Luận án phân lập một số hợp chất taxoid từ lá thông đỏ lá dài (taxus wallichiana zucc ) trồng ở lâm đồng, định hướng thiết lập chất đối chiếu

1 MỞ ĐẦU Theo nhà khoa học, loài Thơng đỏ (Taxus sp.) có chứa taxoid nhóm hợp chất yếu gờm paclitaxel, 10-deacetyl baccatin III (10-DAB, tiền chất tởng hợp paclitaxel) để sản xuất Taxol® dẫn xuất taxoid khác Hiện nay, taxol sử dụng nguyên liệu để điều chế thuốc chữa trị ung thư như: Ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi, v.v [91] Các nhà khoa học ở Mỹ số nước châu Âu thành công việc chiết xuất taxol taxoid từ vỏ cây; cơng nghệ làm nhanh lão hóa gây cạn kiệt nguồn cung cấp Người ta phải đốn - Thông đỏ 100 năm tuổi mới có đủ lượng taxol phân lập từ vỏ để điều trị cho bệnh nhân ung thư [97] Do có giá trị kinh tế cao nên Thơng đỏ bị lạm dụng khai thác, đặc biệt ở vùng Himalaya Trung Quốc, nguồn dược liệu thiên nhiên trở nên khan bị đe dọa tuyệt chủng [2] Năm 2011, sách đỏ IUCN công bố Taxus wallichiana lồi có nguy tuyệt chủng [50], [97] Do đó, để có đủ lượng taxol cho sản xuất thuốc, ngồi việc tởng hợp trực tiếp taxol nhà khoa học quan tâm ý nhiều đến bán tổng hợp taxol từ taxoid khác phân lập từ Thơng đỏ Ngồi ng̀n ngun liệu từ vỏ, người ta thu lượng 10-DAB ở cành Thông đỏ nhiều so với ở vỏ [97] Ở Việt Nam, Thông đỏ dài (Taxus wallichiana Zucc.) loài chỉ mới gặp ở Lâm Đờng với số cịn lại ước tính chỉ 250 [7] Năm 2007, sách đỏ Việt Nam, Thơng đỏ xếp vào cấp VU – lồi nguy cấp; cịn Nghị định 32/2006/NĐ-CP Chính phủ Thơng đỏ xếp vào nhóm IA – nghiêm cấm khai thác, sử dụng mục đích thương mại [2] Do đó, để khai thác ng̀n ngun liệu q mà không ảnh hưởng đến vùng phân bố tự nhiên lồi Thơng đỏ này, Trung tâm trờng chế biến thuốc Đà Lạt trồng Thông đỏ bước đầu cung cấp nguyên liệu phục vụ cho chiết tách taxol hợp chất taxoid sản xuất thuốc điều trị ung thư [5] Bên cạnh đó, nhà khoa học Việt Nam tiến hành vài nghiên cứu chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hoạt chất sinh học từ Thông đỏ dài trồng ở Lâm Đồng [6], [8] Tuy nhiên, Thông đỏ dài chưa nghiên cứu đầy đủ thành phần hợp chất taxoid để có sở xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguồn nguyên liệu taxol Việt Nam Vì thế, đề tài: “Phân lập số hợp chất taxoid từ Thông đỏ dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng ở Lâm Đồng, định hướng thiết lập chất đối chiếu” thực với mục tiêu sau: Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc số hợp chất taxoid từ Thông đỏ dài trồng ở Lâm Đồng Thiết lập số chất đối chiếu phân lập từ Thông đỏ dài trồng ở Lâm Đồng phục vụ công tác kiểm nghiệm Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đờng thời taxol số taxoid phân lập từ Thông đỏ dài trồng ở Lâm Đồng CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THÔNG ĐỎ LÁ DÀI Tên gọi Tên khoa học: Taxus wallichiana Zucc [1], [2], [3] Tên nước ngoài: Himalayan yew (Anh), Xu mi hong dou shan (Trung Quốc) Tên Việt Nam: Thông đỏ dài, Thông đỏ nam, Thông đỏ Hymalaya, sam hạt đỏ dài, vân nam hồng đậu sam [1], [2], [3] Trong hệ thống phân loại thực vật quốc tế, thông đỏ dài thuộc [1], [2], [3]: Ngành: Thông (Pinophyta) Lớp: Thông (Pinopsida) Bộ: Thủy tùng (Taxales) Họ: Thủy tùng hay Thơng đỏ (Taxaceae) Chi: Taxus Lồi: Taxus wallichiana Zucc Mô tả thực vật Cây gỗ to cao đến 20 m, đường kính thân 40 – 50 cm Thân có vỏ màu hờng xám, phân nhiều cành mảnh, non màu lục Lá mọc so le, không cuống, thường xếp thành dãy kép, hình dải hẹp, dáng cong, dài 2,5 – cm, rộng – mm, gốc thuôn, đầu nhọn, mặt lõm lịng thuyền, mặt dưới có hai dãy lỗ khí Cụm hoa đơn tính, khác gốc Nón đực hình chùy mọc đơn độc ở nách lá, kèm theo ở gốc bắc lợp Nón gờm nhánh ngắn, có vảy dạng gai lợp, xếp thành dãy đứng; mọc đơn độc đỉnh cành ngắn tại bên trục hoa Hạt hình trứng dài, nằm vỏ hạt giả hình đấu chín mọng màu đỏ tươi, có cạnh, dài khoảng – mm [1], [2], [3] Phân bố, sinh thái Ở Việt Nam chi Taxus có lồi Taxus chinensis thường gọi “Thông đỏ ngắn” Taxus wallichiana Zucc gọi “Thông đỏ dài” [1], [2] Hình 1.1 Thơng đỏ dài mọc tự nhiên Hình 1.2 Thơng đỏ dài trồng Lâm Đồng Lâm Đồng Nguồn: Hình 1.1 1.2 theo tác giả Trần Công Luận [6] Thông đỏ dài: Phân bố ở Nepan (vùng núi Hymalaya), phía bắc Myanmar, Đông Nam Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Philippin Việt Nam Ở Việt Nam, loài chỉ thấy ở số vùng núi cao thuộc tỉnh Khánh Hòa, Lâm Đồng (Đà Lạt, Đơn Dương), Hà Giang (Thái An – Quản Bạ), độ cao phân bố từ 1400 – 1600 m [1], [2] Thông đỏ thường non vào mùa xuân – hè, nón đực xuất sớm nón từ cuối mùa đơng, đến mùa xuân năm sau nón đực nón mới nở Thơng đỏ sinh trưởng chậm, tái sinh tự nhiên từ hạt khó Tuy vậy, đỉnh núi có vài to, thấy mọc từ hạt Vài năm gần đây, số sở nghiên cứu ở Hà Nội Đà Lạt thí nghiệm thành cơng việc nhân giống Thơng đỏ bằng cành [6] Các lồi Thơng đỏ giới Trên giới, theo Spjut chi Taxus có 24 loài (species) 55 thứ (varieties) phân loại thành ba nhóm, hai nhóm số có ng̀n gốc từ Bắc Mỹ: (1) Nhóm Baccata, đại diện Thông đỏ Canada (Taxus canadensis) nhiều giống trồng có liên quan: T baccata, T biternata, T caespitosa, T cuspidata, T recurvata T umbraculifera (2) Nhóm Wallichiana, đại diện Thơng đỏ Florida địa (Taxus continosa var floridana), Thông đỏ Mesoamerican (T continosa var continosa) Thơng đỏ Thái Bình Dương (T brevifolia), bao gờm hai thứ (var polychaeta, var reptaneta) [94] Nhóm Wallichiana coi tở tiên nhóm khác bởi cấu tạo có tế bào biểu bì góc nhìn thấy ở mặt cắt ngang (phần T), có nhú (papillose) đờng bề mặt bao quanh bởi biên hẹp tế bào trơn nhẵn, thường tế bào Trong vi phẫu mặt cắt ngang (phần T) ở Hình 1.3.a Hình 1.3.b phần biểu bì mặt dưới từ mép trái đến gân Taxus caespitosa var latifolia, phóng to tương ứng ×100 ×250, phía cho thấy tế bào biểu bì hình elip Quan sát vùng biên tám (8) hình thang nhẵn với có chiều rộng gần hình chữ nhật, khơng có (0) vùng chuyển tiếp tế bào nhú (papillose); dải 14 hàng lỗ khí, gân có 15-18 tế bào theo chiều rộng, khơng có nhú phần dải lỗ khí thứ hai (1 hàng lỗ khí) Các tế bào màu cam tế bào phụ bao quanh lỗ mở (“nhẫn Florin”) Lỗ khí bao quanh bởi tế bào bảo vệ chìm khơng thể nhìn thấy Các tế bào xung quanh nhú gọi tế bào phụ Chi Taxus xác định bởi dải nhú - lỗ khí chỉ có ở mặt dưới Nhóm Wallichiana bao gờm phân nhóm Chinensis Wallichiana; tìm thấy ở châu Á Bắc Mỹ, phân nhóm Wallichiana nhận biết nhờ tế bào biểu bì có hình tứ giác hình chữ nhật cao thấy mặt cắt ngang (phần T), có xu hướng vng góc với bề mặt lỗ khí; nhánh màu đỏ tía Ở phân nhóm Chinensis, xuất chủ yếu ở khu vực từ miền trung Trung Quốc đến Indonesia, tế bào biểu bì hình elip hình chữ nhật rộng, xu hướng song song với bề mặt lỗ khí (các lỗ khí vng góc với bề mặt thường định hướng kéo dài theo chiều dọc phía mép thường thẳng hàng theo hàng ngang hàng dọc) nhánh màu xanh đến màu vàng cam (a) (b) Hình 1.3 Vi phẫu Taxus caespitosa var latifolia Nguồn: Hình 1.3.a vẽ Karen Parker; Hình 1.3.b Spjut vẽ [94] Nhóm Baccata có ng̀n gốc từ nhóm Wallichiana dần lỗ khí nhú, khác biệt bởi tế bào biểu bì hình elip nhỏ (trong phần T), nhú kém phát triển gân ở Nhóm thứ ba (3) nhóm Sumatrana, dường tiến hóa nhờ tế bào biểu bì biệt hóa vùng mép lá, thường xuất màu đỏ bóng mẫu vật khơ Vùng mép có chiều rộng thay đổi từ – 36 dãy tế bào, gần nửa số tế bào gần dải lỗ khí phát triển thành nhú, thường không 12 dãy tế bào Bằng chứng sinh học cổ xưa khác Taxaceae ở Bắc Mỹ hạt Manchester (1994) [67] mô tả T masonii, Torreya clarnensis chi mới Taxaceae, Diploporus, từ hạt ở Thủy Tân (Eocene) ở Oregon Sự khác biệt T masonii với lồi cịn tờn tại có liên quan dựa đối xứng hai bên hạt, bề mặt cắt ngang hình thấu kính, hạt T chinensis T recurvata (Thông đỏ Anh quốc) cho thấy xu hướng đối xứng hai bên với phát triển bề mặt dạng lăng trụ (xem Hình 1.4) Thơng đỏ châu Âu (T baccata) Thơng đỏ Canada (T canadensis) thường có hạt hình khối trụ với bề mặt nhẵn bóng, nhọn ở đỉnh, hạt lồi Thơng đỏ khác ở châu Âu - Địa Trung Hải có hình nón, xẻ thùy khơng có đỉnh nhọn - có hình dạng giống ớt chng (ví dụ, T baccata từ Iran) Khu vực từ Tây Tứ Xuyên (Trung Quốc) với đại diện T chinensis, đến Đông Nam nước Nga với đại diện bởi T umbraculifera var microcarpa, hạt trở nên nhỏ hình nón ngày hẹp phía đỉnh Khác với hạt có hình trứng có 3-4 cạnh T kingstonii Spjut ở Đơng Himalaya (Hình 1.4), hạt có 3-4 thùy T biternata ở vùng ơn đới ở phía Đơng Á hạt hình cầu khác ở Nhóm T sumatrana (xem Hình 1.4 với T celebica, T mairei var speciosa (Florin) Spjut ở Đơng Nam Trung Quốc) Hạt hình nón tương đối nhỏ đặc điểm phân loại để nhận biết T umbraculifera var microcarpa T caespitosa minor subpyramidalis mairei contorta baccata glauca linearis kingstonii celebica mairei mairei chinensis umbraculifera microcarpa caespitosa Hình 1.4 Các dạng hạt Taxus sp Chú thích ảnh: Hàng từ trái sang phải: (1) T canadensis var minor từ Maine (Ovis, Island, Mỹ, True 164); (2) T contorta từ Tây Bắc Himalaya, Chumba (Pengelly); (3) T baccata var baccata từ Ma rốc (Haut 938); (4) var glauca, từ Armenia (Szovich 610), (5) T recurvata var linearis Spjut từ Rumani (Barabas) Hàng giữa: (6) T baccata var subpyramidalis Jacques ex Carrière từ Iran (Koelz 16028); (7) T kingstonii Spjut từ Khasia, Ấn Độ (Mann); (8) T celebica từ Quý Châu, Trung Quốc (Steward cs 328); (9) T mairei var speciosa từ Tứ Xuyên, Trung Quốc (Fang 3442); (10); var mairei, từ Quý Châu (Sino-Amer Exped 1046) Hàng cuối: (11) var mairei từ Hồ Nam, Trung Quốc (Hu 644); (12) T chinensis từ Quý Châu (Sino-Amer Exped 1854); (13) T umbraculifera var nana từ Nhật Bản (Muroi 5933); (14) var microcarpa từ Nhật Bản (Đại học Nông nghiệp Sapporo); (15): T caespitosa từ Nhật Bản (Mizushima 1985) [95] Nguồn: Hình 1.4 theo tác giả Spjut [95] Các lồi Thơng đỏ châu Á Theo Spjut (2010), Taxus chinensis, T contorta, T wallichiana loài liên quan cho tiến hóa ở vùng địa lý - sinh thái khác biệt ở châu Á, trì tương đối ổn định thời gian dài ở Kỷ Đệ tam (khoảng 200 đến 251 triệu năm trước) [96] Sự khơ cằn khí hậu lạnh thời kỳ Neogene (khoảng 23,03 ± 0,05 triệu năm trước) (Axelrod 1975) dẫn đến hình thành đặc điểm phân nhánh Taxus ngày thấy phức hợp lồi ơn đới cận nhiệt đới ở châu Á [16] Taxus chinensis giữ vị trí trung tâm đối với phức hợp khác nhau, thơng tin thu thập cịn Taxus wallichiana Zuccarini, T contorta Griffith T chinensis (Pilger) Rehder ba loài dãy Hy Mã Lạp Sơn Tây Nam Trung Quốc trước bị nhầm lẫn hiểu nhầm phân loại dùng sai tên Sự nhầm lẫn dẫn đến đặt tên khác không cần thiết là: T fuana Nan Li & R R Mill T yunnanensis W C Cheng & L K Fu, sau phân loại thứ: T contorta var mucronata Spjut, T wallichiana var yunnanensis (W C Cheng & L K Fu) C T Kuan Cách phân loại lồi Thơng đỏ phân biệt rõ nhờ đặc điểm hình thái số mơ tả chi tiết Mơ tả lồi Thơng đỏ châu Á xác định bởi đặc điểm dựa liệu từ mẫu vật khơ ở vị trí địa lý tương quan với kiểu thảm thực vật xung quanh Taxus; khác biệt màu sắc so với mẫu vật tươi (Spjut) [96] Những đặc điểm nổi bật trình bày dưới chỉ liên quan đến ba lồi Taxus ở khu vực châu Á Lá mọc kiểu xoắn ốc thường xoắn dọc theo cuống phiến rời tỏa hai bên Đặc điểm ba loài thứ dưới loài (var.) Thơng đỏ châu Á tóm gọn theo thứ tự ưu tiên: (1) T contorta, (2) T chinensis (3) T wallichiana T contorta có khơ với tế bào nhu mô lỏng lẻo, màu đỏ sẫm, giống vỏ trứng vỡ, thường rơi cắt lá; (5-) 7-8 (-11) hàng/ dãy lỗ khí; tế bào biểu bì thường hình elip mặt cắt ngang, đặc biệt mẫu ở Tây Bắc Himalaya; hạt hình khối trụ hay hình cầu (Hình 1.5) T contorta var contorta có dài chiều rộng 12 lần hay hơn, thẳng thon dài, tỏa rộng bằng cuống lá, cuống cong (Hình 1.5); 5- (9-11) hàng/ dãy lỗ khí; phân bố ở Afghanistan, Pakistan, Ấn Độ Tây Nepal T contorta var mucronate có dài - 10 lần so với chiều rộng, cuống uốn cong rõ (Hình 1.6); - 11 hàng/ dãy lỗ khí; phân bố ở Nepal, Tây Nam Tây Tạng Bhutan T chinensis có khơ với tế bào nhu mơ kết dính màu đỏ đến xanh; 11-21 hàng/dãy lỗ khí; tế bào biểu bì góc cạnh hình elip mặt cắt ngang lá; hạt hình nón, từ hạt thon dần đến đỉnh nhọn (Hình 1.7) Cành xanh nhạt có sọc màu vàng, màu sẫm dần từ nhánh non đến già; có vết tích vảy chời có khơng tờn tại (Hình 1.8); hình elip hẹp đến thn dài; tế bào biểu bì thường hình elip mặt cắt ngang, góc cạnh; mọc ở Việt Nam Trung Quốc T wallichiana có cành già khơng có sọc màu vàng, thường đột ngột sẫm màu từ màu vàng lục đến màu nâu sẫm ở năm thứ 2, màu đỏ cam mẫu vật từ Đông bắc Ấn Độ; vảy nụ thường tồn tại ở gốc cành; giống nhọn (Hình 1.9); hầu hết dải hẹp có gân hình cung gần gốc lá; tế bào biểu bì chủ yếu góc cạnh mặt cắt ngang Lá T wallichiana var yunnanensis hình giáo nhỏ (lá dài đáng kể so với chiều rộng rộng ở giữa, nhọn dần phía đỉnh) ở mẫu từ Tứ Xuyên 10 Vân Nam (Hình 1.10), dạng dải hẹp mẫu từ Đông bắc Ấn Độ đến Tây Tạng; mặt cắt ngang dài hẹp tới mép lá; tế bào biểu bì mặt cắt ngang thường mở rộng dọc theo mặt dưới, rộng 35 – 50 µm, nhú hầu hết đối diện mép gân lá; phân bố ở Đông bắc Ấn Độ, Myanmar, Đông Nam Tây Tạng Vân Nam Trung Quốc Lá T wallichiana var wallichiana có dạng dải hẹp (Hình 1.11); mặt cắt ngang không thon dài đến mép; tế bào biểu bì mặt dưới mặt cắt ngang khơng mở rộng, nói chung ngắn so với tế bào biểu bì mặt trên, rộng 15 – 25 µm; chiều dài tế bào giảm gần mép; nhú thay hầu hết tế bào gân mép dọc theo màng tế bào; phân bố ở Đông Bắc Ấn Độ, Nepal, Bhutan, Myanmar, Tứ Xuyên Vân Nam Hình 1.5 Lá hạt Taxus contorta var contorta Chú thích ảnh: Hình trái: cho thấy thẳng thuôn dài, (Stainton 5616), mẫu vật từ Nepal (BM) Hình phải: hạt hình khối trụ, Pingelly s.n., mẫu vật từ Ấn Độ (K) Hình 1.6 Dạng Taxus contorta Hình 1.7 Taxus chinensis với hạt có var mucronata có uốn cong, từ Bhutan đầu nhọn, từ Quý Châu, Trung Quốc PL-89 PL-90 PL-91 PL-92 PL3- Thiết lập chất đối chiếu • Kiểm tra nguyên liệu 10-deacetyl taxinine B bằng phương pháp HPLC PL-93 PL-94 • Kiểm tra nguyên liệu taxinine B bằng phương pháp HPLC PL-95 PL-96 PL3.2- Phiếu phân tích PTN đạt GLP PL-97 PL-98 PL-99 PL4- Thẩm định quy trình định lượng đồng thời PL-100 PL-101 PL-102 PL-103 ... tài: ? ?Phân lập số hợp chất taxoid từ Thông đỏ dài (Taxus wallichiana Zucc. ) trồng ở Lâm Đồng, định hướng thiết lập chất đối chiếu? ?? thực với mục tiêu sau: Chiết xuất, phân lập xác định cấu... trúc số hợp chất taxoid từ Thông đỏ dài trồng ở Lâm Đồng Thiết lập số chất đối chiếu phân lập từ Thông đỏ dài trồng ở Lâm Đồng phục vụ công tác kiểm nghiệm Xây dựng thẩm định quy trình định. .. xử lý SKC (75 g) CHCl3:MeOH (90:1 0) SKC (50 g) CH2Cl2:Aceton (100: 5) Pđ Tw 1-1 ? ?hợp chất ( 1) Pđ Tw 2-1 Pđ Tw 1-2 ? ?hợp chất ( 2) → hợp chất ( 4) hợp chất ( 5) Pđ Tw 1-3 ? ?hợp chất ( 3) Sơ đồ 3.1 Quy