Nhân nhanh in vitro giống hoa cúc nhật "rivalry" doc

nhân nhanh in vitro giống hoa cúc Nhật Rivalry Study on Micropropagation of Japan chrysanthemum Rivalry Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch Summmary The experiments ware carried out on new variety of chrysanthemum from Japan: Rivalry. The research results showed that: HgCl 2 0,2% in 7 min. was the best for sterization treatment of the stem and leaf tissue of chrysanthemum;Stem tissue was better than leaf one for explants. The initial and multipropagation medium was MS+1ppm BA.The MS medium without growth regulations was the best for rooting of shoot.The mix of soil, sand and burned rice husk (1:1:1) was suitable for transfering the plantlets to ambient condition.Fourteen thousand plantlets ware produced by tissue culture due to apply above research results. Those plantlets grew and gave their flowers. Key words: Rivalry, tissue culture , multipropagation 1. mở đầu Trong các loài hoa cắt hiện nay, chỉ đứng sau hoa hồng, hoa cúc là một trong những loại hoa đợc a chuộng và trồng phổ biến ở nớc ta (Linh Xuan Nguyen, 1998). Hoa cúc đợc a chuộng bởi sự đa dạng về chủng loại và màu sắc; phong phú về kiểu dáng, khá bền và phù hợp với nhiều mục đích sử dụng. Hơn thế, cây cúc đợc điều kiển ra hoa để tạo nguồn sản phẩm hàng hoá liên tục và ổn định quanh năm (John, Harold, 1999). Chính vì vậy, nhu cầu có đợc các giống cúc mới thông qua chọn tạo và nhập nội nhằm đáp ứng đợc nhu cầu của thị trờng luôn đợc ngời sản xuất quan tâm, chú trọng. Để góp phần làm đa dạng và phổ biến giống mới, đồng thời đáp ứng một phần nhu cầu cây giống cho ngành sản xuất hoa cúc ở nớc ta, giống cúc Nhật Rivalry đợc nghiên cứu nhân nhanh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. 2. Vật liệu, phơng pháp nghiên cứu Nguyên liệu cho các thí nghiệm in vitro là lá và đoạn thân của cành hoa cúc Rivalry (Dendranthema indicum Gr.). Đây là giống cúc có kích thớc hoa lớn (đờng kính hoa gấp đôi cúc đại đoá), mầu sắc mới lạ, nguồn gốc từ Kyushu Nhật Bản, đợc Viện Sinh học Nông nghiệp du nhập vào Việt Nam năm 2000. Nguyên liệu cho các thí nghiệm ex vitro là cây con hoàn chỉnh nhận đợc từ nuôi cấy in vitro. Thí nghiệm đợc tiến hành theo phơng pháp nghiên cứu nuôi cấy mô hiện hành (Robert, Dennis, 2000), trên nền môi trờng cơ bản MS (Murashige,Skoog, 1962). Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ phòng nuôi 25- 27 o C, độ ẩm phòng nuôi 70%, cờng độ chiếu sáng: 3000lux, thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày. Thí nghiệm đợc bố trí ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi công thức 30 cá thể.Các chỉ tiêu thí nghiệm đợc quan sát thờng xuyên với 7-10 ngày 1 lần (tuỳ theo yêu cầu của thí nghiệm) Số liệu thực nghiệm đợc xử lý thống kê sinh học theo chơng trình IRRISTAT. Các thí nghiệm đợc tiến hành tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, tế bào thực vật và vờn thực nghiệm của Viện sinh học nông nghiệp, trờng Đại học nông nghiệp I. 3. Kết quả và thảo luận 3.1 Giai đoạn tạo nguồn mẫu khởi đầu Tạo đợc nguồn mẫu sạch có khả năng sống cao là điều kiện tiên quyết cho sự thành công của việc nuôi cấy in vitro. Trên cơ sở của nghiên cứu đã công bố trớc đây (Nguyễn Thị Lý Anh và cộng sự, 1999), kết quả khử trùng mẫu cấy bằng HgCl 2 nồng độ 0,2% trong thời gian 7 phút cho tỷ lệ mẫu sạch, sống đối với mô lá là 76,7% và mô thân là 86,7%. Các mẫu này đợc nuôi cấy để tái sinh chồi. Bảng 1. ảnh hởng của BA đến sự tái sinh chồi từ mô lá (sau 4 tuần) Công thức Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi/mẫu cấy (chồi) Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi (lá) Đ/C (MS) 0,0 0,0 0,0 0,0 MS + 0,5ppm BA 40,0 1,5 1,3 2,5 MS + 1,0ppm BA 43,3 1,6 1,5 4,4 MS + 1,5ppm BA 76,6 3,1 1,6 5,8 MS + 2,0ppm BA 66,7 2,5 1,4 3,2 MS + 2,5ppm BA 53,3 2,0 1,3 2,5 MS + 3,0ppm BA 50,0 1,2 1,2 1,8 LSD (0,05) 3,9 0,1 Sự có mặt của đơn chất BA với các nồng độ khác nhau trong môi trờng nuôi cấy đã có khả năng kích thích khả năng tái sinh chồi từ mô lá (bảng 1). Chỉ các công thức bổ sung BA mới có khả năng tái sinh chồi. Tuy nhiên, hiệu quả kích thích tái sinh chồi sẽ bị giảm đi khi bổ sung BA ở nồng độ cao. Khi bổ sung BA ở nồng độ 1,5ppm cho hiệu quả tái sinh chồi cao nhất. Bên cạnh đó, chất lợng chồi tái sinh thể hiện qua các chỉ tiêu sinh trởng cũng tốt nhất. Bảng 2. ảnh hởng của BA đến sự tái sinh chồi từ đoạn thân mang 1 mắt ngủ (sau 4 tuần) Công thức Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi/mẫu cấy (chồi) Chiều cao chồi (cm/chồi) Số lá/chồi (lá/chồi) Đ/C (MS) 100 1,0 6,9 2,1 MS + 0,5ppm BA 100 3,4 6,3 1,6 MS + 1,0ppm BA 100 4,6 6,6 1,5 MS + 1,5ppm BA 100 4,1 6,4 1,3 MS + 2,0ppm BA 100 3,8 6,7 1,2 MS + 2,5ppm BA 100 3,3 6,4 1,1 MS + 3,0ppm BA 100 3,1 7,7 1,0 LSD (0,05) 0,1 0,1 0,4 0,1 Đoạn thân mang mắt ngủ cho tỷ lệ tái sinh đạt 100% trên tất cả các môi trờng (bảng 2), do khả năng bật chồi của mắt ngủ ít bị ảnh hởng bởi chất điều tiết sinh trởng (trong giới hạn nghiên cứu). Tuy nhiên, mẫu cấy chỉ tạo cụm chồi khi đợc cấy trên môi trờng có bổ xung BA. Điều này chứng tỏ BA đã kích thích khả năng tái sinh chồi của mẫu cấy và bổ xung BA ở nồng độ 1,5mg/lít cho tỷ lệ tái sinh đạt 100%, số chồi tái sinh cao nhất (đạt 4,6 chồi/mẫu cấy), chồi tái sinh sinh trởng mạnh (chỉ kém công thức đối chứng). 3.2. Giai đoạn nhân nhanh Giai đoạn này đợc thực hiện bằng phơng thức tạo cụm chồi từ các chồi tái sinh thu nhận đợc trong giai đoạn trên. Bảng 3. ảnh hởng của BA đến hệ số nhân chồi trên hai nguồn mẫu (sau 4 tuần) Chồi tái sinh từ mô lá Chồi tái sinh từ mô thân Công thức Hệ số nhân (lần) Chiều cao chồi (cm) Số lá/ chồi (lá) Hệ số nhân (lần) Chiều cao chồi (cm) Số lá/ chồi (lá) Đ/C (MS) 1,0 2,5 6,3 1,0 4,4 14,5 MS + 0,5 ppm BA 3,6 1,7 5,9 4,7 3,4 6,4 MS + 1,0 ppm BA 6,0 2,0 6,0 7,1 3,2 6,3 MS + 1,5 ppm BA 4,1 1,5 5,2 5,4 3,0 6,5 LSD (0,05) 0,3 0,1 0,2 0,3 0,4 0,6 Sau 4 tuần nuôi cấy cho thấy môi trờng đợc bổ sung BA có tác dụng kích thích khả năng đẻ chồi của cây hoa cúc (chỉ các công thức bổ xung BA mới có khả năng đẻ chồi) trên cả hai nguồn mẫu là chồi tái sinh từ mô lá và chồi tái sinh từ mô thân (bảng 3). Tuy nhiên, bổ sung BA ở nồng độ cao sẽ làm giảm khả năng đẻ chồi, hệ số nhân giảm 1,7 lần (từ 7,1 xuống 5,4) khi tăng nồng độ BA từ 1,0ppm lên 1,5ppm. Hệ số nhân đối với nguồn mẫu là cây tái sinh từ đoạn thân cao hơn so với chồi tái sinh từ mô lá (7,1 lần so với 6,0). Môi trờng tối u để nhân nhanh cây hoa cúc trên cả hai loại nguồn mẫu là: MS + 1mg/lít BA. Trên môi trờng này cho hệ số nhân là 7,1 đối với chồi tái sinh từ mô thân và 6,0 đối với chồi tái sinh từ mô lá. 3.3. Giai đoạn tạo cây in vitro hoàn chỉnh Bảng 4. ảnh hởng của -NAA đến sinh trởng và khả năng ra rễ của chồi cúc tái sinh từ các nguồn mẫu khác nhau (sau 2 tuần) Chồi có nguồn gốc từ mô lá (chồi tái sinh từ mô lá) Công thức Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ/cây (rễ) Chiều dài rễ (cm) Số lá/cây (lá) chiều cao cây (cm) Đ/C (MS) 80,0 9,1 3,8 7,3 2,3 MS+0,25pp mNAA 86,7 13,5 3,0 6,5 1,9 MS+0,5ppm NAA 100,0 15,8 3,0 6,9 2,0 LSD 2,8 2,0 0,1 0,1 Chồi có nguồn gốc từ mô thân (chồi tái sinh từ mô thân) Công thức Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ/cây (rễ) Chiều dài rễ (cm) Số lá/cây (lá) chiều cao cây (cm) Đ/C (MS) 100 9,6 5,0 11,6 2,8 MS+0,25ppm NAA 100 12,0 2,8 10,3 2,7 MS+0,5ppm NAA 100 14,8 2,2 10,5 2,8 LSD 0,6 0,1 1,0 0,03 Bổ xung -NAA làm tăng số rễ/cây nhng lại làm giảm chất lợng của bộ rễ khi so với môi trờng không bổ sung -NAA (Đ/C). Mặt khác, chồi tái sinh từ mô thân có khả năng ra rễ mạnh hơn so với chồi tái sinh từ mô lá. Điều này chứng tỏ đã có một sự thay đổi lớn về sinh lý của chồi cúc tái sinh từ mô lá, do mô lá phải qua giai đoạn tạo chồi bất định trong khi đó chồi tái sinh từ mô thân thực chất là chồi đợc nhân nhanh theo phơng pháp vi giâm cành nên không phải qua giai đoạn tái sinh chồi bất định. Cây cúc có khả năng tự ra rễ rất mạnh, tỷ lệ ra rễ trên môi trờng không bổ sung chất điều tiết sinh trởng đạt 80,0% (đối với chồi tái sinh từ mô lá) và 100% (đối với chồi tái sinh từ mô thân). Điều đó chứng tỏ: chồi cúc có khả năng tổng hợp và tự điều chỉnh lợng chất điều tiết sinh trởng nội sinh theo hớng tạo rễ bất định. 3.4 Giai đoạn vờn ơm Bảng 5. ảnh hởng của giá thể đến sinh trởng, phát triển của cây cúc cấy mô (sau 4 tuần) Giá thể Tỷ lệ sống (%) Độ tăng chiều cao (cm) Số lá mới/ cây (lá) Quan sát Trấu hun 100 3,1 4,9 Cây mập, lá to, xanh đều Cát 100 2,2 4,3 Lá to, xanh, thân mập Đất 36,7 2,9 4,4 Cây to, mập, khoẻ, lá to và dày, mầu xanh đậm Xỉ than 53,3 1,5 4,2 Cây yếu, chậm phát triển, lá vàng mỏng Đất+cát (1:1) 80,0 3,0 4,6 Cây khoẻ, lá to xanh Đất+cát+trấu hun (1:1:1) 100 3,4 5,0 Cây mập, khoẻ, mọc đều, thẳng cứng lá to xanh thẫm dày bản Trong giai đoạn vờn ơm, giá thể có ảnh hởng quyết định đến khả năng sống, sinh trởng của cây cúc cấy mô. Nhìn chung, các giá thể có bổ xung trấu hun sẽ cho tỷ lệ sống, sinh trởng, phát triển của cây cúc cấy mô tốt (giá thể trấu hun, và đất + cát +trấu hun theo tỷ lệ 1:1:1 cho tỷ lệ sống đạt 100%, cây sinh trởng mạnh). Giá thể xỉ than và đất tỏ ra không thích hợp với cây cúc cấy mô. Điều này có thể do giá thể xỉ than có các đặc tính lý hoá không phù hợp với sự phát triển của bộ rễ còn giá thể đất lại bí trong thời gian đầu tiên khi ra cây vì vậy đã làm hạn chế khả năng sinh trởng cũng nh tăng khả năng nhiễm bệnh của cây. 3.5 Sự sinh trởng, phát triển của cây cúc cấy mô trong sản xuất Bảng 6. Sự sinh trởng, phát triển của cây hoa cúc Nhật cấy mô và hoa cúc vàng đại đóa (trồng vụ đông 2002 tại Hải Phòng) Chỉ tiêu theo dõi Cúc vàng đại đóa Cúc Nhật Rivalry Thời gian từ trồng đến ra hoa (à) 77 83 Chiều cao cây (cm) 48,2 86,5 Đờng kính thân lúc thu hái (cm) 0,60 1,10 Tỷ lệ ra hoa (%) 100 100 Đờng kính bông hoa (cm) 6,7 13,3 Đờng kính cuống hoa (cm) 0,3 0,8 Chiều cao bông hoa (cm) 12,3 14,2 Mầu sắc hoa Vàng đậm Vàng tơi Đặc điểm hình thái Cây có thân lá cân đối Cây có thân lá to, nặng, dễ đổ áp dụng các kết quả nghiên cứu nêu trên, Trung tâm ứng dụng khoa học kỹ thuật công nghệ - Sở khoa học Công nghệ Hải Phòng đã sản xuất đợc 14.200 cây cúc Nhật giống Rivalryvà trồng thử tại Đằng Hải - Hải Phòng. Các chỉ tiêu sinh trởng của giống cúc này nh chiều cao cây, đờng kính thân lúc thu hái, đờng kính bông hoa, đờng kính cuống hoa, chiều cao bông đều cao hơn cúc đại đóa. Tỷ lệ ra hoa 100% (bảng 6). Kết quả này khẳng định quy trình nhân giống có thể vận hành ở sản xuất đồng thời cũng giới thiệu cho sản xuất một giống hoa cúc mới lạ. Do có kích thớc hoa lớn, chiều cao và đờng kính bông hoa gần tơng đơng nhau nên nông dân gọi là hoa cúc đèn lồng. Giống hoa này có thể sử dụng tốt vào các mục tiêu trang trí. 4. Kết luận Quy trình nhân giống cây hoa cúc Nhật Rivalry bằng kỹ thuật nuôi cấy mô với chế độ khử trùng thích hợp cho mô thân và mô lá cúc là: HgCl 2 0,2% trong 7 phút, ở chế độ khử trùng này mô lá cho tỷ lệ mẫu sạch, sống đạt 76,7% và mô thân đạt 86,7%. Mô thân mang mắt ngủ đợc sử dụng làm vật liệu nuôi cấy khởi động vì cây tái sinh từ mô thân sẽ cho chất lợng cây con tốt hơn, khả năng nhân nhanh cũng nh ra rễ mạnh hơn. Môi trờng MS + 1ppm BA đợc chọn nuôi cấy khởi động, nhân nhanh in vitro. Môi trờng MS không bổ xung chất điều tiết sinh trởng đợc chọn làm môi trờng tạo cây hoàn chỉnh, trên môi trờng này chồi ra rễ 100% sau 2 tuần nuôi cấy, khả năng sinh trởng và phát triển của cây con tốt. Giá thể thích hợp cho cây cúc cấy mô ngoài vờn ơm là: đất+ cát + trấu hun (1:1:1), giá thể này cho tỷ lệ sống đạt 100%, cây con sinh trởng mạnh nhất. Với qui trình này, đã sản xuất đợc hàng chục ngàn cây giống để trồng thử nghiệm ở Hải Phòng, Hà Nội, Thái Bình. Tài liệu tham khảo Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch, Từ Thị Hoài Thu (1999). Nghiên cứu các phơng pháp nhân nhanh một số giống hoa cúc chùm Hà lan. Báo cáo khoa học Hội nghị Quốc gia về Công nghệ sinh học, tr. 859-865 John M. D., Harold F. W., (1999). Floriculture Principles and Species, Prentice Hall, Inc., p. 292- 303 Linh Xuan Nguyen, (1998). Cut Flower Production in ASIA. FAO, Bangkok, Thailand, p.63-67 Murashige T. and Skoog F., (1962). A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15. pp: 473- 497. Robert N. Trigiano, Dennis J. G., (2000). Plant Tissue Culture Concepts and Laboratory Excercises, CRC Press LLC, p. 75-85 . liệu cho các thí nghiệm in vitro là lá và đoạn thân của cành hoa cúc Rivalry (Dendranthema indicum Gr.). Đây là giống cúc có kích thớc hoa lớn (đờng kính hoa gấp đôi cúc đại đoá), mầu sắc mới. phần làm đa dạng và phổ biến giống mới, đồng thời đáp ứng một phần nhu cầu cây giống cho ngành sản xuất hoa cúc ở nớc ta, giống cúc Nhật Rivalry đợc nghiên cứu nhân nhanh bằng kỹ thuật nuôi cấy. thiệu cho sản xuất một giống hoa cúc mới lạ. Do có kích thớc hoa lớn, chiều cao và đờng kính bông hoa gần tơng đơng nhau nên nông dân gọi là hoa cúc đèn lồng. Giống hoa này có thể sử dụng