Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Thảo quả đồng (Amomum koenigii) của Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ******************* Tạ Thị Thủy NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY THẢO QUẢ ĐỒNG (AMOMUM KOENIGII) CỦA VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ******************* Tạ Thị Thủy NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY THẢO QUẢ ĐỒNG (AMOMUM KOENIGII) CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 8440112.02 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hƣớng dẫn: PGS TS Phan Minh Giang LỜI CẢM ƠN Luận văn tốt nghiệp thực Phịng thí nghiệm Hóa học hợp chất thiên nhiên, Bộ mơn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Nghiên cứu luận văn tài trợ Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 104.012017.41 Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin bày tỏ lịng kính trọng lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Phan Minh Giang tin tưởng giao đề tài, tận tình hướng dẫn tạo điều kiện nghiên cứu thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đồng thời em gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô giáo, anh chị cao học, nghiên cứu sinh em sinh viên Phịng thí nghiệm Hóa học hợp chất thiên nhiên tạo môi trường nghiên cứu thuận lợi suốt thời gian em thực luận văn Đặc biệt xin gửi lời cám ơn em sinh viên Lê Thu Ngọc Trần Thị Quỳnh làm việc nhóm nghiên cứu Amomum koenigii Em xin chân thành cảm ơn anh chị, bạn em Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu, Bộ Y tế tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Học viên Tạ Thị Thủy năm 2019 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU TÓM TẮT Chƣơng 1: TỔNG QUAN 10 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỌ GỪNG - ZINGIBERACEAE 10 1.1.1 Họ Gừng (Zingiberaceae) 10 1.1.2 Chi Amomum 10 1.2 CÂY THẢO QUẢ ĐỒNG (Amomum koenigii J F Gmelin) 23 1.2.1 Thực vật học 25 1.2.2 Phân bố môi trƣờng sống 25 1.2.3 Công dụng Y học cổ truyền 25 Chƣơng 2: THỰC NGHIỆM 25 2.1 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1.1 Các phƣơng pháp phân tích, phân tách hỗn hợp phân lập hợp chất 25 2.1.2 Các phƣơng pháp xác định cấu trúc 28 2.1.3 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm 29 2.1.4 Thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa 30 2.2 NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 31 2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY THẢO QUẢ ĐỒNG 32 2.3.1 Điều chế phần chiết từ thân rễ 32 2.3.2 Điều chế phần chiết từ 32 2.4 PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG 33 2.4.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết n-hexan (AKRH AKFH) 33 2.4.2 Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết dichlometan (AKRD AKFD) 33 2.5 PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 33 2.5.1 Phân tách phần chiết gộp n-hexan dichlometan từ thân rễ (AKRHD) 33 2.5.2 Phân tách phần chiết n-hexan từ (AKFH) 37 2.5.3 Phân tách phần chiết dichlometan từ (AKFD) 39 2.5.4 Hằng số vật lý liệu phổ hợp chất đƣợc phân lập 39 2.5.5 Phân tích định lƣợng flavonol AKRHD7.1, AKRHD7.3.2 AKRHD7.4.2.4 RP-HPLC 43 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 45 3.2 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY THẢO QUẢ ĐỒNG 45 3.3 PHÂN TÁCH SẮC KÝ CÁC PHẦN CHIẾT 47 3.3.1 Phân tách phần chiết n-hexan dichlometan (AKRHD) từ thân rễ 47 3.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan (AKFH) dichlometan (AKFD) từ 50 3.4 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP 52 3.4.1 Các hợp chất đƣợc phân lập từ thân rễ 52 3.4.2 Các hợp chất đƣợc phân lập từ 58 3.4.3 Phân tích định lƣợng flavonol RP-HPLC 61 3.5 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP 63 3.5.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật hợp chất đƣợc phân lập 63 3.5.2 Hoạt tính chống oxi hóa hợp chất đƣợc phân lập 64 3.6 CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ CÂY THẢO QUẢ ĐỒNG 65 KẾT LUẬN 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHẦN PHỤ LỤC 75 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TLC (Thin-layer Choromatography): Sắc ký lớp mỏng CC (Column Choromatography): Sắc ký cột FC (Flash Choromatography): Sắc ký cột nhanh Mini-C (Mini-column Choromatography): Sắc ký cột tinh chế HPLC (High Performance Liquid Choromatography): Sắc ký lỏng hiệu cao RP-HPLC: (Reversed-Phase High Performance Liquid Choromatography): Sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo IR (InfraRed Spectroscopy): Phổ hồng ngoại ESI-MS (ElectroSpray Ionization Spectrometry): Phổ khối lƣợng ion hóa phun bụi điện NMR (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy): Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy): Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy): Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon-13 DEPT (Distortionless Enhancemnt by Polarization Transfer): Phổ DEPT TMS (Tetramethyl silane): Tetramethyl silan δ: Độ chuyển dịch hoá học (ppm) J: Hằng số tƣơng tác (Hz) MIC (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu DANH MỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ Hình 1: Cây Thảo đồng (Amomum koenigii J F Gmelin) 24 Hình 2: Sơ đồ hệ sắc ký cột (CC) 27 Hình 3: Sắc ký đồ phân tích HPLC phần chiết methanol thân rễ 62 Hình 4: Các hợp chất đƣợc phân lập từ Thảo đồng 67 Bảng 1: Hiệu suất điều chế phần chiết từ Thảo đồng 32 Bảng 2: Hàm lƣợng AKRHD7.1, AKRHD7.2.3, AKRHD7.4.2.4 62 phần chiết methanol thân rễ Bảng 3: Kết thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 64 Bảng 4: Hoạt tính quét gốc tự DPPH 65 Sơ đồ 1: Quy trình điều chế phần chiết từ Thảo đồng 47 Sơ đồ 2: Phân tách sắc ký phần chiết gộp n-hexan dichlometan 49 (AKRHD) Sơ đồ 3: Quy trình chiết phân lập hợp chất từ Thảo đồng 51 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ IR AKRHD2.3 Phụ lục 2: Phổ 1H-NMR AKRHD45.5.1 Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR (dãn) AKRHD45.5.1 Phụ lục 4: Phổ 13C-NMR AKRHD45.5.1 Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR AKRHD7.1 Phụ lục 6: Phổ 1H-NMR (dãn) AKRHD7.1 Phụ lục 7: Phổ 1H-NMR AKRHD7.3.2 Phụ lục 8: Phổ 1H-NMR (dãn) AKRHD7.3.2 Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR AKRHD7.4.2.4 Phụ lục 10: Phổ 1H-NMR (dãn) AKRHD7.4.2.4 Phụ lục 11: Phổ ESI-MS (+) AKRHD10.(80-90).4 Phụ lục 12: Phổ 1H-NMR AKRHD10.(80-90).4 Phụ lục 13: Phổ 1H-NMR (dãn) AKRHD10.(80-90).4 Phụ lục 14: Phổ ESI-MS (+) AKRHD10.(80-90).5 Phụ lục 15: Phổ 1H-NMR AKRHD10.(80-90).5 Phụ lục 16: Phổ 1H-NMR (dãn) AKRHD10.(80-90).5 Phụ lục 17: Phổ ESI-MS (+) AKFH1.2.1.1 Phụ lục 18: Phổ ESI-MS (-) AKFH1.2.1.1 Phụ lục 19: Phổ 1H-NMR AKFH1.2.1.1 Phụ lục 20: Phổ ESI-MS (+) AKFH1.2.1.2 Phụ lục 21: Phổ ESI-MS (-) AKFH1.2.1.2 Phụ lục 22: Phổ 1H-NMR AKFH1.2.1.2 Phụ lục 23: Phổ ESI-MS (+) AKFH1.2.1.3 Phụ lục 24: Phổ ESI-MS (-) AKFH1.2.1.3 Phụ lục 25: Phổ 1H-NMR AKFH1.2.1.3 Phụ lục 26: Phổ 1H-NMR AKFH1.4.2.1 Phụ lục 27: Phổ 1H-NMR AKFH2 Phụ lục 28: Phổ 13C-NMR AKFH2 MỞ ĐẦU Việt Nam nằm vùng nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật vơ phong phú đa đạng với 12.000 loài thực vật bậc cao Thực vật không nguồn cung cấp dinh dƣỡng cho ngƣời mà cung cấp hoạt chất nhiều thuốc Y học cổ truyền quý Trong khoa học đại sản phẩm từ thiên nhiên có vai trị quan trọng việc phát triển thuốc Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học hợp chất đƣợc phân lập sở phát hoạt chất cho nghiên cứu cấu trúc thuốc Họ Gừng (danh pháp khoa học Zingiberaceae) họ lớn thực vật có hoa với 50 chi khoảng 1600 loài phân bố chủ yếu khu vực nhiệt đới Amomum chi lớn họ Zingiberaceae mọc chủ yếu vùng nhiệt đới Đông Nam Nam Á Các lồi Amomum có nhiều ứng dụng y dƣợc gia vị nhƣ Thảo (A tsao-ko), Đậu khấu (A cardamomum), Dƣơng xuân sa (A villosum) Sa nhân (A xanthioides) Các nghiên cứu hóa học lồi Amomum Việt Nam chƣa nhiều, chủ yếu thành phần hóa học tinh dầu Các nghiên cứu thành phần hóa học phần chiết chủ yếu Phan Minh Giang cộng với số loài Amomum nhƣ A muricarpum, A maximum Cây Thảo đồng (Amomum koenigii J F Gmelin) Việt Nam chƣa đƣợc nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học Nghiên cứu đƣợc thực nhằm mục tiêu xác định thành phần hóa học đánh giá số hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, chống oxi hóa) hợp chất đƣợc phân lập từ Thảo đồng Việt Nam Nội dung nghiên cứu đƣợc đặt luận văn là: - Xây dựng quy trình chiết hợp chất từ Thảo đồng - Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết, phân tách phần chiết phân lập hợp chất phƣơng pháp sắc ký điều chế - Xác định cấu trúc hợp chất đƣợc phân lập phƣơng pháp phổ - Đánh giá số hoạt tính sinh học (kháng vi sinh vật, chống oxi hóa) số hợp chất đƣợc phân lập từ Thảo đồng TÓM TẮT Amomum koenigii J F Gmelin lồi thực vật có hoa họ Gừng (Zingiberaceae) Trên giới chi Amomum đƣợc nghiên cứu số nƣớc với mục tiêu ứng dụng khác nhau, nhƣ nghiên cứu phát triển phƣơng pháp sắc ký phân tích điều chế, phát hợp chất có hoạt tính sinh sinh học nguồn gốc thiên nhiên Trong chƣơng trình nghiên cứu hợp chất hóa học từ lồi Amomum Việt Nam nhằm mục đích xác định giá trị ứng dụng loài này, Thảo đồng (Amomum koenigii J F Gmelin) đƣợc lựa chọn làm đối tƣợng nghiên cứu luận văn Ở Việt Nam, thuốc chƣa đƣợc nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học Luận văn nhận đƣợc kết sau: Đã chiết phân bố hợp chất hữu từ thân rễ Thảo đồng theo độ phân cực tăng dần vào phần chiết n-hexan, dichlometan ethyl acetat Đã áp dụng kỹ thuật phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết xác định hệ dung mơi thích hợp cho phân tách sắc ký cột phần chiết Bằng kỹ thuật sắc ký cột điều chế phân lập đƣợc hợp chất từ phần chiết thân rễ hợp chất từ phần chiết Thảo đồng Đã xác định đƣợc cấu trúc hợp chất đƣợc phân lập phƣơng pháp phổ (NMR, MS) 5-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)eicosan-3-on, 5hydroxy-3,7,4-trimethoxyflavon, tetramethoxyflavon, β-sitosterol, 5-hydroxy-3,7,3,4- 3,5-dihydroxy-7,3,4-trimethoxyflavon, 3,5,4-trimethoxyflavon, 7-hydroxy- 3,7-dihydroxy-5,3,4-trimethoxyflavon, p- hydroquinon Các hợp chất lần đƣợc xác định có thân rễ Thảo đồng phân bố Việt Nam Hợp chất β-sitosterol, 5hydroxy-(4-hydroxyphenyl)eicosan-3-on, p-hydroquinon lần đƣợc phân lập từ Amomum koenigii Phụ lục 15: Phổ 1H-NMR AKRHD10.(80-90).5 90 Phụ lục 16: Phổ 1H-NMR (dãn) AKRHD10.(80-90).5 91 Phụ lục 17: Phổ ESI-MS (+) AKFH1.2.1.1 92 Phụ lục 18: Phổ ESI-MS (-) AKFH1.2.1.1 93 Phụ lục 19: Phổ 1H-NMR AKFH1.2.1.1 94 Phụ lục 20: Phổ ESI-MS (+) AKFH1.2.1.2 95 Phụ lục 21: Phổ ESI-MS (-) AKFH1.2.1.2 96 Phụ lục 22: Phổ 1H-NMR AKFH1.2.1.2 97 Phụ lục 23: Phổ ESI-MS (+) AKFH1.2.1.3 98 Phụ lục 24: Phổ ESI-MS (-) AKFH1.2.1.3 99 Phụ lục 25: Phổ 1H-NMR AKFH1.2.1.3 100 Phụ lục 26: Phổ 1H-NMR AKFH1.4.2.1 101 Phụ lục 27: Phổ 1H-NMR AKFH2 102 Phụ lục 28: Phổ 13C-NMR AKFH2 103 104