1 MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Việc ứng dụng kỹ thuật nhân giống invitro để sản xuất hoa cúc đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu thành công Nhưng hiện nay ở Việt Nam, nguồn gen invitro cây hoa cúc không thể[.]
MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việc ứng dụng kỹ thuật nhân giống invitro để sản xuất hoa cúc nhiều nhà khoa học nghiên cứu thành công Nhưng Việt Nam, nguồn gen invitro hoa cúc khơng thể tìm mua bên ngồi thị trường Các nhà khoa học doanh nghiệp nuôi cấy mô phải tự thu thập, đánh giá, xây dựng lưu giữ nguồn gen invitro hoa cúc địa nguồn gen nhập nội nhằm phục vụ cho mục đích bảo tồn, sử dụng khai thác bao gồm công tác nghiên cứu giảng dạy Trong công tác giảng dạy số mô đun/môn học nghề Công nghệ sinh học Bảo vệ thực vật thuộc trường Cao đẳng Nghề Đà Lạt có liên quan đến quy trình nhân giống hoa cúc Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nhân giống hoa, Nhân giống hoa cúc đa phần giáo viên giảng dạy sử dụng mẫu giả định để học sinh/sinh viên thực hành giai đoạn nhân giống hoa cúc phương pháp nuôi cấy mô Vì học sinh/sinh viên khơng tiếp cận mẫu thực tế thực hành giai đoạn nhân giống hoa cúc phương pháp nuôi cấy mơ Do đó, việc nghiên cứu xây dựng quỹ gen invitro số giống hoa cúc phổ biến Đà Lạt cần thiết để phục vụ tốt cho công tác giảng dạy giáo viên trình học tập học sinh/sinh viên Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu xây dựng quỹ gen invitro số giống hoa cúc phổ biến Đà Lạt để phục vụ cho công tác giảng dạy thực hành số mơ đun/mơn học có liên quan thuộc nghề Công nghệ sinh học Bảo vệ thực vật trường Cao đẳng Nghề Đà Lạt Khả ứng dụng phương thức chuyển giao kết nghiên cứu Khả thị trường Hướng nghiên cứu với mục đích tạo quy trình, sản phẩm phù hợp có khả đáp ứng thị trường sản xuất giống hoa cúc phương pháp nuôi cấy mô Khả ứng dụng kết nghiên cứu vào sản xuất kinh doanh Hướng nghiên cứu với mục đích tạo quy trình, sản phẩm phù hợp có khả ứng dụng lĩnh vực sản xuất giống hoa cúc phương pháp nuôi cấy mô Khả liên doanh liên kết với doanh nghiệp trình nghiên cứu Nếu đề tài thành cơng có khả triển khai áp dụng kết nghiên cứu sở sản xuất giống trồng phương pháp nuôi cấy mô Tác động lợi ích mang lại kết nghiên cứu Đối với lĩnh vực KH&CN có liên quan Hướng nghiên cứu với mục đích tạo quy trình, sản phẩm phù hợp góp phần đề xuất giải pháp lĩnh vực nghiên cứu sản xuất giống trồng phương pháp nuôi cấy mô Đối với tổ chức chủ trì sở ứng dụng kết nghiên cứu Hướng nghiên cứu với mục đích tạo quy trình, sản phẩm phù hợp ứng dụng điều kiện giảng dạy số mơ đun/mơn học có liên quan thuộc nghề Công nghệ sinh học Bảo vệ thực vật trường Cao đẳng Nghề Đà Lạt, góp phần phục vụ tốt cho cơng tác giảng dạy giáo viên trình học tập học sinh/sinh viên Tính đề tài Có khả tự thu thập, đánh giá, xây dựng lưu giữ nguồn gen invitro hoa cúc địa nguồn gen nhập nội nhằm phục vụ cho mục đích giảng dạy nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1 Sơ lược kỹ thuật nuôi cấy mô công tác nhân giống trồng 1.1.1 Tính tồn tế bào thực vật ni cấy mơ Ni cấy mơ thực vật (hay cịn gọi nuôi cấy thực vật in vitro) trình nhân giống vơ tính thực vật ống nghiệm Nuôi cấy mô thực vật phạm trù khái niệm chung cho tất kỹ thuật nuôi cấy phận khác (tế bào, mô, quan) thực vật môi trường nhân tạo điều kiện vô trùng Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa sở lý luận khoa học tính tồn khả phân hóa, phản phân hóa tế bào thực vật Cuối kỷ 19, nhà bác học người Đức Haberlangt (1902) người đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính tồn tế bào Theo ông, tế bào thể sinh vật mang tồn lượng thơng tin di truyền sinh vật đó, gặp điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành thể hoàn chỉnh Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai lịch sử nuôi cấy mô thực vật, White, người Mỹ, nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với mơi trường lỏng chứa muối khống, glucose nước chiết nấm men Sau White chứng minh thay nước chiết nấm men hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) Nicotinic axit Từ việc ni cấy đầu rễ tiến hành nhiều loại khác Năm 1958, tính tồn tế bào khẳng định cơng trình nghiên cứu Stewart cs (1958) mô rễ cà rốt Các tác giả nuôi cấy mô rễ cà rốt môi trường đặc có nước dừa thu nhận khối mô sẹo gồm tế bào nhu mô Khi chuyển mơ sẹo sang mơi trường lỏng có thành phần ni lắc nhận huyền phù gồm tế bào riêng lẽ nhóm tế bào Tiếp tục nuôi cấy môi trường lỏng, không cấy chuyển thấy hình thành rễ Đến năm 60, đồng thời Stewart (1963), Wetherell Halperin (1963) thông báo tế bào cà rốt tự nuôi cấy môi trường thạch tạo thành hàng ngàn phôi, phôi phát triển qua giai đoạn giống q trình tạo phơi bình thường cà rốt, lúc tính tồn tế bào khẳng định Từ khám phá trên, hàng loạt báo cáo tính tồn tế bào thông báo, tất quan phát triển phơi Phơi soma ghi nhận nhiều giống Atrapoda, Begonia, Citrus, Coffea, Cymbidium, Hordeum, Kalanchoe, Nicotiana, Panax, Ranumculus, Solanum, Oryza, Ngày kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta nhân giống phục tráng hàng loạt trồng có giá trị khoai tây, lan, thuốc lá, dứa, lương thực, ăn quả, Việc nhân giống trở thành công nghệ áp dụng nhiều nước giới 1.1.2 Công nghệ sinh học thực vật nhân giống trồng Công nghệ sinh học thực vật hình thành áp lực tự nhiên xã hội theo hai khuynh hướng: áp lực gia tăng suất áp lực giảm suất mùa màng Trước xu hướng đó, địi hỏi ngày phải đưa nhanh kỹ thuật vào công tác lựa chọn, nhân giống trồng Sự phát triển công nghệ sinh học thực vật theo thời gian tóm tắt sau: từ năm 1920 bắt đầu lai chéo, năm 1960 kỹ thuật gây đột biến, năm 1970 phát triển kỹ thuật cấy mô, đến năm 1980 kỹ thuật dung hợp tế bào trần từ năm 1990 đến phát triển kỹ thuật gen Nhờ kết hợp nuôi cấy mô thực vật công nghệ gen, người ta tạo thuộc tính cho trồng cách có định hướng hiệu Nhờ thuộc tính totipotent thực vật, người ta hồn tồn tái tạo nên loạt hoàn chỉnh từ tế bào mang đặc tính thời gian ngắn Nhờ kết hợp giúp cho công nghệ sinh học thực vật nói chung ni cấy mơ nói riêng có bước tiến mang lại hiệu kinh tế lớn Có thể nói cách khái quát ưu điểm công nghệ là: - Chọn lọc nhanh tính trạng mong muốn, ni cấy mơ đường nhanh giúp chọn lọc biểu tính trạng - Ni cấy mơ tạo nguồn ngun liệu thực vật tuyệt vời cho trình chuyển gen thực vật - Nuôi cấy mô kết hợp với kỹ thuật dung hợp tế bào trần đột biến tạo dịng lai khác lồi - Giúp nhân giống vơ tính với tốc độ số lượng lớn - Giúp tạo bệnh - Thực vật nuôi cấy mô nguồn nguyên liệu tốt để sản xuất chất quý hiếm, đặc biệt dược chất - Các mô đối tượng tốt hiệu nghiên cứu sinh lý, sinh hóa, di truyền, bệnh lý, sinh học phân tử - Các mô giúp trao đổi quốc tế nguồn giống thực vật dễ dàng - Các mơ cung cấp quanh năm 1.1.3 Vai trị chất điều tiết sinh trưởng nuôi cấy mô Chất điều tiết sinh trưởng hay gọi chất kích thích sinh trưởng thực vật yếu tố hóa học cần thiết cho sinh trưởng phát triển thực vật Chất điều tiết sinh trưởng thực vật chất tự nhiên sản sinh với hàm lượng nhỏ phận cá thể thực vật chất tổng hợp nhân tạo Những chất điều tiết sinh trưởng vận chuyển đến phận khác thể gây nên tác động điều tiết Vai trò điều hòa chất điều tiết sinh trưởng thực vật khởi động cho hình thành phản ứng cá biệt hay q trình sinh lý định trì hỗn q trình Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật gồm hai nhóm auxin cytokinin, ngồi gibberelin ethylen có vai trị quan trọng sinh trưởng, phát triển trao đổi chất thực vật 1.1.3.1 Các auxin Chất auxin tự nhiên tìm thấy nhiều thực vật indol axetic axit (IAA) IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào, điều khiển hình thành rễ Ngồi IAA, cịn có dẫn xuất khác naphtyl axetic axit (NAA) 2,4 - diclophenoxyl axetic axit (2,4-D) Các chất đóng vai trị quan trọng phân chia mơ q trình tạo rễ NAA, IBA, 2,4-D auxin tổng hợp, có hoạt tính mạnh auxin tự nhiên IAA Chúng có vai trò quan trọng phân chia tế bào tạo rễ Đối với rễ, auxin ức chế phát triển rễ, nồng độ cực thấp (10-9 -10-12g/ml) có tác dụng kích thích sinh trưởng rễ, vượt qua ngưỡng (10-8mg/l) lại thể tác dụng ức chế IAA kích thích rễ kìm hãm phát triển callus Ngược lại, 2,4-D kích thích hình thành callus kìm hãm hình thành rễ mơi trường ni cấy Mặc dù nhóm chất auxin hai chất lại có tính chất đối kháng NAA Went Thimann (1937) tìm Chất có tác dụng làm tăng hô hấp tế bào mô ni cấy, tăng hoạt tính enzim ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất nitơ, tăng khả tiếp nhận sử dụng đường môi trường nuôi cấy 1.1.3.2 Cytokinin Cytokinin chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng làm tăng phân chia tế bào Các cytokinin thường gặp 6-benzyl aminopurin (BAP), Kinetin Kinetin Shoog phát ngẫu nhiên chiết xuất axit nucleic Kinetin dẫn xuất base nitơ adenin BAP cytokinin tổng hợp nhân tạo có hoạt tính mạnh kinetin Kinetin BAP có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động tế bào phân sinh làm hạn chế hóa già tế bào Ngồi chất có tác dụng lên q trình trao đổi chất, trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein tăng cường hoạt động số enzim Benjamín cs (1987) cho nồng độ BAp cao (1-5ppm) kích thích phát triển chồi đỉnh đầu rễ Atropa belladona.Lat cs (1988) cho sử dụng kinetin để nhân nhanh Picrohiza kurroa phải dùng nồng độ từ 1- 5mg/l Những nghiên cứu Miller Skoog (1963) cho thấy chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với chất điều tiết sinh trưởng nội sinh Tác động phối hợp auxin cytokinin có tác dụng định đến phát triển phát sinh hình thái tế bào mơ Tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho hình thành rễ, tỷ lệ thấp kích thích q trình phát sinh chồi, tỷ lệ cân thuận lợi cho phát triển mô sẹo Barna Wakhlu (1998) tốc độ tái sinh chồi Plantago ovata tăng cao môi trường sử dụng KIN 4-6M phối hợp với NAA 0,05M Das (1958) Nitsch (1968) khẳng định tác động đồng thời auxin cytokinin kích thích mạnh mẽ tổng hợp ADN, dẫn đến trìnhmitos cảm ứng cho phân chia tế bào Skoog Miller (1957) khẳng định vai trò cytokinin trình phân chia tế bào, cụ thể cytokinin điều khiển trình chuyển pha mitos giữ cho trình diễn cách bình thường 1.S.S Các nhóm chất khác Ngồi nhóm chất điều tiết sinh trưởng kể trên, nuôi cấy in vitro cịn sử dụng số nhóm chất khác Abscicis acid, ethylen, amino acid Abscisis acid sử dụng nồng độ cao chất ức chế sinh trưởng trạng thái nghỉ bắt buộc Ethylen sinh q trình ni cấy thực vật Ethylen kìm hãm sinh trưởng tế bào đẩy nhanh lão hóa q trình ni cấy mơ Silver nitrat sử dụng để ngăn chặn ethylen hình thành q trình ni cấy mơ Amino acid nâng cao tăng trưởng tế bào tái sinh L Glutamine xem nguồn nitơ Enzim hydrolyzed protein N-Z amin Type A casein hydrolyzate sử dụng hiệu đến 2g/l Thêm vào malate, citrate, pyruvate acid vơ tương tự có hiệu mơi trường ni cấy protoplast làm giảm bớt độc hại muối amonium (Gamborg & Shyluk, 1970; Gamborg, 1986) Ngoài ra, chất chiết coconut milk hạch xanh hiệu việc cung cấp phức hợp chất dinh dưỡng vô không xác định nhân tố sinh trưởng 1.1.4 Kỹ thuật vi nhân giống (micropropagation) Trong thập kỷ qua có nhiều báo cáo kỹ thuật vi nhân giống (Arditi Krikorian, 1996; Chakrabarty cs., 2001; Rasai cs., 1995; Rout cs., 2000) Vi nhân giống nhân giống vơ tính với số lượng trồng thơng qua nuôi cấy mô in vitro Kỹ thuật nuôi cấy ứng dụng rộng rãi việc nhân giống loài cảnh loài khác toàn giới (Chu 1992; Huetteman Preece 1993; Mantell cs., 1985; Prerik, 1987) Một dạng thú vị quan trọng kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro khả tái sinh sinh sản từ nuôi cấy tế bào mô Dạng đơn giản tái sinh in vitro kích thích phát triển chồi Kỹ thuật tận dụng phát triển cá thể cho phát triển chồi đỉnh sinh trưởng chồi bên Trạng thái ngủ chồi bị phá hủy phát triển chồi non kích thích tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng (thường sử dụng cytokinin) để tái sinh chồi Các chồi sau tách cho phát triển rễ để tái sinh Sự tái sinh từ ni cấy mơ thực cách nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng, từ callus từ tế bào, chồi nách chồi nách tiền thân đỉnh sinh trưởng Ngược lại, tái sinh bất định diễn vị trí khác đốt thân, từ mầm, vùng kéo dài rễ Sự tái sinh chồi bất định thường phụ thuộc vào có mặt gen cấu trúc Nhưng tái sinh từ callus từ tế bào thường khơng có mặt gen cấu trúc Sự phát sinh quan hình thành quan riêng biệt chồi rễ Sự tái sinh phơi soma hình thành cấu trúc lưỡng cực chứa chồi rễ Hầu hết trồng tái sinh theo cách phát sinh quan phơi soma lồi hai cách Một số lồi tái sinh cách dễ dàng từ ni cấy mơ tế bào số lồi tái sinh q trình bất định Sự tái sinh từ chồi nách chồi đỉnh ứng dụng rộng rãi vi nhân giống có biến dị Ngược lại phát sinh chồi bất định tái sinh từ callus phát sinh quan phôi soma có biến dị cao tốc độ tái sinh 1.1.4.1 Các bước thực kỹ thuật vi nhân giống Trong kỹ thuật vi nhân giống có giai đoạn đặc trưng (Murashige 1974, George cs 1984) Giai đoạn 1: Lựa chọn mẫu cấy nuôi cấy khởi đầu Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi chồi mầm từ mẫu ban đầu Sự tái sinh chồi bất định kỹ thuật nhân nhanh sử dụng thường xuyên vi nhân giống (Chu 1992) Môi trường nuôi cấy điều kiện sinh trưởng giai đoạn cung cấp tối ưu để tỉ lệ nhân nhanh chồi đạt tối đa Giai đoạn 3: giai đoạn tái sinh rễ từ chồi để tái sinh Giai đoạn cần môi trường đặc trưng không, điều phụ thuộc vào kiểu gen loài Giai đoạn 4: hoàn chỉnh cho thích nghi điều kiện trồng hỗn hợp đất nhà kính để sau chuyển đồng ruộng 1.1.4.2 Các nhân tố môi trường nuôi cấy invitro Mức độ thành công kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào nuôi cấy quan liên quan đến nhiều nhân tố Nhân tố quan trọng lựa chọn thành phần dinh dưỡng chất điều tiết sinh trưởng Trong hai đến ba thập kỷ qua có nhiều báo cáo thành phần môi trường (Sheet Shillito, 1997; Perik 1987; Torres, 1989) Môi trường nuôi cấy 1.1.4.3 Có 50 cơng thức mơi trường khác sử dụng cho nuôi cấy in vitro nhiều loại khác (Gamborg cộng sự, 1976; Huang Murashige, 1977) Trong mơi trường MS sử dụng phổ biến nhất, có cải biên thay đổi thành phần vi lượng (Chand cs., 1977; Jha Sen, 1985; Rout cs., 1999; Saxena cs., 1988) Môi trường dinh dưỡng bao gồm loại muối vô cơ, nguồn cacbon, vitamin chất điều tiết sinh trưởng Một số thành phần khác bổ sung thêm nitơ vô cơ, acid vô chất chiết trồng (Gamborg, 1986) Các muối khoáng sử dụng thành phần môi trường nuôi cấy mơ tế bào Hầu hết mơi trường chứa 30mM nitơ vô kali vô Muối amonium sử sụng từ 2-20mM Ảnh hưởng muối amonium thay đổi từ ức chế đến hiệu Nồng độ Ca, SO4, photphat muối Mg từ 1-3 mM thích hợp Ngồi mơi trường cần bổ sung thêm số khống vi lượng Môi trường MS (1962) Linsmainer Skoog (1965) (LS) sử dụng rộng rãi, đặc biệt q trình tái sinh Mơi trường B5 (Gamborg cs., 1968), N6 (Chu, 1978), Nisch Nitsch (1969) (NN) dẫn xuất từ môi trường sử dụng rộng cho nhiều loại Theo Huang cs., Indra D Bhatt Uppeandra Dhar (2000), dâu tây phát triển thích hợp môi trường MS 1.1.4.4 Các chất điều tiết sinh trưởng Liều lượng chất điều tiết sinh trưởng lên môi trường nuôi cấy định lớn đến thành công nuôi cấy mô thực vật Mor Zieslin (1987), Rout cs 10 ... PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu Đặc thù đề tài nghiên cứu xây dựng quỹ gen invitro số giống hoa cúc phổ biến Đà Lạt, riêng giống cúc nhập vào Đà lạt. .. 50 Hoa, - Hoa cúc hoa lưỡng tính Hoa cúc có nhiều màu sắc khác nhau, thích nghi với thụ phấn nhờ sâu bọ Hoa nhỏ, sít ln ln tập hợp thành cụm hoa đầu, để sâu bọ thụ phấn cho nhiều hoa lúc Đế hoa. .. thống tưới phun sương, nhà kính Đa số hoa cúc Đà Lạt trồng với mục đích cắt cành Mỗi năm, Đà Lạt cung cấp cho thị trường từ 1015 triệu cành Tại Đà Lạt, có khoảng 70 giống, du nhập chủ yếu Hà Lan,