Luận án nghiên cứu tổng hợp và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất quinazolin

MỞ ĐẦU Theo số liệu thống kê Globocan, biểu đồ bệnh ung thư toàn cầu năm 2008, ung thư phổi chiếm 13% tổng số ca bệnh 18,2% số ca tử vong Ung thư phổi bệnh nguy hiểm giới, ung thư phổi khơng phải tế bào nhỏ (UTPKPTBN) phổ biến xem bệnh nguy hiểm (Ung thư phổi không tế bào nhỏ bắt đầu hình thành từ tế bào khỏe mạnh phổi Vì lý đó, phần lớn hút thuốc tiếp xúc thường xuyên với khói thuốc lá, tế bào khỏe mạnh phân chia khơng kiểm sốt, từ hình thành khối u phổi Khối u lành tính ác tính) Căn bệnh gia tăng đáng kể nước thu nhập thấp trung bình Tại Việt Nam, ung thư phổi đứng hàng thứ số ca bệnh số lượng bệnh nhân tử vong tổng số loại ung thư hàng năm hai giới nam nữ Ung thư phổi chia làm hai loại: ung thư phổi tế bào nhỏ UTPKPTBN Mỗi loại phát triển theo cách khác hướng điều trị khác Trong đó, UTPKPTBN chiếm khoảng 80% tổng số ca bệnh ung thư phổi Việc điều trị UTPKPTBN thường biết đến với phương pháp hóa trị xạ trị Tuy nhiên, liệu pháp có số hạn chế khả kéo dài thời gian sống bệnh nhân thường ngắn, thông thường năm kèm với chất lượng sống bị ảnh hưởng nặng nề Người bệnh phải gánh chịu nhiều tác dụng phụ thuốc, đặc biệt tác dụng phụ tủy xương, gây tình trạng thiếu máu, chảy máu giảm sức đề kháng thể dẫn đến khả nhiễm khuẩn huyết làm cho bệnh nhân sớm tử vong Với UTPKPTBN có đột biến hoạt hóa EGFR làm cho bệnh với mức độ ác tính mạnh thời gian sống bệnh nhân ngắn hơn, khả đáp ứng với hóa trị liệu thơng thường Quinazoline lớp chất đầy tiềm thiết kế tổng hợp loại thuốc chống ung thư theo chế ức chế enzyme kinase [1-4] Gefitinib (Iressa), erlotinib (Tarceva), lapatinib (Tykerb) vandetanib (Caprelsa) hợp chất quinazoline tiêu biểu đưa vào sản xuất thuốc điều trị ung thư Trong Gefitinib Erlotinib thuốc hoá trị liệu thụ thể yếu tố tăng sinh biểu bì (EGFR) hệ sử dụng để điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ Thuốc Erlotinb dẫn xuất quinazoline có tên thương mại Tarceva, sản xuất hãng dược phẩm Hoffmann - La Roche Thuốc sử dụng có hiệu cao cho điều trị bệnh ung thư phổi khơng phải tế bào nhỏ (UTPKPTBN) có đột biến hoạt hóa EGFR Đây phương pháp đột phá điều trị UTPKPTBN tạo hội kéo dài thời gian sống với chất lượng sống cao Ở Việt Nam, thuốc Tarceva có thành phần erlotinib hydrochloride chưa sử dụng rộng rãi, trước hết chi phí điều trị Tarceva đắt tiền, 2.000 USD/chu kỳ điều trị (một chu kỳ =1 tháng), giá bán thị trường Việt Nam khoảng 42 triệu đồng/ lọ/30 viên loại 150mg Trong nhiều nghiên cứu trước đó, hợp chất 1,2,3-triazole cho hoạt tính chống ung thư, kháng khuẩn kháng nấm mạnh Triazole hợp chất dị vòng thơm năm cạnh với nguyên tử nitơ có moment lưỡng cực cao, dễ dàng tham gia trình hình thành liên kết hydro tương tác lưỡng cực với ADN, protein tế bào Hợp chất dị vịng khơng bị thủy phân mơi trường axit bazơ không bị phá huỷ trình khử oxy hóa Với tính ưu việt mặt hố học hoạt tính sinh học, 1,2,3-triazole vừa tác nhân vừa cầu nối lý tưởng để lai hố với lớp chất có dược tính khác ví dụ 4-aminoquinazoline Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu tổng hợp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hợp chất quinazolin” hướng nghiên cứu có ý nghĩa khoa học thực tiễn Mục tiêu luận án: Nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp thuốc erlotinib hydrocloride Nghiên cứu tổng hợp xác định cấu trúc dẫn xuất quinazoline Nghiên cứu tổng hợp xác định cấu trúc hợp chất lai dẫn xuất quinazoline với azide qua cầu nối triazole Nghiên cứu thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất lai tổng hợp ba dòng tế bào ung thư người bao gồm KB (ung thư biểu mô, Hep-G2 (ung thư gan) Lu (ung thư phổi tế bào nhỏ) CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ LỚP CHẤT QUINAZOLINE Quinazoline hợp chất hữu với cơng thức C8H6N2 Nó dị vòng thơm với cấu trúc lưỡng tính bao gồm vịng benzen vịng pyrimidine Quinazoline phân tử phẳng Nó đồng phân với diazanaphthalen khác nhóm phụ benzodiazine: cinnoline, quinoxaline phthalazine Hình 1.1: Cấu trúc Quinazoline Quinazoline chất rắn tinh thể màu vàng sáng, hòa tan nước, gọi 1,3-diazanaphthalene, tên gọi quinazoline xuất phát từ dẫn xuất aza quinoline Mặc dù phân tử quinazoline mẹ đề cập tài liệu kỹ thuật dẫn xuất thay quan tâm nghiên cứu tổng hợp cho mục đích y học thuốc chống sốt rét thuốc chống ung thư Bằng cách ức chế enzim Tyrosine Kinase [1-4] thuốc chống ung thư tổng hợp từ lớp chất Quinazoline đem lại đột phá trị liệu ung thư Một số hợp chất quinazoline tiêu biểu Gefitinib (Iressa), erlotinib (Tarceva), lapatinib (Tykerb) vandetanib (Caprelsa) đưa vào sản xuất thuốc điều trị ung thư Trong Gefitinib erlotinib hai thuốc hoá trị liệu thụ thể yếu tố tăng sinh biểu bì (EGFR) thuộc hệ sử dụng để điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ Lapatinib dùng làm thuốc điều trị bệnh ung thư vú khối u rắn khác cách ức chế tyrosine kinase kép HER2/neu EGFR Vandetanib dùng điều trị bệnh ung thư tuyến giáp thể tuỷ di căn, cách ức chế kinase số thụ thể tế bào, chủ yếu mạch máu nội mạc thụ thể yếu tố tăng trưởng (VEGFR), EGFR kinase RET-tyrosine Tuy nhiên, hiệu thuốc bị giới hạn nhóm nhỏ bệnh nhân không đồng phân tử bên khối u khối u với nhau, khả đáp ứng thuốc kháng thuốc đột biến thụ thể [5-9] Vì vậy, nghiên cứu thiết kế tổng hợp hợp chất với mục tiêu ức chế EGFR ức chế đa chức cần thiết Hiện nay, dẫn xuất 4anilinoquinazoline chủ yếu tổng hợp cách đưa nhóm khác vào vị trí C-6, C-7 khung quinazoline vòng aniline nhằm tổng hợp hoạt chất để tìm kiếm dẫn chất có hoạt tính cao Chỉ có số nhỏ cơng trình nghiên cứu tổng hợp hợp chất lai quinazoline với chất chống ung thư theo chế tác dụng khác nhận kết đáng khích lệ O F Cl F N HN O Cl N O O O N N N N Erlotinib F Lapatinib Br F HN O HN N O HN O N O Gefitinib O O HN O S HN O O N O O O O HN HN N N N N Cl N O N O Icotinib Vandetanib Carnetinib F O O N HN HN O O F O Cl O N Cl HN HN N N O Afatinib Cl Cl N N Dacomitinib Hình 1.2: Cấu trúc hóa học số hợp chất quinazoline ức chế EGFR Trong phân tử 4-anilinoquinazoline, khung 4-anilinoquinazoline định khả ức chế EGFR, cịn nhóm vị trí C-6 C-7 định tính chất hóa lý hợp chất [14-16] Các nhóm aniline vị trí C-4 khung quinazoline lựa chọn phù hợp để tạo tương tác kỵ nước quan trọng nhằm ức chế EGFR hiệu Những nghiên cứu tương quan cấu trúc hoạt tính sinh học (SAR) hợp chất quinazoline kích thước chất gốc aniline định ức chế chọn lọc enzym kinase, nhóm ưa nước vị trí C-6 khung quinazoline làm cải thiện tính chất vật lý có lợi cho tác dụng dược lý thuốc [15, 16] Các nhóm arylamino, phổ biến 3-ethynylphenylamino 3-chloro-4-flouro-phenylamino, thường dùng để thiết kế tổng hợp chất ức chế EGFR Với lợi việc thiết kế tổng hợp để đưa nhóm khác vào vị trí C-6, C-7 C-4 khung quinazoline hướng nghiên cứu nhiều tiềm 1.1.1 Những nghiên cứu nước tổng hợp dẫn xuất quinazoline 1.1.1.1 Chuyển hóa vị trí C-6, C-7 C4-NH khung quinazoline Những nghiên cứu trước erlotinib cho thấy rõ vai trị quan trọng nhóm chức ether gắn với khung quinazoline Các hợp chất tạo có hoạt tính chống ung thư mạnh Kế thừa phát triển nghiên cứu trước nhóm tác giả Yinxiang Wang vào năm 2012 tổng hợp dãy crown ether gắn với khung quinazoline phương pháp truyền thống từ nguyên liệu ban đầu metyl 3,4dihydroxy-benzoat qua bước phản ứng (sơ đồ 1.1) [17] Kết thử hoạt tính dẫn xuất crown ether quinazoline dòng enzym Abl Arg kinaza cho thấy hợp chất 7a có hoạt tính mạnh Hợp chất 7a (Icotinib) ức chế tăng sinh loạt xenograft khối u rắn người với liều lượng khoảng 50-100 mg/kg (một lần/ngày) Icotinib đưa vào thử nghiệm lâm sàng độc lập để điều trị bệnh nhân ung thư phổi tế bào nhỏ [18, 19] Những công bố gần nhấn mạnh icotinib cho tác dụng tương tự gefitinib, đồng thời có khả dung nạp tốt bệnh nhân ung thư phổi tế bào nhỏ điều trị trước với tác nhân hóa trị liệu khác [19] O HO O Lg OCH3 a HO O O OCH3 B b O O OCH3 B O O O Lg OCH3 B c NO2 O NH2 R OH O d Cl O N B O N e O R N B HN O H2N f N N B O N Sơ đồ 1.1: Quy trình tổng hợp dẫn xuất crown ether quinazoline [17] (a) K2CO3, DMF, 90oC, h, 24-45%; (b) HNO3/ H2SO4, AcOH, 72%; (c) H2, Pd/C, 96%; (d) NH2CHO/HCOONH4, 165oC, 80%; (e) POCl3, 77%; (f) i-PrOH/DMF, 72% HN O O O O N N 7a (Icotinib) Nhóm morpholine gefitinib không tham gia vào tương tác với EGFR lựa chọn ngẫu nhiên mật độ electron thấp Thay nhóm morphonline nhóm giàu điện tử vị trí C-6 khung 4anilinoquinazoline nhằm tăng cường hoạt tính gefitinib, điển hình với nhóm acrylamit vị trí C-6 thu chất ức chế EGFR không thuận nghịch [20] hay chất ức chế EGFR-T790M [21] R1 R N H HN H N () n X N Br N X O N N n = 1; X = S; R1 = n = 2; X = O; R1 = N R3 R2 HN , N S N R1 = H, OMe, CH2NMe2, O(CH2)3morph, R2 = Br, Cl, Me R3 = H, F, Me X = H, F, Me O H O N S O Các dẫn xuất gefitinib chứa nhóm dị vòng cạnh mạch nhánh C-6 khung quinazoline tổng hợp theo sơ đồ 1.2 [22] Các hợp chất 12a-g, 13ag cho hoạt tính ức chế EGFR tương đối tốt Trong đó, hợp chất 13g với nhóm 2-oxa-6-azaspiro[3,4]octan (IC50 = 0.016 μM) cho hoạt tính ức chế EGFR cao gefitinib (IC50 = 0.023 μM) khả kháng u tương đương với gefitnib nhờ độ tan nước tốt so với dẫn xuất khác Sơ đồ 1.2: Tổng hợp dẫn xuất gefitinib với nhóm dị vịng cạnh [22] Trong cơng trình cơng bố Zuo S.J [23], nhóm arylure kết hợp với amine bậc ba thay cho nhóm morpholine phân tử gefinitib tạo thành dẫn xuất 14 có khả ức chế EFGR-TK, đồng thời thể hoạt tính chống ung thư lý thú Hợp chất 14a (R1 = MeN(CH2CH2)2N; R2 = CH2; R3 = 3-Cl4-(3-FBnO)), 14b (R1 = (CH2)2N; R2 = CH2; R3 = 3-CF3), 14c (R1 = (CH2)4N; R2 = CH2; R3 = 3-CF3) 14d (R1 = (CH2)5N; R2 = CH2; R3 = 3-CF3) cho hoạt tính kháng tế bào A431, A549 tốt nhiều so với gefitinib với giá trị IC50 ~ µM R3 H N R HN H N N O R N 14 R1 = N ; N ; N ; N N ; O N ; N C-R2 = -; CH2; C=O R3 = 3-Cl-4-F; 3-Cl-4-(3-FBnO); 3-Cl-4-OCH3; 3-CF3; 3,4-diF; 3-ethynyl; 3-CON(CH2)4; Mới đây, với ý tưởng đóng vịng nội phân tử vị trí C-6 C-7 hợp chất gefitinib, nhóm nghiên cứu Hu Liming thiết kế tổng hợp dẫn xuất gefitinib từ hợp chất chìa khóa trung gian methyl 3-oxo-3,4-dihydro-2Hbenzo[b][1,4]oxazin-6-carboxylat 19 [24] Từ ngun liệu ban đầu 3-nitro-4hydroxy benzoic acid thu hợp chất quinazoline chứa khung morpholin-3on 25, 26 (tổng hợp qua 10 bước, sơ đồ 1.3) cho hoạt tính ức chế EGFR mong đợi Hầu hết dẫn xuất tổng hợp cho giá trị IC50 EGFRwt nhỏ µM, đó, hợp chất 26a (X = O, R1 = Cl, R2 = Cl) cho giá trị thấp IC50 = 53.1 nM Nhóm nghiên cứu dẫn xuất 26 chứa nhóm 3-morpholinopropyl (X = O) cho hoạt tính tốt so với dẫn xuất 25 3(piperidin-1-yl)propyl (X = CH) Điều cho thấy việc đưa nhóm ưa nước vào vị trí C6 khung quinazoline làm tăng khả ức chế EGFR Ngoài ra, hợp chất 26a (R1 = Cl, R2 = Cl) 26b (R1 = ethynyl, R2 = H) ức chế đột biến EGFRT790M/L858R có hoạt tính kháng hai dịng tế bào H358, A549 tốt so với gefinitib erlotinib O O2N OH HO Cl 15 O (e) (a) N O O O2N O NO2 O HO 20 X = CH (f) 16 (b) X O O2N O O O (c) O O H N (d) O O H N (g) O O N O X=O NO2 O O O N O O 17 18 O O 19 NO2 21 (h) X X R2 N R1 HN O N O X N (k) Cl O N N N N (i) O (j) O N O 25 X = CH 26 X = O X N N N O N N O O 23 24 O O NH NH2 22 Sơ đồ 1.3: Quy trình tổng hợp dẫn xuất morpholine-3-on chứa khung quinazoline [24] (a) CH3OH, H2SO4, đun hồi lưu; (b) ethyl bromoacetat, K2CO3, DMF, 70oC; (c) Fe, HAc, 70oC; (d) HAc/HNO3; (e) 1-bromo-3-cloropropan, Cs2CO3, CH3CN, 25-30oC; (f) piperidine, K2CO3, KI, DMF, 25-30oC; (g) 4-(3-chloropropyl)morpholine, K2CO3, KI, DMF, 80oC; (h) Fe, HAc, EtOH/H2O; (i) formamid acetat, EtOH, đun hồi lưu; (j) POCl3, 120oC; (k) aniline, i-PrOH, đun hồi lưu Nhóm tác giả Hu Liming áp dụng phản ứng đóng vòng nội phân tử cho hợp chất PD135035 dẫn xuất để tổng hợp hợp chất dị vịng [1,4]dioxino[2,3-f]quinazoline 27 (hình 1.3) [25] Các hợp chất dị vòng 27 xem chất ức chế EGFRwt EGFRT790M/L858R tiềm với IC50 < 50 nM, đồng thời chúng cịn có khả ức chế tế bào ung thư H358 A549 R3 HN O O R2 O HN Br O N R1 N N O N 27 PD153035 Hình 1.3: Thiết kế tổng hợp hợp chất dị vòng [1,4]dioxino[2,3-f]quinazoline [25] Tương tự, phản ứng đóng vịng nội phân tử áp dụng dẫn xuất erlotinib (sơ đồ 1.4) Các hợp chất oxazin-quinazoline 31 oxazepinequinazoline 32 với nhóm R dị vịng chứa nitơ cho hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư N87, A431, H1975, BT474 Calu-3 (IC50 = 0.0462.06 µM) mạnh erlotinib (IC50 = 0.75-10 µM) gefitinib (IC50 = 0.36-1.00 µM) [26] HN H2N (a) N Cl ( ) n O H N HN O N ( )n N 28 29 O Br (b) N HN ( )nN O R (c) N ( )n N O HN N O N N 31 n =1 32 n = 30 Sơ đồ 1.4: Quy trình tổng hợp hợp chất oxazin-quinazoline oxazepinquinazoline [26] o (a) K2CO3, KI, DMF, 110 C, 24 h; (b) clorua bromocrotonic acid, Et3N, DCM, 35oC, 24 h; (c) amine, DMF, 30oC, h Những nghiên cứu trước cho thấy diện nguyên tử halogen vòng aniline cải thiện đáng kể hoạt tính sinh học dẫn xuất 4anilinoquinazoline Đặc biệt diện F phân tử làm tăng ổn định trao đổi chất khả gắn kết độ thấm màng Trên sở nhóm nghiên cứu tác giả Malose Jack Mphahlele [27] tiến hành tổng hợp loạt dẫn xuất 4-(halogenophenylamino)-6-bromoquinazoline 6-(4-fluorophenyl) từ dẫn xuất NH-4 (3H)–oxo 33a-33b O Cl Br NH N NHAr Br (i) (ii) N R N F Br N R N NHAr (iii) N R N 33a (R=H) 34a (R=H) 33b (R=4  ClC 6H -) 34b (R=4  ClC 6H -) 35a - f (R=H) 35g - l (R=4  ClC 6H -) a: R = H ; Ar=2-FC6H4-; g: R = 4-ClC6H4-; Ar = 2-FC6H4-; R 36a - d  f (R=H) 36g - j & 36l (4 - ClC 6H 4) b: R = H; Ar = 3-FC6H4-; h: R = 4-ClC6H4-; Ar = 3-FC6H4-; c: R = H; Ar =4-FC6H4-; i: R = 4-ClC6H4-; Ar =4-FC6H4-; d: R = H; Ar = 3-ClC6H4-; j: R = 4-ClC6H4-; Ar = 3-ClC6H4-; e: R = H; Ar = 4-BrC6H4-; k: R = 4-ClC6H4-; Ar = 4-BrC6H4-; f: R = H; Ar = 2,4-diFC6H3-; l: R = 4-ClC6H4-; Ar = 2,4-diFC6H3-; Sơ đồ 1.5: Tổng hợp 4-anilino-6-bromoquinazoline dẫn xuất 6fluorophenyl chúng [27] ◦ (i) POCl3, Et3N, hồi lưu, h; (ii) NH2Ar, HCl, THF-iPrOH, 70 C, h; (iii) 4-FC6H4B (OH) 2, ◦ PdCl2 (PPh3)2, Cs2CO3, THF-iPrOH, 70 C, h Kết nghiên cứu nhóm tác giả hầu hết hợp chất tổng hợp thể hoạt động ức chế chống lại MCF-7 HeLa Dựa kết độc tế bào in vitro cho thấy diện 4-fluorophenyl- 2,4difluorophenylaniline tốt cho độc tế bào hai dòng tế bào Sự kết hợp 2-(4-chlorophenyl) 6-(4-fluorophenyl) nhóm làm tăng hoạt động chống lại tế bào HeLa nhiều dịng tế bào MCF-5 Hợp chất 35l khơng thể hoạt động chống tăng sinh mạnh mẽ chống lại hai dòng tế bào ung thư, mà cho thấy hoạt động ức chế đáng kể (LC50 = 37,66 nM) EGFR so với thuốc Gefitinib (LC50 = 31,44 nM) Nghiên cứu phân tử (trong silico) nhà khoa học cho hợp chất tổng hợp gắn kết độc đáo với khu vực EGFR, với mối quan hệ ràng buộc tương đương với Gefitinib Các kết cho thấy có mặt chất thay 2-(4-halogenophenyl) làm tăng độc tính tế bào in vitro hoạt tính ức chế chống lại EGFR-TK Do việc chuyển hóa vị trí C-2 hướng nghiên cứu nhà nghiên cứu quan tâm 1.1.2 Chuyển hóa vị trí C-2 N-3 khung quinazoline Trong nghiên cứu gần nhóm tác giả Hatem A Abuelizz cộng [28] tổng hợp dãy dẫn xuất quinazoline 40a (R= methyl; R1= benzyl; R2= 3-(Phthalimido-2-yl)propyl), 40b (R= methoxy; R1= benzyl; R2= 3(Phthalimido-2-yl)propyl), 40c (R= methyl; R1= benzyl; R2= Morphilinoethyl) có độc tính đánh giá in-vitro với hai dòng tế bào ung thư HeLa MDA-MB231 tương đối tốt, với IC50 giá trị từ 1,85 đến 2,81 µM cho thấy chúng có hoạt tính tốt so với gefitinib (IC50 = 4,3 28,3 µM so với tế bào HeLa MDAMB231 tương ứng) 10 Phổ HMBC giãn hợp chất 122a PL50 Phổ HMBC giãn hợp chất 122a PL51 Phổ HMBC giãn hợp chất 122a PL52 Phổ HSQC giãn hợp chất 122a PL53 Phổ IR hợp chất 122a Phổ MS hợp chất 122a PL54 Phổ IR hợp chất 122b Phổ 1H-NMR hợp chất 122b PL55 Phổ 13C-NMR hợp chất 122b Phổ 1H-NMR hợp chất 122c PL56 Phổ 13C-NMR hợp chất 122c Phổ 1H-NMR hợp chất 122d PL57 Phổ 13C-NMR hợp chất 122d Phổ MS hợp chất 122d PL58 Phổ 1H-NMR hợp chất 123a Phổ 13C-NMR hợp chất 123a PL59 Phổ MS hợp chất 123a Phổ 1H-NMR hợp chất 123b PL60 Phổ 13C-NMR hợp chất 123b Phổ 1H-NMR hợp chất 123c PL61 Phổ 1H-NMR hợp chất 123c Phổ MS hợp chất 123c PL62 ... ? ?Nghiên cứu tổng hợp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hợp chất quinazolin” hướng nghiên cứu có ý nghĩa khoa học thực tiễn Mục tiêu luận án: Nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp thuốc erlotinib... nguyên liệu bào chế thuốc điều trị ung thư phổi tế bào nhỏ, đồng thời nghiên cứu tổng hợp số hợp chất lai chứa khung quinazoline với nhóm R khác Các hợp chất lai cho hoạt tính gây độc tế bào ung... phun vào hệ thống tạo ion, nguồn ESI ion hóa mẫu dịch lỏng sau máy khối phổ ghi nhận tín hiệu ion mảnh 2.1.4 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư Hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất