24 * Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật NGS trong sàng lọc 24 NST trước chuyển phôi đối với thụ tinh trong ống nghiệm Với kĩ thuật NGS áp dụng trên 288 phôi, số lượng phôi rối loạn NST là 36,8%, số phôi k[.]
24 * Đánh giá hiệu kỹ thuật NGS sàng lọc 24 NST ĐẶT VẤN ĐỀ trước chuyển phôi thụ tinh ống nghiệm: - Với kĩ thuật NGS áp dụng 288 phôi, số lượng phôi rối loạn NST 36,8%, số phôi không rối loạn NST 182 (63,2%) Kĩ thuật NGS tầm sốt tồn bất thường 24 NST - Kết đánh giá hiệu PGT-A-NGS IVF cho thấy PGT-A-NGS cải thiện tỷ lệ có thai lâm sàng, thai tiến triển Tỷ lệ có thai lâm sàng 43,3% nhóm PGT-A-NGS 25,0% nhóm khơng làm PGT-A KHUYẾN NGHỊ Do kĩ thuật mới, nên thời gian nghiên cứu số liệu chúng tơi thu cịn hạn chế, chúng tơi mong thời gian tới tiếp tục nghiên cứu cỡ mẫu lớn Từ đó, xác định đầy đủ yếu tố nguy lệnh bội NST đánh giá hiệu kỹ thuật NGS sàng lọc 24 NST trước chuyển phôi thụ tinh ống nghiệm Tiếp tục nghiên cứu mối liên quan hình thái phơi lệnh bội NST q trình phát triển phơi, sở chọn phơi có chất lượng tốt để chuyển phôi, nâng cao chất lượng điều trị Vơ sinh tình trạng cặp vợ chồng sau năm chung sống, quan hệ tình dục bình thường, không sử dụng biện pháp tránh thai vào giai đoạn mang thai chu kì kinh nguyệt mà người vợ khơng thể có thai Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ cặp vợ chồng vô sinh từ 6%12% Tỷ lệ Việt Nam 7,7% Trong số phương pháp điều trị vô sinh, thụ tinh ống nghiệm phương pháp điều trị hiệu Rối loạn NST noãn phôi nguyên nhân hàng đầu dẫn tới thai không làm tổ, sảy thai, thai lưu dị tật thai nhi Cùng với phát triển khoa học, đời kỹ thuật chẩn đoán di truyền trước làm tổ (Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy – PGT-A) giúp nhà khoa học chọn tương đối xác phơi khơng có rối loạn cấu trúc số lượng NST trước chuyển vào tử cung người mẹ Bên cạnh đó, đời kỹ thuật giải trình tự hệ (Next-Generation Sequencing - NGS) tạo cách mạng công nghệ sinh học, ứng dụng nghiên cứu chẩn đoán lâm sàng Ở Việt Nam, kỹ thuật giải trình tự hệ (NGS) sàng lọc 24 NST phôi bước đầu thực số trung tâm chưa có nhiều nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu lâm sàng điều trị vơ sinh Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài “Mối liên quan số yếu tố nguy tình trạng rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phơi”, nhằm mục tiêu: Mục tiêu Phân tích kết chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi kỹ thuật giải trình tự hệ phôi thụ tinh ống nghiệm Mục tiêu Đánh giá hiệu chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi kết có thai thụ tinh ống nghiệm số yếu tố liên quan đến tình trạng rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phơi 2 23 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN KẾT LUẬN Trong số phương pháp điều trị vô sinh, thụ tinh ống nghiệm phương pháp điều trị hiệu Tuy nhiên, phôi trước chuyển sàng lọc hình thái tốt, tỷ lệ có thai lâm sàng IVF thấp, từ 30-35% Rối loạn NST nỗn phơi ngun nhân hàng đầu dẫn tới thai không làm tổ, sảy thai, thai lưu dị tật thai nhi Sự đời kỹ thuật giải trình tự hệ (Next-Generation Sequencing - NGS) tạo cách mạng công nghệ sinh học, ứng dụng nghiên cứu chẩn đoán lâm sàng Sàng lọc rối loạn NST dựa kỹ thuật NGS ưu điểm aCGH giảm chi phí, có khả đánh giá tổn thương cấu trúc NST, tự động hóa cao giúp giảm thiểu sai sót q trình thực Ở Việt Nam, kỹ thuật giải trình tự hệ (NGS) sàng lọc 24 NST phôi bước đầu thực số trung tâm chưa có nhiều nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu lâm sàng điều trị vô sinh Mặt khác, thực tiễn lâm sàng đặt nhu cầu cần đánh giá yếu tố liên quan tới rối loạn NST phôi thụ tinh ống nghiệm nhằm tư vấn lựa chọn phương án điều trị phù hợp cho cặp vợ chồng điều trị vơ sinh NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN Nghiên cứu nghiên cứu sàng lọc di truyền trước chuyển phơi kỹ thuật giải trình tự hệ (NGS) thụ tinh ống nghiệm phân tích 603 phôi từ nhiều trung tâm IVF miền Bắc Nghiên cứu số yếu tố liên quan đến tình trạng rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phơi cho thấy yếu tố tiền sử sảy thai tái diễn, tiền sử IVF thất bại nhiều lần, tiền sử sảy thai liên tiếp không làm tăng tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể Trong tuổi người mẹ có liên quan thuận tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể theo phương trình Tỷ lệ bất thường số lượng NST = -0,7 + 0,01 x (tuổi mẹ) Đánh giá hiệu chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi kết có thai thụ tinh ống nghiệm thấy PGT-A – NGS có tiềm làm cải thiện tỷ lệ có thai lâm sàng tỷ lệ có thai tiến triển Từ kết nghiên cứu, nhóm nghiên cứu có số kết luận sau: Phân tích kết chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi kỹ thuật giải trình tự hệ phôi thụ tinh ống nghiệm - Tỷ lệ rối loạn NST phôi ngày tuổi thụ tinh ống nghiệm nghiên cứu 42,7% Lệch bội NST xảy tất NST với tỷ lệ khác Trong đó, cao NST số 15, 16, 21, 22 NST giới tính, gặp nhóm NST số 7, 9, 11 19 Tỷ lệ bất thường cấu trúc NST không gặp NST số 12, 20 22 quần thể nghiên cứu Đánh giá hiệu chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi kết có thai thụ tinh ống nghiệm số yếu tố liên quan đến tình trạng rối loạn NST trước chuyển phôi * Xác định số yếu tố nguy rối loạn NST phôi thụ tinh ống nghiệm: - Các yếu tố tiền sử thất bại IUI, thất bại làm tổ liên tiếp IVF, sảy thai/thai lưu loại vô sinh không liên quan đến lệch bội NST phôi - Tỷ lệ phôi mang rối loạn NST yếu tố tuổi người mẹ có mối tương quan thuận với mức độ liên hệ mức trung bình (r=0,4783) Phương trình hồi quy tuyến tính: Tỷ lệ bất thường số lượng NST = 0,7 + 0,01 x (tuổi mẹ) - Sự thay đổi tỷ lệ rối loạn NST theo độ tuổi khác NST 22 thấy tỷ lệ có thai tiến triển 18,3% nhóm làm PGT-A-NGS, tỷ lệ có CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 118 trang không kể phụ lục, bảng, biểu đồ, sơ đồ, hình 129 tài liệu tham khảo, đó: đặt vấn đề mục tiêu nghiên cứu trang, tổng quan tài liệu 39 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 20 trang, kết nghiên cứu 23 trang, bàn luận 31 trang, kết luận trang kiến nghị trang thai tiến triển nhóm khơng làm PGT-A 15,08% Như vậy, nhóm nghiên cứu có yếu tố tiên lượng xấu chứng minh như: tuổi người vợ cao, nồng độ FSH cao nhóm chứng, nồng độ AMH thấp, số nang nỗn trung bình thu ít, số phơi sống bệnh nhân thấp, số noãn phát triển thành phơi thấp, số phơi có hình thái học đạt mức tốt thấp kết tỷ lệ có thai lâm sàng phơi chuyển nhóm làm PGT-A-NGS khả quan Hiệu phương pháp hỗ trợ sinh sản phụ thuộc nhiều vào chất lượng phôi chuyển khả làm tổ chúng Các phương pháp sàng lọc hình thái khơng phản ánh chất di truyền phôi Thực tế, 42.8% phơi rối loạn NST phát triển đến giai đoạn phơi nang Vì vậy, việc sàng lọc di truyền phôi IVF cần thiết Hơn nữa, sảy thai tự phát người ghi nhận có liên quan chặt chẽ với lệnh bội NST Rối loạn NST nguyên nhân phổ biến gây vô sinh tự nhiên, PGT-A sử dụng để tối thiểu hóa phơi rối loạn NST bệnh nhân thực IVF Nhờ PGT-A xác định phôi lưỡng bội để chuyển vào buồng tử cung, tăng tỷ lệ làm tổ phơi giảm tỷ lệ sảy thai thực IVF Nhu cầu chọn lọc phơi có NST bình thường dẫn đến phát triển phương pháp PGT-A Kỹ thuật PGT-A NGS thiết lập để đáp ứng yêu cầu sàng lọc phôi bất thường số lượng cấu trúc NST CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát vô sinh 1.1.1 Định nghĩa vô sinh Theo Tổ chức Y tế giới (WHO), vơ sinh trạng thái khơng có thai sau năm chung sống vợ chồng mà không dùng biện pháp tránh thai Những trường hợp có ngun nhân vơ sinh tương đối rõ ràng việc tính thời gian khơng đặt cặp vợ chồng mà vợ 35 tuổi, sau tháng mong muốn có mà khơng có thai coi vô sinh, cần khám điều trị sớm 1.1.2 Nguyên nhân vô sinh Việc xác định tỷ lệ vơ sinh cách xác khó khăn tỷ lệ khơng nhỏ cặp vợ chồng khám chữa bệnh cở sở y tế tư nhân thầy lang Ngun nhân điều trị vơ sinh kết hợp nhiều nguyên nhân (40%), vô sinh nam (26-30%), rối loạn chức buồng trứng (21-25%), vòi tử cung (14-20%), nguyên nhân khác (tổn thương cổ tử cung, dị dạng sinh dục…) chiếm 1013%, có tới 25-28% vơ sinh không rõ nguyên nhân 1.1.3 Điều trị vô sinh Tùy thuộc ngun nhân gây vơ sinh mà có biện pháp điều trị khác nhau: điều trị nội khoa đến cấy phôi thông qua kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (Assisted Reproductive Technology-ART) Có phương pháp điều trị dành riêng cho nam giới phụ nữ số có liên quan đến hai vợ chồng Trong số đó, kỹ thuật hỗ trợ sinh sản ngày áp dụng rộng rãi giải triệt để 21 hầu hết nguyên nhân vô sinh Hỗ trợ sinh sản phương pháp điều trị bao gồm thao tác noãn, tinh trùng phơi ngồi thể nhằm giúp cặp vợ chồng có thai - Phương pháp bơm tinh trùng vào buồng tử cung (IUI) - Phương pháp thụ tinh ống nghiệm 1.2 Sự phát triển bình thường phôi trước làm tổ kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm 1.2.1 Phôi giai đoạn tiền nhân Noãn thụ tinh tạo thành hợp tử phát triển thành phôi qua nhiều giai đoạn mà khởi đầu giai đoạn tiền nhân Tiền nhân đực tiền nhân thường hình thành lúc Tiền nhân đực hình thành gần vị trí tinh trùng thâm nhập tiền nhân hình thành cực bào tương có thoi phân bào 1.2.2 Phơi giai đoạn phân chia (ngày 2-3 sau thụ tinh ống nghiệm) Sự phân chia phôi bao gồm loạt chu kỳ phân bào bào tương, kích thước phơi thay đổi khơng đáng kể Trung thể tinh trùng kiểm soát phân chia 1.2.3 Phôi dâu (ngày thứ sau thụ tinh ống nghiệm) Phơi dâu hình thành phơi giai đoạn phơi bào bắt đầu q trình kết đặc 1.2.4 Phôi nang (phôi ngày 5-6 sau thụ tinh ống nghiệm) Sau phôi kết đặc, phôi bắt đầu lớn dần tạo nang dịch bên tạo điều kiện cho phát triển để phôi bào biệt hóa thành ngun bào ni mầm phơi 1.3 Các rối loạn NST nỗn phơi trước chuyển phôi 1.3.1 Rối loạn NST Hiện tượng rối loạn NST tượng số lượng NST tế bào tăng lên giảm vài NST so với NST lưỡng bội Mất cân NST dẫn đến tình trạng phơi ngừng phát triển trước làm tổ, sẩy thai thai chết lưu 1.3.2 Phơi thể khảm Nhờ có kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm mà bất thường NST phôi người từ giai đoạn tiền làm tổ sớm phát lượng phôi đa dạng, dao động từ tới 14 phơi Trong tổng số 603 phơi, có 578 phôi khuyếch đại thành công hệ gen phân tích, bao gồm: 306 phơi có tuổi mẹ < 35 (32,06 ± 3,43) 272 phơi có tuổi mẹ ≥ 35 tuổi (39,63 ± 2,96) Mặc dù đối tượng nhóm tuổi khác có số lượng phơi khác dựa số liệu Bảng 3.5 cho thấy rõ ràng có quan hệ số lượng phôi yếu tố tuổi người mẹ số có nghĩa thống kê (p test tương quan đồng biến, r < tương quan nghịch biến 3.2 Một số yếu tố nguy rối loạn NST phôi thụ tinh ống nghiệm Bảng 3.5 Loại vơ sinh RLNST Số phơi bình Loại vơ sinh Số phôi RLNST Tổng thường 2.5 Đạo đức nghiên cứu - Nghiên cứu chấp thuận Hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh học Học Viện Quân Y số 3985/QĐ-HVQY ngày 06/4/2017 - Nghiên cứu sử dụng phần số liệu đề tài nghiên cứu cấp Nhà nước: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen hệ sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi” - Nghiên cứu chấp thuận sở thực IVF - Trước tiến hành nghiên cứu, đối tượng nghiên cứu tư vấn mục đích nghiên cứu, quyền lợi trách nhiệm tham gia nghiên cứu - Các thông tin riêng liên quan tới đối tượng nghiên cứu giữ kín - Các đối tượng nghiên cứu có nhu cầu điều trị, chẩn đốn hồn tồn tự nguyện, khơng lựa chọn giới tính sinh - Đối tượng đọc kỹ ký văn cung cấp thông tin nghiên cứu cho đối tượng nghiên cứu trước tham gia, thảo thuận tham gia nghiên cứu, phiếu đồng ý tham gia Vô sinh I 14 12 26 Vô sinh II 92 170 262 Tổng 106 182 288 RR=1,51 (CI: 1,02-2,23); p=0,07 Kết Bảng 3.5 cho thấy, vô sinh loại I có 14 phơi rối loạn NST 12 phơi bình thường; vơ sinh loại II có 92 phơi rối loạn NST 166 phơi bình thường Tuy nhiên, loại vô sinh không làm tăng nguy rối loạn NST phôi với RR=1,29, CI (0,95-1,76) với p>0,05 3.3 Đánh giá kết áp dụng kỹ thuật giải trình tự hệ (NGS) sàng lọc 24 NST trước chuyển phôi Bảng 3.6 Nồng độ số hormon Nhóm khơng làm Nhóm PGT-A PGT-A Chỉ số X ± SD X ± SD FSH (UI/l) 6,72 ± 1,63 6,09 ± 1,59 Estradiol (pg/ml) 39,58 ± 4,65 38,27 ±5,06 LH (mUI/ml) 5,27 ± 3,02 6,31 ± 3,94 Prolactin (ng/ml) 15,52 ± 3,92 16,08 ± 4,35 TSH (mUI/l) 1,66 ± 0,66 1,65 ± 0,74 AMH (ng/ml) 1,80 ± 0,64 2,46 ± 0,95 14 11 Bất thường cấu trúc NST xảy NST khơng có quy luật rõ ràng phôi IVF ngày tuổi Tuy nhiên, đột biến đoạn NST, xảy nhiều NST số 16 (12 trường hợp) sau tới NST số 3, NST số Đột biến thêm đoạn thường hay gặp NST số 1, 2, 4, NST X Xét tổng thể, NST 4, 16 NST có tỷ lệ gặp bất thường cấu trúc NST dạng thêm đoạn nhiều Trong hai NST giới tính, NST X phát nhiều bất thường cấu trúc NST Y Nhóm NST không phát bất thường cấu trúc tổng số 578 mẫu nghiên cứu NST 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22 3.1.4 Mối liên quan tuổi mẹ rối loạn nhiễm sắc thể phôi thụ tinh ống nghiệm Bảng 3.4 Tuổi người mẹ rối loạn NST Tuổi Dưới 35 35-39 Trên 40 Tổng số Số phôi n (%) n (%) n (%) n (%) 195 113 23 331 Phôi lưỡng bội (63,72) (50,90) (46,0) (57,26) 111 109 27 247 Phôi RLNST (36,28) (49,10) (54,00) (42,73) Tổng 306 222 50 578 (100) (100) (100) (100) X2=11,7; p=0,003 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tỷ lệ phơi lưỡng bội nhóm phụ nữ 35 tuổi 63,72%, nhóm 35 đến 39 tuổi 50,09%, nhóm 40 tuổi có 46%, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Tỷ lệ phơi rối loạn NST nhóm tuổi 35 36,28%, nhóm 35-39 49,1% nhóm 40 tuổi 54,0% Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p Q30) sử dụng cho bước phân tích Kết cho thấy kỹ thuật NGS cho phép phát bất thường số lượng tất 24 NST phôi người với độ tin cậy cao (confident > 75%) Đặc biệt, kỹ thuật phát bất thường liên quan tới cấu trúc NST với kích thước lớn (≥ 20 Mb) 12 13 3.1.2 Tỷ lệ rối loạn NST phôi ngày Bảng 3.1 Tỷ lệ rối loạn NST 578 mẫu nghiên cứu Số Thông số Tỷ lệ 95% khoảng phôi Sai số chuẩn NST (%) tin cậy (n) Bảng 3.3 Đặc điểm rối loạn cấu trúc NST phôi IVF ngày tuổi Rối loạn NST 247 42,7 2,1 39,7 – 47,8 Không rối loạn NST 331 57,3 2,1 53,2 – 61,3 Tổng số 578 100 Trong tổng số 578 mẫu phân tích, phát có 331 mẫu phơi không phát rối loạn NST (chiếm 57,3%) 247 mẫu phôi phát rối loạn NST (chiếm 42,7% tổng số phôi) Bảng 3.2 Đặc điểm rối loạn NST phôi ngày tuổi IVF Rối loạn NST Số phôi Tỷ lệ Chỉ rối loạn số lượng NST 173 70,0% Chỉ rối loạn cấu trúc NST 28 11,3% Phôi thể khảm 36 14,6% Rối loạn số lượng cấu trúc NST 3,2% Dạng thể khảm có kèm rối loạn số lượng NST 0,8% 247 100,0% Số phôi có rối loạn cấu trúc NST Số mẫu phơi Tỷ lệ % Rối loạn NST 33 91,67% Rối loạn NST 5,56% Rối loạn NST 2,77% Tổng số 36 100% Trong bất thường cấu trúc phát hiện, có 91,67% đơn bất thường, tức xuất loại thêm NST Do vậy, bất thường gặp phôi nghiên cứu mẫu phôi ngày tuổi, nên chiếm 6% phơi có bất thường ≥ NST khác 14 12 10 Trong 247 mẫu phôi mang rối loạn NST có 173 mẫu có bất thường số lượng, 28 mẫu có bất thường cấu trúc NST, 36 mẫu dạng thể khảm NST, mẫu vừa có bất thường cấu trúc vừa có bất thường số lượng NST mẫu phôi dạng thể khảm mang bất thường số lượng NST 2 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y Mất đoạn NST Thêm đoạn NST Biểu đồ 3.2 Tần suất rối loạn cấu trúc NST 578 mẫu phôi IVF ... Đánh giá hiệu chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi kết có thai thụ tinh ống nghiệm số yếu tố liên quan đến tình trạng rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi * Một số yếu tố liên quan đến tình. .. nghiệm số yếu tố liên quan đến tình trạng rối loạn NST trước chuyển phôi * Xác định số yếu tố nguy rối loạn NST phôi thụ tinh ống nghiệm: - Các yếu tố tiền sử thất bại IUI, thất bại làm tổ liên. .. điểm phôi rối loạn NST phôi: tỷ lệ phôi bị rối loạn NST, số lượng NST bị rối loạn, rối loạn số lượng hay rối loạn cấu trúc NST, lệch bội nhiễm sắc thể, đa bội… - Đặc điểm phát triển phôi chuyển