Kỹ thuật bẫy và theo dõi nguồn bệnh Phytophthora gây bệnh thối gốc rễ hồ tiêu ở trong đất pot

kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 Kỹ thuật bẫy và theo dõi nguồn bệnh Phytophthora gây bệnh thối gốc rễ hồ tiêu ở trong đất Baiting and monitoring propagules of pathogen causing Phytophthora foot rot of black pepper in soil Nguyễn Vĩnh Trường Đại học Nông Lâm Huế Abstract Phytophthora foot rot of black pepper (Piper nigrum L.) caused by Phytophthora capsici is severe during the rainy season in Vietnam. In this papper, a simple technique to detect and monitor propagules of pathogen in soil is described. Keywords: Phytophthora capsici, Baiting I. Đặt vấn đề Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) là cây trồng có giá trị xuất khẩu cao ở các nước như ấn Độ , Indonesia, Mã Lai, Thái Lan, Sri Lanka, Brazil, Trung Quốc và Việt Nam (Nair 2004). Việt Nam hiện nay đang dẫn đầu về sản xuất và xuất khẩu hồ tiêu trên thế giới, giá trị xuất khẩu hồ tiêu năm 2006 đã đạt đến 190 triệu đô la Mỹ, chiếm 60% thị phần của thị trường thế giới (Viet Nam News 2007). Bệnh thối gốc rễ cây hồ tiêu (còn được gọi là bệnh chết nhanh hay bệnh tiêu sầu) là bệnh hại nguy hiểm, thường làm chết dây tiêu hàng loạt, gây mất trắng hoặc làm giảm năng suất cây trồng (Nguyễn Đăng Long 1992; Truong et al. 2008). Nguyên nhân gây bệnh đã được xác định là do Phytophthora capsici gây nên (Truong et al. 2008). Bệnh gây hại phổ biến ở tất cả các vùng trồng tiêu trên phạm vi cả nước. Tuy nhiên, việc phát hiện, phân lập và theo dõi tác nhân gây bệnh từ đất là vấn đề rất khó khăn. Việc phân lập tác nhân gây bệnh từ đất bằng cách sử dụng các loại bẫy như môi trường chọn lọc Phytophthora (Erwin and Ribeiro 1996), quả táo (Holliday and Mowat 1963), hạt cây thầu dầu (Ricinis communis L.) (Sastry and Hegde 1988), lá cây Fosberg (Albizia falcataria L) và lá cây hồ tiêu (Kueh and Khew 1982) đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới. Môi trường chọn lọc PSM được sử dụng để phân lập Phytophthora từ đất đã được đề cập đến từ những năm của thập kỷ 1970. Phương pháp này được xem xét là rất hiệu quả để phân lập P. cinnamomi và P. medicaginis từ đất, tuy nhiên, phương pháp này cũng không hiệu quả đối với P. capsici. Kỹ thuật sử dụng lá tiêu để phân lập tác nhân gây bệnh thối gốc rễ hồ tiêu đã được áp dụng ở ấn Độ và Mã Lai (Anandaraj and Sarma 1990). Đây là kỹ thuật đơn giản nhưng hiệu quả trong việc theo nguồn bệnh bảo tồn trong đất. Kueh và Khew (1982) đã sử dụng kỹ thuật này để theo dõi sự bảo tồn tác nhân gây bệnh thối gốc rễ hồ tiêu ở Mã Lai. Các tác giả đã cho biết rằng mật độ nguồn nấm bệnh P. palmivora MF4 (nay được xác định lại là P. capsici) gây nên bệnh thối gốc rễ hồ tiêu được xác định cao nhất ở độ sâu lẫy mẫu đất từ 0.5– 15cm và độ pH của đất từ 6,5–7. ở Việt Nam, phân lập nguồn nấm Phytophthora từ đất nói chung và P. capsici nói riêng rất ít khi thành công, do bị hạn chế về kiến thức, kỹ thuật và trang thiết bị. Vì vậy việc phát hiện và theo dõi nguồn nấm bệnh trong đất để chủ động phòng trừ bệnh gặp rất nhiều khó khăn. Trong phạm vi nghiên cứu hiện tại, chúng tôi trình bày một phương pháp bẫy nấm hiệu quả và dễ dàng sử dụng để theo dõi nguồn bệnh P. capsici trong đất trong điều kiện của nước ta. II. Phương pháp nghiên cứu Đất sử dụng để bẫy nấm Phytophthora được thu thập ở vùng quanh gốc cây hồ tiêu bị nhiễm bệnh ở độ sâu khoảng từ 1 – 15 cm từ mặt đất. kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 Mẫu đất được thu thập từ các tỉnh trồng tiêu trọng điểm Bình Phước, Đồng Nai, Bà Rịa-Vũng Tàu và Quảng Trị. Chúng tôi so sánh hiệu quả 3 phương pháp bẫy du động bào tử (zoospore) khác nhau và đánh giá hiệu quả của từng phương pháp. 1. Sử dụng hạt lupin (Lupinus angustifolius L.): cho vào cốc nhựa 100g đất, sau đó gieo hạt lupin, sử dụng nước cất vô trùng tưới vào cốc cho đến khi đất đủ ẩm để hạt lupin nảy mầm. Hạt lupin nảy mầm có triệu chứng bệnh hoặc cây con bị héo sẽ được phấn lập trên môi trường chon lọc Phytophthora (PSM). 2. Sử dụng môi trường chọn lọc Phytophthora (PSM): khoảng 50g đất được bóp vỡ vụn, rồi cho vào một cốc nhựa (Hình bìa 2 - 1). Sau đó thêm vào 100mL nước cất. Cho vào mỗi cốc 3 miếng thạch (diện tích khoảng 1 cm 2 ) môi trường PSM được chuẩn bị theo công thức của Dhingra and Sinclair (1995). Phương pháp bẫy được tiến hành theo Nguyễn Vĩnh Trường et al. (2002). 3. Sử dụng lá tiêu: đất được chuẩn bị như cách 2, cho vào trên bề mặt nước cốc một lá tiêu bánh tẻ (lá trưởng thành, không quá già) giống tiêu Vĩnh Linh (giống nhiễm bệnh), cốc để trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm khoảng 25–30 o C và dưới điều kiện ánh sáng tán xạ. Chú ý lá tiêu phải được giữ nổi trên mặt nước trong suốt thời gian bẫy. Quan sát vết bệnh phát triển trên lá tiêu sau 2–5 ngày. Mô bệnh trên lá được cắt thành từng miếng nhỏ (kích thước khoảng 2mm 2 ) và cho vào đĩa petri (4-5 miếng/đĩa) chứa nước cất vô trùng. Kiểm tra cành sinh bọc bào tử động (sporangiosphore) và bọc bào tử động (sporangium) bằng kính hiển vi quang học sau 1–2 ngày. Mô vết bệnh cũng được phân lập trên môi trường PSM để so sánh với kết quả quan sát bằng mắt thường triệu chứng vết bệnh trên lá. Mỗi công thức thí nghiệm chúng tôi tiến hành với 50 mẫu đất được chọn ngẫu nhiên từ các mẫu đất thu thập trong quá trình điều tra bệnh. III. Kết quả và thảo luận Hầu hết các loài Phytophthora thường rất khó khăn để phân lập được từ đất, vì vậy phương pháp bẫy nấm thường được sử dụng trong phân lập. Bẫy nấm là kỹ thuật sử dụng dụng các ký chủ cảm nhiễm với các loài Phytophthora. Tuy nhiên, không có phương pháp bẫy nấm nào là hiệu quả đối với tất cả các loài. Kết quả bẫy nấm Phytophthora capsici từ đất của chúng tôi cho thấy phương pháp sử dụng lá tiêu cho hiệu quả cao hơn hẳn sử dụng hạt lupin và môi trường chọn lọc PSM (Bảng 1). Trong 3 phương pháp, hạt lupin thường được sử dụng để bẫy P. cinnamomi rất hiệu quả nhưng không hiệu quả đối với P. capsici trong thí nghiệm. Bảng 1. Hiệu quả các phương pháp bẫy nấm Phytophthora capsici từ đất Nghiệm thức Số mẫu phát hiện Tỉ lệ (%) Hạt lupin 0 0 Môi trường PSM 0 0 Sử dụng lá tiêu 38 78 Theo quan sát của chúng tôi, các mẫu đất bẫy dương tính với nguồn bệnh thối gốc rễ, lá tiêu thường xuất hiện vết bệnh đặc trưng sau 2– 5 ngày (Hình bìa 2 - 2). Vết bệnh gây ra do Phytophthora có hình tròn, có tia nấm ở ngoài rìa và vành mô bệnh dạng giọt dầu, rất dễ dàng phân biệt bằng mắt thường với các vết tổn thương gây nên bởi vi khuẩn, Pythium hoặc các loại nấm gây bệnh trong đất khác. Cành mang bọc bào tử động (sporangiosphora) và bọc bào tử động (sporangium) có thể quan sát dễ dàng bằng kính hiển vi sau khi cắt nhỏ phần vết bệnh trên lá và ủ trong nước 1–2 ngày (Hình bìa 2 - 3). Bằng cách phân lập trên môi trường PSM, sau đó tiến hành xác định loài bằng cách quan sát hình thái nấm gây bệnh và kiểm chứng lại bằng kỹ thuật ITS-RFLP, chúng tôi đã xác định được trong 38 mẫu xuất hiện vết bệnh đặc kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 trưng do Phytophthora gây nên, 36 mẫu được xác định là P. capsici, 1 mẫu P. nicotianae và 1 mẫu P. cinnamomi. Nghiên cứu gần đây của Nguyễn Vĩnh Trường et al. (2008), P. capsici đã được xác định là nguyên nhân gây bệnh thối gốc rễ hồ tiêu ở Việt Nam, P. nicotianae cũng phân lập được từ cây bị bệnh và đất nhưng vai trò của nó hiện nay chưa được xác định. P. cinnamomi dù có phổ ký chủ rất rộng nhưng không gây bệnh cho hồ tiêu. Kỹ thuật sử dụng lá tiêu bẫy như đã trình bày rất hiệu quả để phân lập tác nhân gây bệnh thối gốc rễ P. capsisi từ đất. Ngoài ra, khi so sánh các kết quả giữa quan sát vết bệnh trên lá tiêu bẫy và kiểm chứng lại bằng cách phân lập trên môi trường PSM, nhận thấy việc quan sát triệu chứng vết bệnh trên lá tiêu bẫy bằng mắt thường đủ độ tin cậy để có thể xác định được nguồn nấm bệnh Phtophthora gây bệnh thối gốc rễ hồ tiêu ở trong đất. Do đó, nếu lá tiêu ở mẫu đất bẫy có vết bệnh đặc trưng như đã mô tả ở hình 2, thì có thể chắc chắn rằng mẫu đất đó có sự hiện diện của nguồn bệnh P. capsici. Vì vậy, kỹ thuật này có thể ứng dụng để theo dõi nguồn bệnh P. capsisi trong đất để dự tính dự báo khả năng và mức độ bệnh sẽ xảy ra nhằm có kế hoạch phòng trừ bệnh. Để quản lý bệnh thối gốc rễ hồ tiêu hiệu quả cần phối hợp nhiều biện pháp trong đó có biện pháp hóa học. Tuy nhiên, hầu hết các loại thuốc hóa học để phòng trừ bệnh chỉ phát huy tác dụng cao nhất đối với bệnh trước khi nấm P. capsici xâm nhập thành công vào bên trong cây. Cho nên kỹ thuật này sẽ góp phần nâng cao hiệu quả của các loại thuốc hóa học do theo dõi được nguồn bệnh trong đất và tiến hành xử lý thuốc đúng lúc. IV. Kết luận và đề nghị Sử dụng lá tiêu để bẫy nấm P. capsici trong đất là một phương pháp hữu hiệu để phân lập và theo dõi nguồn bệnh bảo tồn ở trong đất. Việc xác định được nguồn bệnh trong đất góp phần dự tính dự báo sự phát sinh dịch bệnh và có kế hoạch phòng trị bệnh chủ động. Kỹ thuật này nên được triển khai tập huấn rộng rãi cho các cán bộ ở những vùng sản xuất hồ tiêu để phục vụ chỉ đạo sản xuất. Tài liệu tham khảo 1. Anandaraj M, Sarma YR (1990) A simple baiting technique to detect and isolate Phytophthora capsici ('P. palmivora' MF4) from soil. Mycological Research 94, 1003-1004. 2. Dhingra OD, Sinclair JB (1995) 'Basic plant pathology methods'. (2rd ed.). (Lewis Publishers: Boca Raton). 3. Erwin DC, Ribeiro OK (1996) 'Phytophthora diseases worldwide'. (APS Press: St. Paul, Minn.). 4. Holliday P, Mowat WP (1963) 'Foot rot of Piper nigrum L. (Phytophthora palmivora).' Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey. 5. Kueh TK, Khew KL (1982) Survival of Phytophthora palmivora in soil and after passing through alimentary canals of snails. Plant Disease 66, 897-899. 6. Nair KPP (2004) The agronomy and economy of black pepper (Piper nigrum L.) – the "King of Spices". Advances in Agronomy 82, 271-389. 7. Nguyễn Đăng Long (1992) 'Kết quả nghiên cứu bệnh hại cây tiêu 1987-1991.' Rhone- Poulenc, Thành phố Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Vĩnh Trường, Đặng Lưu Hoa, Burgess L, Benyon F, Trần Nguyễn Ha, Nguyễn Kim Vân, Ngô Vĩnh Viễn (2002) Bước đầu nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh chết héo hồ tiêu. 'Hội thảo bệnh cây và sinh học phân tử lần thư nhất.' (Nhà xuất bản Nông Nghiệp: Đại học Nông Lâm, Tp HCM). 9. Sastry MNL, Hegde RK (1988) Survival of Phytophthora palmivora. Indian Phytopathology 41, 118-121. 10. Truong N, Burgess LW, Liew ECY (2008) Prevalence and aetiology of Phytophthora foot rot of black pepper in Vietnam. Australasian Plant Pathology 37, 431-442. . học BVTV - Số 4/2008 Kỹ thuật bẫy và theo dõi nguồn bệnh Phytophthora gây bệnh thối gốc rễ hồ tiêu ở trong đất Baiting and monitoring propagules of pathogen causing Phytophthora foot rot. vết bệnh trên lá tiêu bẫy bằng mắt thường đủ độ tin cậy để có thể xác định được nguồn nấm bệnh Phtophthora gây bệnh thối gốc rễ hồ tiêu ở trong đất. Do đó, nếu lá tiêu ở mẫu đất bẫy có vết bệnh. tác nhân gây bệnh thối gốc rễ hồ tiêu ở Mã Lai. Các tác giả đã cho biết rằng mật độ nguồn nấm bệnh P. palmivora MF4 (nay được xác định lại là P. capsici) gây nên bệnh thối gốc rễ hồ tiêu được