Luận văn ứng dụng phương pháp quang phổ phân giải theo thời gian nghiên cứu quá trình truyền năng lượng cộng hưởng

MỞ ĐẦU Truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang hay truyền lượng cộng hưởng Förster đặt tên nhà khoa học Theodor Fưrster - người tìm hiệu ứng truyền lượng hai chất màu hữu cơ, chất huỳnh quang [1] Trong thời gian dài, mục tiêu phương pháp dựa vào FRET xác định khoảng cách phân tử tương tác cách xác định thay đổi cường độ huỳnh quang chất cho (donor) chất nhận (acceptor), từ xác định hàm lượng thành phần donor-acceptor [2,5] Sau với phát triển khoa học kỹ thuật đặc biệt kỹ thuật đo thời gian sống huỳnh quang, ảnh thời gian sống huỳnh quang, FRET trở thành công cụ nghiên cứu cấu trúc, tương tác phân tử tế bào FRET nguyên nhân gây dập tắt huỳnh quang donor phần lớn lượng phát xạ acceptor FRET có thuộc tính truyền lượng dập tắt học [4] Khi hiệu ứng FRET xảy ra, acceptor với tập hợp mức lượng quỹ đạo gần thấp mức kích thích donor, có nghĩa phổ phát xạ donor phải chồng chập lên phổ hấp thụ acceptor, trình truyền lượng đo thơng qua thời gian sống huỳnh quang Xác định FRET qua thời gian sống huỳnh quang có số ưu điểm so với phương pháp xác định cường độ phổ đồng thời tránh trường hợp khơng phải FRET (q trình tái hấp thụ) Trong nghiên cứu này, chúng tơi trình bày kết qủa nghiên cứu truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang cặp donoracceptor là: chất màu Rhodamin 6G hạt nano vàng; Rhodamin 6G chấm lượng tử CdSe/ZnS môi trường dung môi nước Luận văn với tiêu đề: “Ứng dụng phương pháp quang phổ phân giải thời gian nghiên cứu q trình truyền lượng cộng hưởng” Ngồi phần mở đầu, kết luận chia làm chương: − Chương 1: Tổng quan tìm hiểu tài liệu FRET, ứng dụng FRET: trình bày lich sử phát triển nghiên cứu FRET, lý thuyết FRET số ứng dụng − Chương 2: Kỹ thuật thực nghiệm: Chuẩn bị mẫu đo, phương pháp thực nghiệm sử dụng luận văn đo phổ hấp thụ, phổ huỳnh quang, thời gian sống huỳnh quang − Chương Trình bày kết truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang cặp donor-acceptor là: chất màu Rhodamin 6G hạt nano vàng; Rhodamin 6G chấm lượng tử CdSe/ZnS môi trường dung môi nước Chương TỔNG QUAN 1.1.Vật liệu nano ứng dụng Vật liệu nano loại vật liệu đặc biệt ý nghiên cứu giới Việt Nam mười năm trở lại Hiện công nghệ nano dần vào sống, nhiều ngành, nhiều lĩnh vực sử dụng công nghệ nano tạo ứng dụng có tính đột biến lớn Công nghệ Vật liệu nano hướng nghiêu cứu ưu tiên định hướng phát triển khoa học công nghệ Đảng Nhà Nước ta thời gian tới Về chất vật liệu nano loại vật liệu làm việc cấp độ nguyên tử phân tử nên có nhiều tính chất khác biệt so với vật liệu dạng khối Vật liệu nano cho thấy khả ứng dụng phong phú đa dạng, vật liệu nano thay loại vật liệu truyền thống sử dụng tính chất vật liệu nano để tạo ứng dụng Với ưu điểm kích thước bé (1-100nm) vật liệu nano dễ dàng xâm nhập vào tế bào sống Đây chìa khố để mở khả ứng dụng to lớn lĩnh vực y-sinh học Vật liệu nano kết hợp với chất hợp sinh để đưa vào thể, tế bào sống mà không bị đào thải bám vào tế bào đích Đây nguyên lý ứng dụng hạt nano đánh dấu nhận biết tế bào bị bệnh nhằm chẩn đoán điều trị, nhằm giảm thiểu hiệu ứng phụ so với phương pháp truyền thống Cũng với tính chất này, vật liệu nano sử dụng để dẫn truyền thuốc tới tận tế bào bệnh, ức chế tiêu diệt tế bào Nhiều phương pháp điều trị bệnh xây dựng sở sử dụng vật liệu nano liệu pháp hoá trị (chemotherapy): chế tạo hệ thống mang thuốc nano hướng đích làm tăng hiệu thuốc giảm tác dụng phụ; liệu pháp nhiệt trị (thermal therapy): sử dụng nguyên tắc đốt nội với nguồn nhiệt hạt từ, hạt kim loại kích thước bé tế bào để bóc tách diệt tế bào ung thư; liệu pháp thực khuẩn thể (phage therapy) phương pháp sử dụng thực khuẩn thể đặc hiệu gắn với hạt mang thuốc… Ngoài ra, tính chất quang hạt nano chấm lượng tử, hạt nano vàng, hạt nano silica chứa tâm màu hữu hạt nano đất sử dụng để đánh dấu, làm tăng độ tương phản ảnh, tăng độ nhạy độ xác phép chuẩn đốn hình ảnh Tại Việt Nam nghiên cứu vật liệu nano thực gần hai chục năm qua, hàng ngàn dự án, đề tài khoa học cấp thực hiện, thu nhiều kết khoa học đáng khích lệ, nhiều cơng trình khoa học cơng bố, nhiều kết đưa vào ứng dụng thực tế …bên cạnh tính chất, thơng số, đặc trưng vật lý đơn hạt nano trạng thái dừng (steady state) vật liệu nano tập trung nghiên cứu thời gian gần đây, tính chất khác vật liệu nano tính chất động học – tính chất vật liệu có tương tác với mơi trường bên ngồi ý Việt Nam chưa có đầy đủ phương tiện, máy móc để thực nghiên cứu Gần viện Vật lý Viện Hàn lâm Khoa Học Công Nghệ Việt Nam phát triển số thiết bị cho phép xác định số đặc tính động học vật liệu nano Vật liệu nano có triển vọng ứng dụng nhiều lĩnh vực Chẳng hạn, ống nano cacbon, dây nano silic đóng vai trò quan trọng việc chế tạo linh kiện điện tử, chuyển mạch quang Các vật liệu gốm sở tinh thể nano Si3N4, SiC có độ cứng siêu cao, bị mài mịn, dùng khí để chế tạo mũi khoan, dao cắt gọt, ổ bi Vật liệu TiO2 anatase với kích thước cỡ nano mét cho thấy chúng chất xúc tác quang điện hóa mạnh, mở khả ứng dụng làm vật liệu xúc tác, làm mơi trường: kính phủ hạt tinh thể nano TiO2 khơng dính ướt; loại sơn có pha hạt nano TiO2 có độ bám dính cao, làm cho lớp sơn bền lâu không bám bụi Các hạt nano từ: Fe2O3, Fe3O4 sử dụng để đốt tế bào ung thư từ trường ngồi mà khơng ảnh hưởng đến tế bào bình thường Các hạt kim loại có cấu trúc nano hướng tiếp cận nghiên cứu khoa học–cơng nghệ nano Ở đây, tính chất hấp thụ cộng hưởng plasmon bề mặt liên quan tới hệ điện tử tự đặc biệt có ý nghĩa quan trọng Gần đây, hai loại hạt nano kim loại quan tâm nghiên cứu nhiều vàng (Au) bạc (Ag) Vàng kích thước nano (khoảng vài chục nm) có plasmon bề mặt cộng hưởng khoảng 530 nm Quá trình biến đổi photon–plasmon–photon (vùng phổ cộng hưởng ~530 nm) cho phép tiếp cận trực tiếp lĩnh vực nano–photonics, tận dụng ưu "nhanh" quang tử (photonics) "kích thước nano" điện tử Plasmon bề mặt hạt vàng sử dụng để truyền lượng ánh sáng cho tế bào, protein đánh dấu riêng, nhằm có đốt nóng chọn lọc điều trị định vị mô ung thư Các hạt nano bán dẫn (CdS, CdSe, CuInS2 ) sử dụng đánh dấu sinh học, phát phân tử DNA, phát ung thư, virút hay ứng dụng pin mặt trời, chiếu sáng rắn [6] 1.2 Hiện tượng truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) 1.2.1 Khái niệm Hiệu ứng truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang (Fluorescence Resonance Energy Transfer - FRET ) chế truyền lượng xảy cấp độ nano thông qua tương tác lưỡng cực – lưỡng cực, tượng vật lý quan trọng với nhiều lĩnh vực tiềm lĩnh vực quang điện tử nhiều lĩnh vực khác FRET đưa từ thập kỷ 50 kỷ trước, ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực đặc biệt nghiên cứu y sinh học [7,8] FRET hiệu ứng phụ thuộc vào khoảng cách truyền lượng từ chất cho huỳnh quang (donor) tới acceptor huỳnh quang (acceptor) phù hợp, số cơng cụ có sẵn để đo khoảng cách nanomet xác định thay đổi khoảng cách in vitro lẫn thể Do có độ nhạy với khoảng cách cao, nên hiệu ứng FRET sử dụng để nghiên cứu động học, tương tác nguyên tử [9,10,13] Cơ chế truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang liên quan đến chất phát huỳnh quang mà điện tử trạng thái kích thích, phân tử huỳnh quang truyền lượng kích thích cho acceptor khơng phát xạ gần thơng qua tương tác lưỡng cực-lưỡng cực tầm xa Lý thuyết truyền lượng dựa khái niệm chất huỳnh quang kích thích dao động lưỡng cực trải qua trao đổi lượng với lưỡng cực thứ hai có tần số cộng hưởng tương tự Vấn đề này, truyền lượng cộng hưởng tương tự dao động tần số Ngược lại, lượng xạ yêu cầu phát xạ tái hấp thụ photon phụ thuộc vào kích thước vật lý tính chất quang học mẫu vật, hình dạng bề mặt qng đường truyền sóng Khơng giống chế xạ, truyền lượng cộng hưởng mang lại lượng đáng kể thơng tin cấu trúc liên quan đến acceptor.[9,10,12] Một cặp phân tử tương tác với thông qua hiệu ứng FRET gọi cặp donor- acceptor Hiện tượng FRET khơng qua trung gian q trình phát xạ photon Ngồi ra, chí khơng u cầu chất màu nhận phát huỳnh quang Mặc dù hầu hết ứng dụng, donor acceptor có khả phát huỳnh quang [13,14] Tóm lại, FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer - FRET ) hay gọi hiệu ứng truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang Ở truyền lượng cộng hưởng (RET) gọi truyền lượng cộng hưởng điện tử (electronic energy tranfer – EET) Hiệu ứng truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) chế mà hạt nano truyền lượng kích thích khơng xạ cho hạt nano độc lập khác khoảng cách ngắn (khoảng cách nguyên tử) Phát xạ FRET Donor Accrptor Hấp thụ Huỳnh quang chất cho Hấp thụ chấp nhận Hình 1.1: Mơ hình hiệu ứng FRET Một cặp nguyên tử tạo điện trường tương tác lưỡng cực Đầu tiên hấp thụ ánh sáng xảy nguyên tử cho (donor molecule), bắt đầu bị kích thích Trước donor phát huỳnh quang quay trở lại trạng thái ban đầu, trạng thái kích thích nên truyền lượng cho nguyên tử nhận (acceptor molecule) gần có trạng thái lượng kích thích thấp qua trao đổi photon ảo Nguyên tử cho (the donor) trở trạng thái cịn ngun tử nhận trở lên trạng thái kích thích.[9,15,16] Kết cuối nguyên tử nhận bắt đầu chuyển lên trạng thái kích thích nhờ vào q trình gián tiếp nhận photon ảo, mặt khác tượng xảy tự nhiên [12] FRET tượng tự nhiên đầy lý thú khơng phụ thuộc vào tiếp xúc vật lý truyền điện tử 1.2.2 Lịch sử phát triển FRET [11] Mặc dù ứng dụng thực tế FRET diễn sau năm 1950 quan sát tượng truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang thực từ thực nghiệm năm 1900 nhà khoa học ln tìm cách để giải thích tượng Bắt đầu với lý thuyết sóng điện từ (EM) quang phổ, đồng thời với đời học lượng tử (QM) Những lý thuyết cần thiết cho quan sát giải thích việc truyền lượng khơng xạ Khái niệm EM đưa vài thập kỷ trước quan sát truyền lượng Lý thuyết cố gắng giải thích FRET sử dụng lý thuyết EM cổ điển Lý thuyết học lượng tử FRET phát triển đồng thời với lý thuyết Heisenberg, Schrodinger Dirac (Heisenberg, 1925; Dirac, 1926; Schrodinger, 1926) Thí nghiệm ghi lại phép đo truyền lượng huỳnh quang cộng hưởng (quan sát phát xạ nguyên tử donor) Carlo Franck thực khoảng cách lớn bán kính va chạm thực vào năm 1922 Carlo quan sát phát xạ từ Tali hỗn hợp thủy ngân Tali, hỗn hợp bị kích thích bước sóng 253,6 nm, Bước sóng kích thích nguyên tử thủy ngân lại thu huỳnh quang Tali Huỳnh quang Tali gọi “huỳnh quang cảm ứng” (sensitized fluorescence) quan sát lượng từ nguyên tử thủy ngân bị kích thích truyền cho nguyên tử tali Các thí nghiệm tác giả khác thấy huỳnh quang cảm ứng xẩy với kim loại kiềm như: bạc, cadmium, chì, kẽm indi với có mặt thủy ngân Tầm quan trọng cộng hưởng lượng mức mức lượng nguyên tử nhạy cảm minh chứng rõ ràng thí nghiệm sau Beuler Josephi (1927-1929), cường độ huỳnh quang tăng với tham gia hai loại nguyên tử Điều phù hợp với nguyên lý Franck (1922): lượng điện tử ngun kích thích khơng thể chuyển trực tiếp thành động hạt va chạm Nếu lượng kích thích chuyển thành nội dập tắt có trạng thái kích thích với lượng tăng cường Cơ học lượng tử lý thuyết truyền lượng [9,10] Lý thuyết học lượng tử để giải thích truyền nguyên tử khoảng cách xa so với bán kính va chạm đề xuất Kallmann London (1928) Lý thuyết giả thiết có cộng hưởng mức lượng nguyên tử tương tác Về phép tính nhiễu loạn bậc hai để tính tốn lượng tương tác Họ tìm chuyển dời mức lượng chuyển dời dipole, tiết diện hiệu dụng q nguyên tử tương tác tăng -2/3 ( sai khác mức lượng kích thích) →0 tiết diện hiệu dụng tiến tới giá trị lớn bán kính tán xạ Đây sở lý thuyết FRET học lượng tử sau này, tương tự mô tả lực London-van der Waals Lực London - Van Der Waals) tương tác Debye-Keesom Ý tưởng lưỡng cực-lưỡng cực (Dipole-Dipole) tương tác khoảng cách nguyên tử phân tử London áp dụng giải thích tương tác phân tử Vander Waals truyền lượng Trước tương tác Keesom (1912); Debye (1920-1921) sử dụng giải thích tương tác phân tử có mối liên hệ phân tử London FRET Sự khác lượng tương tác lực Vander Waals tốc độ thay đổi lượng FRET Trong tương tác Vander Waals hai phân tử tương tác trạng thái FRET hai phân tử tương tác trạng thái kích thích Biểu thức lực London tương tác hai nguyên tử liên quan đến cường độ dao động UV-Vis chuyển dời quang học tương ứng, giống FRET (Förster, 1951) Biểu thức đầy đủ cho tương tác London tổng chuyển dời quang học hai nguyên tử tương tác Nếu hai nguyên tử trạng thái bản, lực London lực hút, nữa, nguyên tử tương tác hình cầu đối xứng có phân cực đẳng hướng, định hướng tương đối chúng ảnh hưởng đến tương tác (giống phụ thuộc định hướng FRET) Tương tác van der Waals đơn giản (không tính đến liên quan đến hiệu ứng Casmir theo lý thuyết London giảm theo R6, R khoảng cách nguyên tử; điều giống khoảng cách phụ thuộc FRET hai phân tử huỳnh quang Lý thuyết J Perrin F Perrin Mơ hình J Perrin (1925): Ơng giả thuyết việc truyền lượng kích thích nhảy từ phân tử tới phân tử khác thông qua tương tác dao động lưỡng cực phân tử gần Theo lý thuyết cổ điển phân tử kích thích dao động tần số  tương ứng với cường độ lượng kích thích Eexit= h, sai khác hai mức lượng Các phân tử tương tác trường dipole điện Hertzian (1888); Dipole Hertzian dao động dipole tĩnh Perrin giả định phân tử phân cách khoảng cách đủ nhỏ, lượng chuyển cho phân tử acceptor khơng phát xạ Ơng gọi ''transfert d'activation'' Mơ hình F Perrin F Perrin (con trai J Perrin) người tiên phong huỳnh quang (1929), Ông mở rộng J Perrin lý thuyết truyền giao lượng cách phát triển mơ hình học lượng tử (Perrin, 1932; Perrin, 1933) Tuy nhiên, ông kết luận, J Perrin, tốc độ truyền tỷ lệ thuận với 1/R3; điều dẫn đến việc truyền lượng khoảng cách dài tìm thấy thực nghiệm F Perrin xem xét tới va chạm phân tử huỳnh quang phân tử dung môi, hiệu ứng Doppler (Perrin, 1932; Perrin, 1933) Những va chạm mở rộng phổ hấp thụ phát xạ phân tử, vốn J Perrin giả thiết hẹp để đảm bảo hiệu suất tương tác Các hiệu ứng va chạm Doppler chủ đề nhiều nghiên cứu quang phổ hai thập kỷ đầu kỷ 19 Kallmann London nghiên cứu pha Các mở rộng quang phổ quan trọng lý sau Năng lượng bị donor xác lượng thu acceptor Mỗi phân tử có xác suất va chạm định Điều làm giảm khả cộng hưởng, phải có hai lưỡng cực tương tác để có q trình truyền lượng F Perrin sử dụng lý thuyết phổ va chạm mở rộng cho truyền lượng khoảng cách giảm xuống cịn khoảng [(/ 2) (t/)]1/6 t thời gian giữ hai lần va chạm;  thời gian sống huỳnh quang Lý thuyết Förster's Trên cở sở cơng trình nhà khoa học tiền bối Theodor Förster phát triển lý thuyết truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang xuất công bố qua hàng loạt công bố từ 1946-1951 1.2.3 Cơ sở lý thuyết hiệu ứng FRET.[9,12] Sự kích thích ion lan truyền sang ion loại khác sang trạng thái kết truyền lượng cộng hưởng (FRET) chúng định xứ gần Khoảng cách ion mà xác suất trình huỳnh quang lượng trở nên cạnh tranh cỡ vài Angstrom Sơ đồ trình truyền lượnđg cộng hưởng mơ tả hình dưới: Hình 1.2: Giản đồ Jablonski mơ tả hiệu ứng FRET Trong trình truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang, phân tử huỳnh quang donor hấp thụ lượng tưng ánh sáng tới chuyển lên trạng thái kích thích.[9] Năng lượng kích thích truyền cho phân tử huỳnh quang acceptor lân cận Quá trình truyền lượng tự làm giảm huỳnh quang donor (dập tắt) tăng cường độ huỳnh quang acceptor đồng thời giảm thời gian sống huỳnh quang donor D + h → D*+ D* + A → D +A* A* →A + h’ D: donor; A: acceptor; dấu “*” kí hiệu trạng thái kích thích Một số điều kiện cần phải thỏa mãn FRET xảy là: (i) Phổ phát xạ huỳnh quang phân tử donor phải chồng lên phổ hấp thụ kích thích chất màu nhận Mức độ chồng chập lên gọi phổ chồng lên tích hợp (J) (ii) Donor phải có cường độ huỳnh quang mạnh (iii) Hai chất (donor acceptor) phải khoảng cách gần (thường đến 10 nanomet) 10 ❖ Phân tích liệu Dữ liệu đo thời gian sống phát quang thường dạng đơn hàm e mũ mà thường có dạng đa hàm e mũ phương trình suy giảm phát quang có dạng:  t  I ( t ) =  I i ( ) exp  −  i =1  i  n (2.11) Với I i ( ) giá trị cực đại thành phần Nếu liệu đo tập hợp nhiều hàm mũ liệu suy giảm phát quang tập hợp chấm lượng tử, việc phân tích kết trở nên phức tạp Một phương pháp đưa sử dụng phân bố stretched-exponential để mơ tả q trình suy giảm phát quang tính tốn thời gian sống trung bình hỗn hợp mẫu cần phân tích [ 7,20, 21, 22] Phương trình phân bố thời gian sống stretched-exponential có dạng:  t I ( t ) = I ( ) exp  −     (2.12) Dữ liệu đo thời gian sống phát quang kỹ thuật TCSPC phức tạp áp dụng hay đưa mơ hình vật lý thích hợp xử lý số liệu xác kết luận trình quang động học xảy trạng thái kích thích vật liệu 26 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Quá trình truyền lượng AuNPs với phân tử Rh6G 3.1.1 Phương pháp chế tạo hạt nano AuNPs Các hạt nano kim loại quý vàng (Au) bạc (Ag) có nhiều khả ứng dụng nhiều lĩnh vực khác photonics, optoelectronics, công nghệ sinh học Các ứng dụng thực tế hạt nano kim loại dựa tượng cộng hưởng plasmon bề mặt (Surface Plasmon Resonance- SPR) Hiện tượng SPR xẩy điện tử dẫn hạt kim loại Au Ag tương tác với trường điện từ ngồi dẫn đến hình thành dao động đồng pha với tần số cộng hưởng định Các hạt nano kim loại hấp thụ mạnh photon kích thích tần số cộng hưởng Trong trường hợp tổng quát, đỉnh SPR bao gồm hai thành phần hấp thụ tán xạ Hiệu ứng SPR phụ thuộc vào hình dạng, kích thước, số điện mơi thân hạt kim loại phụ thuộc vào số điện môi môi trường xung quanh Có nhiều phương pháp chế tạo hạt nano kim loại khác phương pháp hoá khử, quang hoá, phương pháp ăn mịn laser, phương pháp plasma… Phương pháp hóa khử phương pháp thông dụng để chế tạo hạt Au Ag có kích thước < 100 nm, với chi phí rẻ chất lượng mẫu tương đối tốt điều khiển kích thước hình dạng hạt Tuy nhiên phương pháp này, khó loại bỏ tiền chất ban đầu mẫu nanô thu Phương pháp ăn mòn laser phương pháp sử dụng laser (liên tục xung) bắn phá vào bia kim loại đặt mơi trường lỏng khí để tạo hạt nanô Phương pháp tạo mẫu với độ cao, nhiên độ đồng hạt thu lại khó khơng chế Điều phụ thuộc vào độ ổn định công suất, độ rộng xung, tần số lặp lại laser… Phương pháp plasma tạo hạt nanơ có độ phương pháp ăn mòn laser độ đồng hạt lại tốt Trong nghiên cứu này, chọn đối tượng nghiên cứu hạt nanơ vàng (AuNPs) nhóm Vật lý Plasma - Trung tâm Vật lý kỹ thuật - Viện Vật lý chế tạo phương pháp plasma 27 Hạt AuNPs chế tạo phương pháp plasma có hình tựa cầu, kích thước nhỏ 10 nm có phân bố kích thước tương đối đồng Điều thể qua ảnh HRTEM Hình 3.1 Phổ hấp thụ hạt AuNPs môi trường pH =11 xuất đỉnh hấp thụ SPR vùng khả kiến 522 nm ứng với mode dao động lưỡng cực (Hình 3.2) Cường độ hấp thụ Hình 3.14: Ảnh HRTEM AuNPs Bước sóng (nanomet) Hình 3.15: Phổ hấp thụ hạt AuNPs điều kiện mơi trường pH =11 28 3.1.2 Q trình truyền lượng AuNPs với phân tử Rh6G Rh6G biết đến chất màu có hiệu suất lượng tử lớn kích thích bước sóng 488 nm, Rh6G có hiệu suất lượng tử 95% Trong đó, AuNPs có đặc trưng phổ hấp thụ từ 500 nm đến 700 nm phụ thuộc vào hình dạng kích thước Vì ta điều chỉnh kích thước để thu vùng hấp thụ theo ý muốn xung quanh vị trí phát xạ Rh6G (phát= 560 nm), phù hợp để nghiên cứu trình trao đổi truyền lượng cộng hưởng - FRET cặp Rh6G (Donor) AuNPs (Acceptor) Để nghiên cứu FRET cặp Rh6G (Donor) AuNPs (Acceptor), sử dụng AuNPs chế tạo phương pháp plasma đưa thêm Rh6G với tỉ lệ khác (Bảng 3.1) Mẫu khảo sát nồng độ AuNPs Rh6G thay đổi Ở đây, nồng độ Rh6G giữ nguyên nồng độ AuNPs thay đổi tỉ lệ số hạt N(AuNPs)/N(Rh6G) thay đổi Ta tạo mẫu nghiên cứu cách: lấy dung dịch AuNPs từ đến ml cho vào 0.5 ml Rh6G thêm vào lượng nước để 3ml Từ đó, mẫu sử dụng phép đo hấp thụ, huỳnh quang thời gian sống huỳnh quang Bảng 3.1: Các mẫu nghiên cứu FRET cặp Rh6G (Donor) AuNPs (Acceptor) Tên mẫu AuNPs (ml) (N=5e17) Rh6G (M=0.52 μM) H2O Tỷ lệ N (AuNPs/Rh6G) S1 0.5 2.5 S2 0.2 0.5 2.3 0.309 S3 0.4 0.5 2.1 0.618 S4 0.6 0.5 1.9 0.927 S5 0.8 0.5 1.7 1.235 S6 0.5 1.5 1.544 Phổ quang huỳnh quang (PL) trạng thái dừng AuNPs/Rh6G đo điền kiện (bước sóng kích thích, độ rộng khe…) trước xác định thời gian sống huỳnh quang Kết trình bày Hình 3.3 29 Cường độ hấp thụ Bước sóng (nanomet) Hình 3.16: Phổ PL mẫu AuNPs/Rh6G, kích thích = 488nm Ta thấy tỷ lệ nồng độ Acceptor/ Donor tuyến tính cường độ PL mẫu suy giảm nhanh Ta nhận thấy cường độ PL giảm nhanh mẫu S2 S3 có 0.2 0.4 ml AuNPs thêm vào, tương ứng Tuy nhiên, từ có 0.6, 0.8, ml AuNPCs thêm vào cường độ PL giảm chậm Điều thể rõ Hình 3.4, so sánh hiệu suất truyền lượng FRET với tỷ lệ N Hiệu suất truyền Acceptor/ Donor Hình 3.17 Hiệu suất FRET phụ thuộc vào tỉ lệ N Acceptor Donor (tam giác đỏ), so sánh với lý thuyết Förster tỉ lệ R/Ro = 0.92 (Đường màu xanh dương) Hiệu suất truyền lượng E xác định nhiều cách: sử dụng phép đo trạng thái dừng phân giải thời gian Để xác định E, phương pháp 30 phổ biến đo cường độ huỳnh quang trạng thái dừng (FD) mẫu chứa Donor (D) cường độ huỳnh quang (FDA) mẫu tương ứng có thêm Acceptor (A) theo cơng thức (3.1) Hoặc tính E theo cơng thức (1.4) thơng qua phép đo thời gian sống huỳnh quang Kết tính tốn biểu diễn Hình 3.4 cho thấy tỉ lệ Acceptor/Donor khoảng > 1, kết tính tốn thực nghiệm (tam giác đỏ) phù hợp tốt với lý thuyết Förster tỉ lệ R/Ro = 0.92 (Đường màu xanh dương) Điều hợp lý nồng độ Acceptor thấp, xác suất xảy FRET thấp, nhiều Donor tự cường độ huỳnh quang lớn khơng tham gia FRET Như sai số theo lý thuyết lớn Khi tỉ lệ Acceptor/Donor gần 1, số Donor tự khơng cịn đáng kể mà thay vào Donor tham gia vào q trình FRET, huỳnh quang thu phản ánh Donor tham gia vào tương tác truyền lượng FRET Xác định thời gian sống huỳnh quang mẫu AuNPs/Rh6G Thời gian sống huỳnh quang phép đo quan trọng chứng minh hiệu ứng FRET có xảy hay khơng Thơng qua TGS huỳnh quang ta phân tích đánh giá tương tác trao đổi FRET Đường suy giảm huỳnh quang Rh6G thay đổi theo nồng độ AuNPs đo hệ TCSPC biểu diễn Hình 3.5 Thời gian sống huỳnh quang tính từ việc fitting đường cong suy giảm 𝑡 huỳnh quang theo hàm stretch-exponent 𝐼 = 𝐼0 Exp(− )𝛽 , τ thời gian sống 𝜏 điện tử trạng thái kích thích β nằm khoảng từ (0-1) Vì hạt AuNPs có kích thước khác thời gian sống khơng thể fitting theo hàm exponent đơn mà sử dụng hàm stretch-exponent Thời gian sống huỳnh quang nhận xem thời gian sống trung bình mẫu có tham gia hạt AuNPs 31 Intensity (a.u.) Cường độ 1000 S1 S2 S3 S4 S5 S6 100 10 10 15 20 25 30 35 40 45 Time (ns) Thời gian sống(ns) Hình 3.18: Đường cong suy giảm huỳnh quang Rh6G thay đổi theo nồng độ AuNPs Trong trường hợp, nồng độ mẫu nghiên cứu cao (nồng độ hạt AuNPs tăng cao) cường độ huỳnh quang giảm điều trình tái hấp thụ truyền lượng phân tử loại (homotransfer) Khi tính chất quang phụ thuộc vào nồng độ Kết tính tốn thời gian sống huỳnh quang trình bày Bảng 3.2 Giá trị tham số β = mẫu có Donnor khơng có mặt Acceptor, điều chứng minh điện tử có cách tái hợp phát xạ photon nồng độ Rh6G sử dụng thí nghiệm đủ lỗng để khơng bị ảnh hưởng tái hấp thụ hay homotransfer Khi có mặt AuNPCs tham số  giảm dần theo chiều tăng nồng độ AuNPCs, điều chứng minh truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang FRET từ Donor Để rõ hơn, tham số β thời gian sống τ phụ thuộc vào tỷ lệ N (AuNPs/Rh6G) (Bảng 3.2) Tham số β giảm từ xuống 0.917 tương ứng với tỷ lệ N từ đến 1.544, điều chứng minh (AuNPCs) tăng hiệu suất FRET tăng theo lý thuyết Förster đưa 32 Bảng 3.2 Kết tính thời gian sống từ fitting đường cong suy giảm huỳnh quang theo hàm stretch exponent Tên mẫu S1 S2 S3 S4 S5 S6 Tỷ lệ N (AuNPs/Rh6G) 0.309 0.618 0.927 1.235 1.544   (ns) 0.991 0.959 0.949 0.927 0.917 4.157 3.836 3.589 3.430 3.218 3.120 Cần lưu ý Donor sử dụng nghiên cứu phân tử Acceptor vật liệu nanơ Kích thước phân tử Donor (Rh6G) chiều dài phân tử (1.6 nm), Acceptor hạt hình cầu có đường kính < 10 nm Để AD tạo thành cặp FRET chúng phải khoảng cách đủ gần cỡ khoảng cách Förster, điều đòi hỏi phân tử Rh6G cần phải liên kết ligand bề mặt hạt AuNPCs 3.2 Quá trình truyền lượng Rhodamin 6G chấm lượng tử CdSe/ZnS Trong nghiên cứu chọn cặp donor-acceptor Rh6G-CdSe/ZnS (tan nước) Trong Rh6G đóng vai trị donor chấm lượng tử CdSe/ZnS đóng vai trị acceptor Rh6G biết đến chất màu đặc trưng có hiệu suất lượng tử lớn 0,95 phổ phát xạ vùng bước sóng 550-570 nm dùng để so sánh xác định hiệu suất lượng tử chất huỳnh quang khác CdSe/ZnS chọn làm acceptor vật liệu hứa hẹn sử dụng ứng dụng quang điện tử, nhờ hiệu suất lượng tử lớn, tan tốt nước sử dụng chất đánh dấu huỳnh quang, y sinh Chúng tơi chọn CdSe/ZnS tan nước thay dung mơi hữu nước chấm lượng tử loại bỏ khỏi ảnh hưởng ligand xung quanh, ảnh hưởng tới khoảng cách tương tác cặp donor-acceptor gây giảm Chấm lượng tử CdSe/ZnS chế tạo phương pháp hóa ướt từ bột Se, NaBH4, Na2S.9H2O, CdCl2.2,5H2O, C6H5Na3O7.2H2O cồn tuyệt đối [23] Chấm lượng tử sau chế tạo phân tán tốt mơi trường nước Kích thước chấm lượng tử xác định thơng qua ảnh hiển vi truyền qua TEM khoảng 4nm, nồng độ 33 xác định từ lượng tiền chất phản ứng 1014 hạt/ml Rhodamine 6G hãng Sigma Aldrich pha nước với nồng độ 3.8.10-6M/ml Các mẫu chuẩn bị với tỉ lệ Bảng 3.3 Bảng 3.3 Các mẫu nghiên cứu FRET cặp Rhodamin 6G chấm lượng tử CdSe/ZnS TÊN MẪU M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 TỈ LỆ: Rh6G:CdSe/ZnS 0/5 1/5 2/5 3/5 4/5 5/5 5/0 Mẫu sau chuẩn bị đo phổ hấp thụ hệ Shimazu UV2600 (Shimazu), phổ huỳnh quang hệ phổ kế huỳnh quang Cary Eclipse (Variant) huỳnh quang phân giải thời gian hệ đếm đơn photon tương quan thời gian (TCSPC) PicoHarp300 (Picoquant) xử lý phần mềm tính tốn chun Cường độ Cường độ hấp dụng viết Matlab Thời gian sống(ns) Hình 3.19: Phổ hấp thụ phổ huỳnh quang mẫu Rh6G:CdSe/ZnS với tỉ lệ khác Để quan sát cách rõ rệt thay đổi cường độ phổ tương tác trao đổi truyền lượng chúng tơi chuẩn hóa phổ hấp thụ phổ huỳnh quang Nhìn vào hình vẽ thấy phổ hấp thụ, hấp thụ mạnh vùng tử ngoại, mẫu cịn có đỉnh hấp thụ 527 nm kéo dài chân hấp thụ tới 650 nm Khi tỉ lệ Rh6G mẫu tăng đỉnh hấp thụ tăng Phổ huỳnh quang có đỉnh bước sóng 553nm 615 nm tương ứng với hai đỉnh phát xạ của Rh6G chấm lượng tử CdSe/ZnS Mẫu có Rh6G có đỉnh huỳnh quang 553 nm, 34 mẫu có chấm lượng tử có đỉnh huỳnh quang 615 nm Khi tỉ lệ Rh6G mẫu tăng với giá trị đỉnh 553 nm chuẩn hóa ta thấy cường độ đỉnh huỳnh quang tăng có nghĩa tỉ lệ cường độ đỉnh 615 nm cường độ đỉnh huỳnh quang 553 nm tăng Đồng thời thấy vùng chồng chập phổ phát xạ Rh6G với phổ hấp thụ CdSe/ZnS rộng từ 500 nm tới 650 nm Đây chứng Cường độ truyền lượng Rh6G:CdSe/ZnS Thời gian sống(ns) Hình 3.20: Phổ huỳnh quang phân giải thời gian mẫu Rh6G:CdSe/ZnS với tỉ lệ thành phần khác đo đỉnh phát xạ 563 nm với bước sóng kích thích 405 nm Để khẳng định hiệu ứng truyền lượng cộng hưởng Rh6G:CdSe/ZnS tiến hành đo phổ huỳnh quang phân giải thời gian mẫu Rh6G:CdSe/ZnS biểu diễn hình 3.7 Để phân tích đánh giá FRET thơng qua thời gian sống, kết thu được phân tích cách làm khớp (fit) hàm exponential, phân tử Rh6G độc lập dung mơi, huỳnh quang phù hợp với hàm exponent đơn tức có chuyển dời trạng thái phát photon Khi có mặt acceptor CdSe/ZnS, kích thước chấm lượng tử CdSe/ZnS tập hợp hạt khác phân tán quanh giá trị 4nm nên thời gian sống chấm lượng tử tuân theo quy luật hàm multiexponential Hơn ảnh hưởng hiệu ứng FRET, lượng điện tử trạng thái kích thích phân tử Rh6G cịn có khả tái hợp không phát xạ truyền lượng sang acceptor có cách suy giảm điện tử trạng thái kích thích thứ hai, kết thu được làm khớp với hàm multi-exponential; 35 số trường hợp khó để khớp đường phân rã huỳnh quang theo hàm exponent (single-bi, trip…) người ta thường làm khớp theo tổ hợp hàm exponent hay gọi stretch-exponential 𝐼 = 𝐼0Exp(− 𝑡/ 𝜏 ) 𝛽 τ thời gian sống điện tử trạng thái kích thích β số nằm khoảng từ (0-1) Tuy nhiên, trường hợp thời gian sống huỳnh quang trung bình tất q trình xẩy nên khó để phân tích giải thích cho chuyển dời vật liệu Trong trường hợp cặp donor-acceptor Rh6G-CdSe/ZnS, đường phân rã huỳnh quang mẫu sau lượng kích thích cường huỳnh quang đạt giá trị cực đại giảm nhanh theo hàm exponent, làm khớp theo hàm biexponetial I(t)=A1.exp(-t/1)+(1-A1).exp(-t/1) ( 3.1) Trong A1 số; 1,2 thời gian sống huỳnh quang thời gian sống 2~ 25ns khơng thay đổi nhiều với mẫu có nồng độ CdSe/ZnS khác Đây thời gian sống liên quan tới tái hợp xạ trạng thái bề mặt chấm lượng tử cịn 1 có giá trị bé thay đổi theo nồng độ chấm lượng tử qua tái hợp xạ lõi QDs Các giá trị tính tốn hiệu suất truyền lượng, tích phân chồng chập phổ khoảng cách donor-acceptor cho Bảng 3.4 Bảng Giá trị tích phân vùng phổ chồng chồng lên nhau, (J ()), hiệu suất truyền lượng Förster, (E%), khoảng cách cặp donor-acceptor (r) J().1015  r E M-1cm-1nm-4 (ns) (nm) (%) M0 - 2.39 - - M1 3.22x1015 3.27 11.70 0.21 M2 2.37x1015 3.54 11.09 0.15 M3 2.18x1015 3.70 10.96 0.11 M4 1.31x1015 3.75 10.08 0.10 M5 7.41x1014 3.79 9.16 0.09 M6 - 4.15 - - Mẫu 36 Từ kết Bảng 3.4 ta thấy mẫu có hiệu suất truyền lượng tốt (21%) loạt mẫu nghiên cứu gây bới chồng chập phổ lớn phổ phát xạ Rh6G phổ hấp thụ CdSe/ZnS đồng thời thời gian sống cặp donoracceptor giảm theo tỉ lệ acceptor mẫu Khi thời gian sống donor với có mặt acceptor thay đổi chứng FRET [24, 25] Thông thường có trương tác trao đổi FRET, thời gian sống mức kích thích donor giảm có mặt acceptor [25] Thời gian sống donor (Rh6G) bước sóng 553 nm 4.15 ns giảm dần có mặt acceptor với tỉ lệ tăng lên Kết tính tốn truyền lượng FRET từ thời gian sống huỳnh quang phù hợp với kết tính từ cường độ phổ huỳnh quang, nhiên trường hợp thay đổi giá trị cường độ phổ nhỏ phổ huỳng quang nhiễu lớn cách tính qua thời gian sống huỳnh quang có lợi Tuy nhiên cách tính thời gian sống huỳnh quang có hạn chế phải chọn phương pháp làm khớp đường phân rã huỳnh quang thích hợp để tính xác thời gian sống huỳnh quang sai số đường khớp với đường thực nghiệm nhỏ 37 KẾT LUẬN Với mẫu chấm lượng tử, hạt nano vàng, chất màu cung cấp từ viện Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, tiến hành đo phổ hấp thụ, phổ huỳnh quang thời gian sống huỳnh quang thu số kết sau đây: - Nghiên cứu lý thuyết truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang - Xây dựng phương pháp thực nghiệm nghiên cứu truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang phương pháp huỳnh quang phân giải theo thời gian - Tiến hành nghiên cứu truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang cặp donor-acceptor là: chất màu Rhodamin 6G hạt nano vàng; Rhodamin 6G chấm lượng tử CdSe/ZnS môi trường dung mơi nước Q trình truyền lượng AuNPs với phân tử Rh6G: AuNPc tổng hợp dung dịch phún xạ plasma, khơng có chất hoạt động bề mặt Chúng quan sát thấy FRET Rhodamine-6G AuNPs Sự thay thời gian sống huỳnh quang tăng nồng độ AuNPs Tính tốn chuyển giao lượng hiệu (tối đa 72%), ước lượng khoảng cách truyền lượng R / R0 = 0,92 Nghiên cứu mở việc áp dụng vật liệu nano tạo cách tổng hợp dung dịch nano phún xạ plasma cho FRET Quá trình truyền lượng Rhodamin 6G chấm lượng tử CdSe/ZnS Chấm lượng tử CdSe/ZnS chế tạo phương pháp hóa ướt.Chấm lượng tử sau chế tạo phân tán tốt mơi trường nước Chúng quan sát thấy FRET Rhodamin 6G chấm lượng tử CdSe/ZnS Sự thay đổi thời gian sống huỳnh quang tăng nồng độ CdSe/ZnS Hiệu suất truyền lượng tốt (21%) 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Förster T Ann Phys 1948; 437:55 Thi Thanh Hop Tran, Thi Mai Huong Do, Mai Ha Hoang, Duc Tuyen Nguyen, Quang Tuan Le, Duc Nghia Nguyen and Trinh Tung Ngo, Adv Nat Sci.: Nanosci, Nanotechnol, 2015, 6, 025007 Duc Nghia Nguyen, Trinh Tung Ngo and Quang Liem Nguyen, Adv Nat Sci.: Nanosci, Nanotechnol, 2012,3, 035011 Mikhail Y Berezin and Samuel Achilefu, Chem Rev, 2010, 5, 2641–2684 Dibyendu Dey, D Bhattacharjee, S Chakraborty, Syed Arshad Hussain, Journal of Photochemistry and Photobiology, A: Chemistry, 2013, 252, 174– 182 M G Williams, R D Tomlinson, and M J Hampshire, Solid State Commun, 2003, 7, 1831 J R Lakowicz , Principles of Fluorescence Spectroscopy - 3rd Ed Springer, New York, 2006, Ch 13 Clare Higgins, Manuela Lunz, A Louise Bradley, Valerie A Gerard, Stephen Byrne, Yurii K Gun’ko, Vladimir Lesnyak, and Nikolai Gaponik, Optics express, 2010, vol 18, 24486 Sangeeta Saini, Harjinder Singh and Biman Bagchi, Fluorescence resonance energy transfer (FRET) in chemistry and biology: Non-Förster distance dependence of the FRET rate, January 2006, 23–35 10 Robert M Clegg, Fluorescence resonance energy transfer 1995, 6,103-l10 11 Robert M Clegg, THE HISTORY OF FRET: From conception through the labors of birth 12 David L Andrews Chapter 14 Resonance Energy Transfer: Theoretical Foundations and Developing Applications 13 Aaron R Clapp, Igor L Medintz, J Matthew Mauro, Brent R Fisher, Moungi G Bawendi, and Hedi Mattoussi Fluorescence Resonance Energy Transfer Between Quantum Dot Donors and Dye-Labeled Protein Acceptors Published on Web 12/13/2003 14 Kenny F Chou and Allison M Dennis Förster Resonance Energy Transfer between Quantum Dot Donors and Quantum Dot Acceptors 2015, 15, 1328839 13325 15 Nai-Tzu Chen , Shih-Hsun Cheng , Ching-Ping Liu , Jeffrey S Souris , Chen-Tu Chen , Chung-Yuan Mou and Leu-Wei Lo Recent Advances in NanoparticleBased Förster Resonance Energy Transfer for Biosensing, Molecular Imaging and Drug Release Profiling Int J Mol Sci 2012, 13, 16598-16623 16 Roi Baer, and Eran Rabani Theory of resonance energy transfer involving nanocrystals: The role of high multipoles 14 May 2008 17 W Becker , Advanced time-correlated single photon counting techniques, Springer, 2005 18 http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/applications/fretintro.h tml 19 James E Martin, Lauren E Shea-Rohwer, Journal of Luminescence, 2006, 121, 573 20 A F van Driel, G Allan, C Delerue, P Lodahl, W L Vos, and D Vanmaekelbergh, Phys Rev Lett, 2005, 95, 236-804 21 A F van Driel, I S Nikolaev, P Vergeer, P Lodahl, D Vanmaekelbergh, and W L Vos, Phys Rev B, 2007, 75, 035-329 22 Chu viet Ha, Nguyen Thi bich Ngọc, Nghiem Thị Ha Lien, Vu Thi Kim Lien an Tran Hong Nhung, Ad In Optics, Photonics, Spectroscopy & Applycations VIII, 2015, 272 23 Jaba Saha, DibyenduDey, ArpanDattaRoy, D.Bhattacharjee, Syed Arshad Hussain, Journal of Luminescence, 2016, 172, 168–174 24 M Chao, Z.Fang, H.Lifang, W.Shuizhu, J.Phys Chem B, 2011, 115, 874 40 ... đây: - Nghiên cứu lý thuyết truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang - Xây dựng phương pháp thực nghiệm nghiên cứu truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang phương pháp huỳnh quang phân giải theo thời gian. .. sử dụng nghiên cứu quang phổ phân giải thời gian vật liệu cấu trúc nano 2.3.2 Hệ đo huỳnh quang phân giải thời gian - TCSPC ❖ Cấu tạo nguyên lý kỹ thuật TCSPC Trong phép đo huỳnh quang phân giải. .. chậm thời gian sống trung bình Sự phân bố thời gian photon phát xạ đường suy giảm cường độ phát quang Có hai phương pháp đo huỳnh quang phân giải thời gian phương pháp miền tần số phương pháp