(C-13); 137.04(C-8); 132.13(C-2); 127.13(C-17); 123.16(C-12); 115.74(C-16); 112.25(C-8a); 104.52(C- 31 6733353 ... Để góp phần nghiên cứu thành phần hóa học vỏ măng cụt xanh nhiệm vụ đƣợc đặt ra: - Xây dựng phƣơng pháp chiết hiệu với vỏ măng cụt xanh - Khảo sát định tính phân tách chất từ vỏ măng cụt xanh -...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đỗ Văn Đăng NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỎ QUẢ MĂNG CỤT XANH (Garcinia Mangostana L.) Chuyên ngành Mã số : : Hóa học hữu... tìm hiểu hóa dƣợc trái măng cụt cần thiết, có lợi, tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu sẵn có Xuất pháp từ lý chúng tơi tiến hành nhiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học vỏ măng cụt xanh (Studying