Luận án nghiên cứu một số vật liệu polyme tiên tiến, thân thiện môi trường và ứng dụng trong chế tạo bầu ươm c

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 13 C-NMR : Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon) H-1H-COSY : 1H-1H Correlated Spectroscopy (Phổ tương tác proton-proton) H-NMR : Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 7-MCPA : 7-methoxy-(9H-b-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid ATCC Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ CĐHST : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật Chất (1) : 7-MCPA Chất (2) : 9-methoxycanthin-6-one Chất (3) : 9-hydroxycanthin-6-one d : Dublet dd : Dublet dublet DEPT : Distortionless Enhancement By polarization Transfer (Phổ DEPT) ĐK-Bb : Xây dựng phương pháp phân tích mẫu Bá bệnh HPLC DMSO : Dimethyl sulfoxyde dq : Dublet quartet dt : Dublet triplet HepG2 : Dòng tế bào ung thư gan HPLC : High performance liquid chromatography (sắc ký lỏng hiệu cao) HSQC : Heteronuclear Spectroscopy Quantum Coherence (Phổ tương tác dị hạt nhân) IC50 : Nồng độ ức chế 50% phát triển cá thể nghiên cứu J(Hz) : Hằng số tương tác tính Hz JA : Jasmonic acid KB : Dịng tế bào ung thư biểu mơ vi KLK : Khối lượng khô KLT : Khối lượng tươi LPS : Escherichia coli 055:B5 LPS : Lipopolysaccharide LU-1 : Dòng tế bào ung thư phổi m : Multiplet MCF-7 : Dịng tế bào ung thư vú MS : Mơi trường Murashige Skoog – 1962 MS : Murashige & Skoog, 1962 MTT : (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl bromide) NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân PBS : Huyết bò (fetal bovine serum) q Rễ TN : Quartet : Rễ tự nhiên S : singulet SA : Salicylic acid SH : Môi trường Schenk Hildebrandt - 1972 SH : Schenk and Hidebrandt, 1972 t : Triplet TCA : Acid tricloacetic TLC : Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng) Trypsin EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid WPM : Môi trường McCown’s Woody Plant - 1981 WPM : McCown’s Woody Plant, 1981 YE : Yeast extract (dịch chiết nấm men) δ (ppm) : Độ chuyển dịch hóa học tính ppm vii tetrazolium DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các thành phần hoá học phân lập từ Bá bệnh tác dụng dược lý chúng Bảng 1.2 Sản xuất hợp chất thứ cấp kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ từ số loài thuốc Bảng 3.1 25 Kết thử hoạt tính độc tế bào ung thư chất thử (1), (2), (3) Bảng 3.2 10 47 Kết xác định nồng độ ức chế sản xuất 50 % IL-6 TNF-α tế bào 51 Bảng 3.3 Kết xây dựng đường chuẩn ba alkaloid (1), (2), (3) 55 Bảng 3.4 Sự phát triển rễ tơ Bá bệnh môi trường lỏng thạch 57 Bảng 3.5 Sự phát triển rễ tơ điều kiện tối sáng 59 Bảng 3.6 Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng phát triển rễ tơ 60 Bảng 3.7 Sự phát triển rễ tơ 100 ml môi trường 62 Bảng 3.8 Ảnh hưởng mơi trường khống đến sinh trưởng phát triển Bảng 3.9 rễ tơ 63 Ảnh hưởng môi trường khống đến tích luỹ chất 7MCPA 65 Bảng 3.10 Ảnh hưởng mơi trường khống đến tích luỹ 9- methoxycanthin-6-one 65 Bảng 3.11 Ảnh hưởng mơi trường khống đến tích luỹ chất 9hdroxycanthin-6-one 66 Bảng 3.12 Ảnh hưởng JA lên sinh trưởng tích luỹ alkaloid rễ tơ Bá bệnh 70 Bảng 3.13 Ảnh hưởng SA lên sinh trưởng tích luỹ alkaloid rễ tơ Bá bệnh 73 Bảng 3.14 Ảnh hưởng YE lên sinh trưởng tích luỹ alkaloid rễ tơ Bá bệnh 76 Bảng 3.15 Hiệu tác động elicitor lên tích luỹ alkaloid 80 viii Bảng 3.16 Kết sau 30 ngày nuôi cấy rễ tơ hệ thống bioreactor tự tạo 20 lít 86 Bảng 3.17 Hàm lượng alkaloid có rễ tơ rễ tự nhiên 87 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái Bá bệnh Hình 1.2 Minh hoạ số sản phẩm sản xuất từ Bá bênh 14 Hình 1.3 Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu 18 Hình 1.4 Cơ chế tác động lên tế bào elicitor 21 Hình 1.5 Sinh khối rễ tơ Bá bệnh 90 g 28 Hình 2.1 Rễ tơ ni cấy môi trường WPM 27 Hình 2.2 Rễ tơ Bá bệnh ni cấy mơi trường WPM 27 Hình 2.3 Quy trình chiết cao alkaloid từ sinh khối rễ tơ Bá bệnh 31 Hình 2.4 Sơ đồ phân lập chất từ cao chiết alkaloid 32 Hình 2.5 Mơ phận hệ thống bioreactor 20 lít sủi bọt 42 dạng cầu tự tạo Hình 3.1 Sắc ký cột sắc ký mỏng số phân đoạn cao chiết 43 alkaloid Hình 3.2 Sắc ký mỏng chất (1), (2), (3) phân lập từ cao chiết 47 methanol rễ tơ Bá bệnh Hình 3.4 Ảnh hưởng chất 7-MCPA dịng tế bào ung thư vú MCF-7 49 Hình 3.5 Ảnh hưởng chất 9-methoxycanthin-6-one dòng tế bào 49 ung thư vú MCF-7 Hình 3.5 Kết ảnh hưởng chất (1), (2), (3) lên sống tế bào đại thực bào chuột người Hình 3.6 Chất 7-MCPA ức chế sản xuất IL-6 TNF-α tế bào đại thực vào chuột người kích hoạt LPS Hình 3.7 Hình 3.9 52 Chất 9-methoxycanthin-6-one ức chế sản xuất IL-6 TNF-α tế bào đại thực vào chuột người kích hoạt LPS Hình 3.8 50 52 Chất 9-hydroxycanthin-6-one ức chế sản xuất IL-6 TNF-α tế bào đại thực bào chuột người kích hoạt LPS 53 Sắc ký đồ chất chuẩn (1), (2), (3), 54 Hình 3.10 Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan diện tích pic với nồng độ chất chuẩn x 56 Hình 3.11 Sự phát triển rễ tơ mơi trường lỏng thạch 57 Hình 3.12 Sự phát triển rễ tơ điều kiện tối sáng 59 Hình 3.13 Quá trình mọc đầu sinh trưởng đoạn rễ tơ cắt với kích thước khác 60 Hình 3.14 Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng phát triển rễ tơ 60 Hình 3.15 Sự phát triển rễ tơ 100 ml môi trường với lượng rễ ban đầu khác 62 Hình 3.16 Ảnh hưởng mơi trường khống đến sinh trưởng phát triển rễ tơ 64 Hình 3.17 Sắc ký HPLC rễ tơ nuôi cấy môi trường WP 68 Hình 3.18 Ảnh hưởng JA lên sinh trưởng tích luỹ alkaloid rễ tơ Bá bệnh 71 Hình 3.19 Sắc ký HPLC thể hàm lượng alkaloid có rễ tơ ni cấy môi trường WPM bổ sung mg/l JA 72 Hình 3.20 Ảnh hưởng SA lên sinh trưởng tích luỹ alkaloid rễ tơ Bá bệnh 75 Hình 3.21 Sắc ký HPLC thể hàm lượng alkaloid có rễ tơ ni cấy môi trường WPM bổ sung mg/l SA 75 Hình 3.22 Ảnh hưởng dịch chiết nấm men lên sinh trưởng tích luỹ alkaloid rễ tơ Bá bệnh 77 Hình 3.23 Sắc ký HPLC thể hàm lượng alkaloid mẫu rễ tơ nuôi cấy môi trường WPM bổ sung 40 mg/l YE 79 Hình 3.24 Nguồn mẫu ban đầu… 82 Hình 3.25 Chuẩn bị bình ni cấy bioreactor 20 lít 82 Hình 3.26 Bình thuỷ tinh 20 lít chứa 9,8 lít mơi trường 83 Hình 3.27 Chuyển mơi trường vào bình bioreactor 20 lít 83 Hình 3.28 Quy trình ni cấy rễ tơ hệ thống Bioreactor 20 lít 85 Hình 3.29 Ni cấy rễ tơ hệ thống bioreactor 20 lít 86 Hình 3.30 Hàm lượng alkaloid tích luỹ rễ tơ rễ tự nhiên 87 xi Hình 3.31 Sắc ký mỏng alkaloid, cao chiết tổng MeOH rễ tơ 88 rễ TN Bá bệnh Hình 3.32 (A) (B) Sắc ký HPLC mẫu rễ tơ ni cấy hệ thống bioreactor 20 lít rễ tự nhiên Bá bệnh xii 89 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) thuốc phổ biến nước ta, phân bố chủ yếu tỉnh miền Trung, Kon tum, Đồng Nai, Phú Quốc Vườn quốc gia Bái Tử Long Cây Bá bệnh dùng bồi bổ sức khoẻ, tăng lượng testosterone nam giới, có hoạt tính kháng viêm mạnh, chống ung thư tốt số tác dụng khác chữa sốt rét, chống lỗng xương, trị tiểu đường Các cơng trình nghiên cứu Bá bệnh cho thấy có chứa nhiều hoạt chất alkaloid có giá trị kháng sốt rét, chống viêm, gây độc tế bào ung thư tăng cường sinh lực… Hiện nay, Bá bệnh bị khai thác mức tự nhiên nhu cầu sử dụng thảo dược ngày tăng Hơn nữa, Bá bệnh khó ni trồng nhân rộng, với thời gian thu hoạch rễ có chất lượng phải cần 5-6 năm dẫn tới nguồn nguyên liệu cung cấp cho sản xuất dược phẩm cịn gặp nhiều khó khăn Đến nay, nuôi cấy rễ xem giải pháp thay đầy tiềm để thu nhận ổn định lượng lớn sinh khối thời gian ngắn từ 30-40 ngày, làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược liệu Công nghệ nuôi cấy mô sẹo hay nuôi cấy huyền phù tế bào cần phải bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (CĐHST) Tuy nhiên, tồn dư CĐHST ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người sử dụng Vấn đề khắc phục nuôi cấy sinh khối rễ tơ rễ tơ sinh trưởng phát triển liên tục khơng cần bổ sung CĐHST Hơn thế, rễ tơ có nhiều ưu điểm khác sản xuất lượng lớn hợp chất thứ cấp có di truyền ổn định nuôi cấy tế bào huyền phù mô sẹo Trong nuôi cấy in vitro, việc gây kích kháng hay bổ sung elicitor giúp tăng đáng kể khả tích lũy hợp chất thứ cấp q trình nhân nhanh sinh khối rễ Ni cấy rễ tơ Bá bệnh in vitro, dù môi trường giàu dinh dưỡng giúp rễ phát triển nhanh, hàm lượng alkaloid phân tích thấp Hơn nữa, q trình tích lũy số chất khơng diễn thiếu số yếu tố kích kháng, dẫn đến hàm lượng alkaloid nội sinh thấp so với rễ thu tự nhiên Kể từ stress thay đổi ánh sáng, nhiệt độ hay tác động từ tác nhân gây hại trồng phát làm kích thích tích lũy hợp chất thứ cấp thơng qua đường truyền tín hiệu elicitor jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), yeast extract (YE)… kích hoạt biểu gen phòng vệ, đồng thời sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp Các elicitor ứng dụng rộng rãi vào nuôi cấy để gia tăng hoạt chất saponin ni cấy nhiều lồi dược liệu q Việc nghiên cứu bổ sung elicitor việc tăng cường khả tích lũy hợp chất thứ cấp ni cấy in vitro chưa có Kỹ thuật nuôi cấy mô đời mở cách mạng nhân giống thực vật Nhưng với phương pháp truyền thống ni cấy mơi trường thạch khó đáp ứng nhu cầu giống trồng cung cấp thị trường, giá thành lại cao; việc phải cấy chuyền, tách mẫu bên tủ cấy thực tay, tốn nhiều lao động lại dễ bị nhiễm Chính cần phải có hệ thống ni cấy tự động hóa giúp giảm thiểu nhân cơng, thời gian số lượng nhiều Trong nuôi cấy lỏng người ta chia ba loại nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc nuôi cấy Bioreactor, tất dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh quan Hiện có xu hướng dùng Bioreactor để nhân sinh khối rễ tơ nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp Xuất phát từ sở khoa học luận trên, tiến hành thực đề tài nhằm tìm kiếm alkaloid có hoạt tính sinh học đồng thời nghiên cứu hoạt tính từ alkaloid từ nghiên cứu ni cấy tăng tích luỹ hàm lượng alkaloid cách bổ sung elicitor Sau đó, rễ tơ nghiên cứu nhân sinh khối lớn phục vụ định hướng làm dược liệu cách tối ưu hoá hệ thống bioreactor 20 lít "Nghiên cứu tăng cường tích luỹ số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy hệ thống bioreactor 20 lít” Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát hoạt tính sinh học alkaloid phân lập từ rễ tơ Bá bệnh để tìm hoạt tính Xác định điều kiện ni cấy tối ưu để rễ tơ Bá bệnh sinh trưởng phát triển Xác định nồng độ ba elicitor (Salicylic acid, Jasmonic acid Yeat extract lên trình sản xuất tích luỹ alkaloid phân lập từ rễ tơ Bá bệnh in vitro Xây dựng thống bioreactor 20 lít để nhân sinh khối rễ tơ Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu thành phần hố học hoạt tính sinh học cao chiết alkaloid sinh khối rễ tơ Bá bệnh Nội dung 2: Nghiên cứu số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh trưởng rễ tơ tích luỹ alkaloid (1) 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid) (7-MCPA), (2) 9-methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one rễ tơ Bá bệnh Nội dung 3: Xây dựng kỹ thuật nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ Bá bệnh hệ thống bioreactor 20 lít Đánh giá hàm lượng alkaloid (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one có sinh khối thu ni cấy hệ thống bioreactor 20 lít so với rễ tự nhiên Ý nghĩa khoa học thực tiễn Ý nghĩa thực tiễn Luận án xác định môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy hệ thống nuôi cấy tối ưu cho rễ tơ Bá bệnh tăng sinh khối Đồng thời, luận án giúp nâng cao chất lượng rễ thông qua việc sử dụng elicitor để tăng hàm lượng alkaloid 7-MCPA, 9-methoxycanthin-one 9-hydroxycanthin-6-one Làm chủ công nghệ nuôi cấy sinh khối rễ tơ Bá bệnh hệ thống bioreactor 20 lít Kết luận án ứng dụng vào sản xuất sinh khối rễ tơ Bá bệnh quy mô lớn nhằm giải vấn đề khan nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược phẩm Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp dẫn liệu khoa học có giá trị nghiên cứu hoạt tính sinh học tăng cường tích lũy hợp chất alkaloid rễ tơ Bá bệnh Luận án thiết lập phương pháp nghiên cứu tăng sinh khối rễ tơ Bá bệnh Đồng thời luận án tài liệu tham khảo hữu ích cho việc nghiên cứu giảng dạy lĩnh vực hố sinh, sinh lý thực vật ni cấy mơ tế bào thực vật Những đóng góp luận án Phụ lục 1.13: Phổ 1H-NMR chất (2) Phụ lục 1.14: Phổ 1Hex1-NMR chất (2) Phụ lục 1.15: Phổ 13Cex1-NMR chất (2) Phụ lục 1.16: Phổ 13Cex2-NMR chất (2) Phụ lục 1.17: Phổ DEPT chất (2) Phụ lục 1.18: Phổ DEPTex chất (2) Phụ lục 1.19: Phổ MS chất (2) Phụ lục 1.20: Phổ 1H-NMR chất (3) 8.7 1.053 Phụ lục 1.21: Phổ 1Hex-NMR chất (3) 8.720 8.710 8.6 8.5 8.4 8.3 8.2 8.1 8.0 8.114 8.097 8.081 8.069 8.062 7.9 7.957 7.953 7.8 7.7 7.6 ELE.B34−DMSO−1H 1.031 2.041 1.019 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 1.025 1.028 ppm 6.983 6.978 6.966 6.961 6.933 6.913 Phụ lục 1.22: Phổ 13C-NMR chất (3) Phụ lục 1.23: Phổ 13Cex-NMR chất (3) Phụ lục 1.24: Phổ DEPT-NMR chất (3) Phụ lục 1.25: Phổ DEPTex-NMR chất (3) PHỤ LỤC II Bảng thành phần môi trường MS, WPM, SH Thành phần Murashige& McCown’s Schenk and Skoog Woody Plant Hidebrandt NH4NO3 1650 (20.6) 400 (5.0) - NH4H2PO4 - - 300 (2.6) NH4SO4 - - - CaCl2 H2O 332.2 (2.3) 96 (0.7) 151 (1.0) Ca(NO3)2 4H2O - 556 (2.4) - MgSO4 7H2O 370 (1.5) 370 (1.5) 400 (1.6) KCl - - - KNO3 1900 (18.8) - 2500 (24.8) K2SO4 - 990 - KH2PO4 170 (1.3) 170 (1.3) - NaH2PO4 - - - Na2SO4 - - - H3PO3 6.2 (100) 6.2 (100) (80) CoCl2 6H2O 0.0025 (0.1) - 0.1(0.4) CuSO4 5H2O 0.025 (0.1) 0.25 (1) 0.2(0.08) Na2EDTA 37.3 (100) 37.3 (100) 20.1 (54) Fe2(SO4)3 - - - FeSO4 7H2O 27.8 (100) 27.8 (100) 15 (54) MnSO4 H2O 16.9 (100) 22.3 (132) 10.0 (59) KI 0.83 (5) - NaMoO3 - - Macronutrients in mg/l (m/M) Micronutrient inmg/l (mM): 0.1 (0.6) - Na2MoO4 2H2O 0.25 (1) 0.25 (1) ZnSO4 7H2O 0.6 (30) 8.6 (30) 0.1 (0.4) 1(3) Organics in mg/l(mM) Myo – inositol 100 (550) Glycine 0.2 (26.6) 100 (550) 2.0 (26.6) 1000 (5500) - Nicotinic acid 0.5 (4.1) 0.5 (4.1) (4.1) Pyridoxine HCl 0.5 (4.4) 0.5 (4.4) 0.5 (2.4) Thiamin HCl 0.1 (0.3) 0.1 (0.3) 5.0 (14.8) Biotin - - - ... mơ vật liệu thích hợp cho tạo rễ tơ [55] Nhóm Phạm Bích Ngọc cs năm 2013 nghiên cứu thành công việc tạo rễ tơ từ Bá bệnh [56] 26 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên. .. số loài khác Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu rễ tơ lồi Bá bệnh Các nghiên cứu nước Bá bệnh dừng lại phân tích thành phần hóa học tác dụng dược lý, nghiên cứu rễ tơ số loài hạn chế Việc nghiên cứu. .. nguyên liệu cho công nghiệp dược phẩm mỹ phẩm 1.3.4.2 Tình hình nghiên cứu nước Hà Thị Loan cs, nghiên cứu tạo rễ tơ sâm Ngọc Linh Việt Nam Kết nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ tơ