NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI TĂNG SINH VI KHUẨN Streptomyces SPP. TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI TĂNG SINH VI KHUẨN Streptomyces SPP. TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 56, Số 6B (2020): 246-253 DOI:10.22144/ctu.jvn.2020.164 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI TĂNG SINH VI KHUẨN Streptomyces SPP TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM Phạm Thị Tuyết Ngân*, Vũ Hùng Hải, Huỳnh Trường Giang Vũ Ngọc Út Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ *Người chịu trách nhiệm viết: Phạm Thị Tuyết Ngân (email: pttngan@ctu.edu.vn) Thông tin chung: Ngày nhận bài: 01/07/2020 Ngày nhận sửa: 24/09/2020 Ngày duyệt đăng: 28/12/2020 Title: Optimization of in vitro culture conditions for production of Streptomyces spp Từ khóa: Độ mặn, nguồn C N, nhiệt độ, pH, Streptomyces spp Keywords: C and N sources, pH, salinity, Streptomyces spp., temperature ABSTRACT The study was carried out to optimize in vitro culture conditions of increasing Streptomyces spp growth rate Physical and chemical conditions such as temperature, pH, salinity, C and N sources were performed on strains of Streptomyces spp including TV1.4, CM2.4 and DH3.4 in m-ISP2 C medium After that, optimal C and N sources were selected to determine the optimal concentration for the growth of the studied bacterial strains The experiments were designed in test tubes containing m-ISP2 medium with three replications Bacterial growth was assessed by measuring optical density 600nm The results showed that the optimal condition for TV1.4 strain grow best at pH 7, temperature 30℃, salinity 10‰, starch 2%, tryptone 2% CM2.4 strain grow best at pH 8, temperature 40℃, salinity 10‰, starch 1%, tryptone 1% and strain DH3.4 grow well at pH 7, temperature 35℃, salinity 10‰, starch 1% and tryptone at 2% concentration Among the studied strains, Streptomyces TV1.4 was the best selected bacteria strain TÓM TẮT Đề tài thực với mục tiêu tối ưu điều kiện nuôi tăng sinh để cải thiện tốc độ tăng trưởng chủng Streptomyces spp tiềm điều kiện in vitro Các điều kiện nhiệt độ, pH, độ mặn, nguồn C nguồn N thực chủng vi khuẩn Streptomyces spp TV1.4, CM2.4 DH3.4 mơi trường m-ISP2 C Sau đó, nguồn C N phù hợp đươc chọn để xác định nồng độ tối ưu cho phát triển chủng vi khuẩn nghiên cứu Thí nghiệm bố trí ống nghiệm chứa môi trường m-ISP2 nghiệm thức lặp lại lần Tốc độ tăng trưởng vi khuẩn đánh giá thông qua giá trị hấp thụ quang OD bước sóng 600 nm Kết cho thấy chủng TV1.4 phát triển tốt pH 7, nhiệt độ 30℃, độ mặn 10‰, starch 2%, tryptone 2% Chủng CM2.4 phát triển tốt pH 8, nhiệt độ 40℃, độ mặn 10‰, starch 1%, tryptone 1% chủng DH3.4 phát triển tốt pH 7, nhiệt độ 35℃, độ mặn 10‰, starch 1% tryptone nồng độ 2% Trong chủng nghiên cứu chủng Streptomyces TV1.4 chủng vi khuẩn tốt Trích dẫn: Phạm Thị Tuyết Ngân, Vũ Hùng Hải, Huỳnh Trường Giang Vũ Ngọc Út, 2020 Nghiên cứu số điều kiện ni tăng sinh vi khuẩn Streptomyces spp phịng thí nghiệm Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 56(6B): 246-253 246 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 56, Số 6B (2020): 246-253 tài “Nghiên cứu số điều kiện nuôi tăng sinh vi khuẩn Streptomyces spp phịng thí nghiệm” thực với mục đích xác định điều kiện ni Streptomyces spp thích hợp nhằm sản xuất chế phẩm vi sinh phục vụ nuôi trồng thủy sản GIỚI THIỆU Việt Nam quốc gia có nhiều tiềm thủy sản, lĩnh vực khai thác nuôi trồng Hiện nay, việc gia tăng mật độ nuôi để tăng sản lượng đáp ứng nhu cầu tiêu thụ, mơ hình ni thủy sản gây nên tác động xấu đến môi trường, dịch bệnh xảy thường xuyên gây thiệt hại cho người nuôi Bên cạnh tác nhân nấm, ký sinh trùng, virus … tác nhân vi khuẩn gây thiệt hại lớn đến suất mô hình ni tơm, cá Một số bệnh điển hình tác nhân vi khuẩn gây như: bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm Vibrio parahaemolyticus (Lightner et al., 2013), bệnh gan thận mủ cá tra Edwardsiella ictaluri (Crumlish et al., 2002) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu thực từ tháng năm 2019 đến tháng năm 2020 phịng thí nghiệm vi sinh vật hữu ích, mơn Thủy sinh học Ứng dụng, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ 2.2 Vật liệu nghiên cứu Ba chủng xạ khuẩn thuộc Streptomyces sp (TV1.4, CM2.4, DH3.4) có hoạt tính kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tốt sưu tập vi khuẩn hữu ích phịng thí nghiệm Vi sinh vật hữu ích, Bộ mơn Thủy sinh học Ứng dụng, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ chọn để tiến hành thí nghiệm 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp chuẩn bị sinh khối tế bào Để hạn chế tình trạng nhiễm, cải thiện chất lượng nước hạn chế dịch bệnh việc áp dụng biện pháp xử lý học, hóa học thuốc kháng sinh biện pháp sinh học áp dụng ngày rộng rãi mang lại nhiều hiệu (Verschuere et al 2000; Balcazar et al., 2007; Mohkam et al., 2016) Việc nghiên cứu chọn lọc dịng vi sinh vật hữu ích tốt ứng dụng cho nuôi trồng thủy sản mà không ảnh hưởng đến sức khỏe người đảm bảo chất lượng sản phẩm vấn đề cấp thiết Một đối tượng quan trọng sản xuất hợp chất có hoạt tính xạ khuẩn đa số cấu trúc có hoạt tính sinh học tìm thấy xạ khuẩn (Sanglier et al., 1993) Streptomyces giống lớn ngành Actinobacteria (xạ khuẩn) Có 500 lồi vi khuẩn Streptomyces tổng số 1.000 loài xạ khuẩn mô tả Giống hầu hết xạ khuẩn khác, Streptomyces vi khuẩn Gram dương, có gene với tỉ lệ GC% cao Vi khuẩn tìm thấy chủ yếu đất thảm thực vật mục nát Streptomyces sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng Streptomyces nghiên cứu rộng rãi biết đến nhiều giống xạ khuẩn Streptomyces thường sống đất có vai trị vi sinh vật phân hủy quan trọng Chủng vi sinh sản xuất nửa số thuốc kháng sinh giới sản phẩm có giá trị lớn lĩnh vực y học Streptomycetes cần nguồn carbon hữu muối khống, chúng khơng cần vitamin yếu tố tăng trưởng (Lee and Demain, 1997) Trong trình sống xạ khuẩn tiết nhiều chất có hoạt tính sinh học cao có khả kháng lại lồi vi sinh vật khác bao gồm nấm vi khuẩn (Robati and Mathivanan, 2013) Chủng vi sinh sản xuất nửa số thuốc kháng sinh giới sản phẩm có giá trị lớn lĩnh vực y tế, đề Các chủng xạ khuẩn phục hồi môi trường m-ISP2 (bổ sung 1% NaCl), ủ 37℃ lắc với vận tốc 150 vịng/phút Sau 24 ni, tiến hành ly tâm 4.000 vòng/phút 10 phút 4℃ rửa lại lần với nước muối sinh lý (0,85% NaCl) để thu sinh khối tế bào Điều chỉnh mật độ tế bào cách pha loãng dung dịch vi khuẩn từ 108 106 CFU/mL ống nghiệm chứa mL nước muối sinh lý tiệt trùng sau xác định giá trị OD600 để phục vụ cho thí nghiệm sau 2.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH nồng độ muối Mục đích thí nghiệm nhằm đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ, pH nồng độ muối (NaCl) lên sinh trưởng chủng xạ khuẩn Thí nghiệm thực dựa theo phương pháp Akond et al (2016) Ảnh hưởng nhiệt độ: Dùng micropipette hút 0,1 mL sinh khối tế bào vi khuẩn mật độ 106 CFU/mL vào ống nghiệm chứa môi trường m-ISP2 tiệt trùng Xác định giá trị OD ban đầu ống nghiệm bước sóng 600 nm (do lượng vi khuẩn bổ sung cấy truyền pha loãng xác định sau bổ sung nên khơng có khác biệt, thí nghiệm thực lặp lại lần) Các ống nghiệm ủ mốc nhiệt độ khác (20°C, 25℃, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C 50°C) máy 247 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 56, Số 6B (2020): 246-253 lắc Sau 24 giờ, xác định giá trị OD600 nghiệm thức để đánh giá sinh trưởng chủng vi khuẩn 0,25%; 0,5%; 1%; 1,5%; 2%) quy mơ phịng thí nghiệm 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Ảnh hưởng pH: Môi trường m-ISP2 sử dụng để xác định ảnh hưởng pH lên trình sinh trưởng chủng xạ khuẩn phân lập dung dịch HCl 1M NaOH 1M nghiệm thức bố trí giá trị pH 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, nghiệm thức lặp lại ba lần Dùng micropipette bơm chuyền 0,1 mL sinh khối tế bào chuẩn bị trước vào ống nghiệm chứa môi trường m-ISP2 tiệt trùng ghi nhận giá trị OD600 ban đầu Sau nghiệm thức nuôi máy lắc xác định giá trị OD600 sau 24 để đánh giá tăng trưởng chủng vi khuẩn Số liệu thống kê xử lý phần mềm SPSS 16.0 phần mềm Microsoft Excel 2013 Sự khác biệt có ý nghĩa nghiệm thức kiểm tra phép thử HSD mức ý nghĩa p