Luận văn đánh giá khả năng diệt tuyến trùng và kích thích sinh trưởng đối với cây cà phê của chủng vi khuẩn nội sinh bacillus megaterium

1 MỞ ĐẦU Hiện nay, phát triển ngành nông nghiệp vào mức độ thâm canh, với việc sử dụng ngày nhiều phân hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học, phá rừng canh tác công nghiệp chạy theo suất, sản lượng…đã làm cho đất đai ngày thối hóa, dinh dưỡng bị cân đối, cân hệ sinh thái đất, hệ vi sinh vật đất bị phá hủy, tồn dư chất độc hại đất ngày cao, nguồn bệnh đất ngày tích lũy….Ðể đối phó với vấn đề này, việc kiểm soát sâu, bệnh hại biện pháp sinh học ngày ý đến có nhiều nghiên cứu thực thời gian gần [1] Cà phê mặt hàng nơng sản chiến lược, đóng góp 3,5 tỷ USD cho ngân sách nhà nước [2] Chủ trương Nhà nước hình thành vùng trồng cà phê lớn, sản xuất bền vững, đạt tiêu chuẩn cà phê chứng quốc tế đáp ứng nhu cầu xuất mang lại giá trị lợi nhuận cao [3] Tuy nhiên, sản xuất cà phê Việt Nam nói chung phải đối mặt với nhiều thách thức, có vấn đề lạm dụng phân bón hóa học [4] Điều làm gia tăng chi phí sản xuất mà cịn làm giảm khả chống chịu cà phê dẫn đến bùng nổ dịch bệnh, ảnh hưởng không tốt đến chất lượng cà phê Việt Nam thị trường giới nguyên nhân dẫn đến thối hóa đất canh tác, nhiễm nguồn nước mơi trường sống Ngồi ra, dư lượng hóa học làm giảm chất lượng hạt cà phê nhân, làm sản phẩm khó vào thị trường địi hỏi chất lượng cao Do đó, việc nghiên cứu tìm giải pháp thay phần phân bón thuốc bảo vệ thực vật hóa học sản xuất cà phê vấn đề quan tâm nhiều nhà khoa học Một bệnh điển hình cà phê phải đối mặt bệnh sần rễ gây vàng chết, bệnh chủ yếu tuyến trùng gây sần rễ gây Tuyến trùng Meloidogyne incognita tuyến trùng gây sần rễ, tác nhân chủ yếu gây hại cho trồng có cà phê Vi sinh vật nội sinh xem đối tượng quan trọng, phân lập sàng lọc để làm chế phẩm sinh học dùng cho việc phòng trừ loại nấm bệnh Lợi dụng đặc tính vi sinh vật sống nội sinh tế bào mô thực vật rút ngắn thời gian thích nghi chế phẩm sinh học Vi sinh vật nội sinh đối kháng với nấm bệnh, kích thích sinh trưởng cho đồng thời khơng ảnh hưởng đến môi trường, sức khỏe cộng đồng [5] Khảo sát vi sinh vật nội sinh nghiên cứu nhiều loại trồng quan trọng lúa mỳ, chuối, đậu nành cà chua, phần lớn vi sinh vật nội sinh cà phê chưa nhiều nghiên cứu sâu [6] Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: “Đánh giá khả diệt tuyến trùng kích thích sinh trưởng cà phê chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium” Mục đích, yêu cầu: - Mục đích: Đánh giá khả diệt tuyến trùng kích thích sinh trưởng cà phê chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium - Yêu cầu: Sử dụng phương pháp nghiên cứu vi sinh hóa sinh để thử nghiệm đánh giá: khả diệt tuyến trùng, khả sinh tổng hợp enzyme chitinase cellulase cao, sinh tổng hợp hàm lượng IAA CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ PHÊ 1.1.1 Lịch sử phát triển cà phê Cà phê thuộc Rubiales, họ Rubiacea, chi Coffea Theo phân loại thực vật học cà phê có khoảng 500 lồi với 6.000 loại Tất loại cà phê có nguồn gốc từ Châu Phi, loại sống hoang dại tiếng lâu đời cà phê chè (Coffea arabica) Cây cà phê chè mọc hoang dại biết đến vùng biên giới giáp cao nguyên Boma Sudan Năm 1889 tìm thấy cà phê vối (Coffea canephora) mọc hoang dại vùng thuộc Công Gô mọc rải rác số vùng khác thuộc Tây Phi gần xích đạo Cây cà phê trồng trọt từ kỷ XIV vùng Arabica (Yêmen) Theo Vesling, cà phê đem từ Yêmen sang bán vùng Ai Cập duới dạng khô coi thứ hàng xa xỉ Vào kỷ XVII người ta lấy cà phê rang xay trộn vào dầu mỡ chứa túi làm thực phẩm để vuợt sa mạc Hiện giới trồng lồi cà phê có giá trị kinh tế sau: Cà phê chè (Coffea arabica Line): Ðược trồng có hệ thống vào khoảng kỷ XV khu vườn miền nam Yêmen Từ kỷ XVII người Ả-rập vị trí độc tơn việc trồng cà phê cà phê chè lan rộng khắp giới Nguồn gốc từ Ethiopia đến Yêmen sang Yava (1960) đến Amsterdam (Hà Lan) năm 1706, sang Trung Mỹ Năm 1724, đến Colombia năm 1724, từ Yêmen sang Brazil năm 1715 từ Yava sang Papua New Guinea vào năm 1770 Hiện cà phê chè trồng tập trung chủ yếu Brazil, Colombia, Mêhicô nước Trung Phi Cà phê chè bao gồm chủng phổ biến như: Coffea arabica L var Typica, Coffea arabica L var Bourbon, Coffea arabica L var Amarello chev, Coffea arabica L var Caturra, Coffea arabica L var Mokka, Coffea arabica L var Mundonovo, Coffea arabica L var Catuai, Coffea arabica L var Catimor [7] Cà phê vối (Coffea canephora Piere): Cà phê vối từ Tây Phi Madagascar đưa sang Nam Mỹ Amsterdam, Hà Lan vào năm 1899 Cà phê vối không chịu lạnh cà phê chè việc gieo trồng hạn chế số vùng có điều kiện sinh thái đặc trưng, đồn điền cà phê vối xuất Java năm 1900 Cà phê vối chủ yếu trồng nhiều số nước Indonesia, Bờ Biển Nga, Uganda, Việt Nam Cây cà phê vối chịu nhiệt độ nóng ẩm, suất cao hương vị nước uống cà phê chè Khác với cà phê chè, cà phê vối thụ phấn chéo hoa lần nách cành ngang Cà phê mít (Coffea excelsa Chev): Cà phê mít dâu da (Coffea liberica Bull in Hiern) Hai loại cà phê trồng nước Châu Phi Liberia, Sierra Leon, Cộng Hòa Trung Phi, Benin nước Châu Á Philipin, Indonesia, Việt Nam Hai loại cà phê sinh trưởng khỏe, khả thích ứng rộng, sâu bệnh, chất lượng nước uống kém, hàm lượng caffein thấp So với cà phê chè cà phê vối sản lượng hai loại cà phê không đáng kể [8] 1.1.2 Đặc điểm thực vật học cà phê Thân: Cây cà phê chè cao tới m, cà phê vối tới 10 m Tuy nhiên trang trại cà phê người ta thường phải cắt tỉa để giữ độ cao từ 2-4 m, thuận lợi cho việc thu hoạch Cây cà phê có cành thon dài, cuống ngắn, xanh đậm, hình ovan Mặt có màu xanh thẫm, mặt xanh nhạt Chiều dài khoảng 8-15 cm, rộng 4-6 cm Rễ cà phê loại rễ cọc, cắm sâu vào lòng đất từ - 2,5 m với nhiều rễ phụ tỏa xung quanh làm nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng nuôi [6] Hoa: Hoa cà phê màu trắng, có năm cánh, thường nở thành chùm đôi chùm ba Màu hoa hương hoa dễ làm ta liên tưởng tới hoa nhài Hoa nở vòng đến ngày thời gian thụ phấn vài ba tiếng Một cà phê trưởng thành có từ 30.000 đến 40.000 bơng hoa Ngay từ cà phê hoa kết người ta có đánh giá vụ mùa cà phê Ở nước sản xuất cà phê lớn điều đặc biệt quan trọng việc đưa nhận định giá thị trường Tuy đợt rét đậm hạn hán làm đảo lộn tính tốn đẩy thị trường vào tình hồn tồn khác [6] Quả: Cà phê lồi tự thụ phấn, gió trùng có ảnh hưởng lớn tới q trình sinh sản Sau thụ phấn phát triển đến tháng có hình bầu dục, bề ngồi giống anh đào Trong thời gian chín, màu sắc thay đổi từ xanh sang vàng cuối đỏ Quả có màu đen chín nẫu Do thời gian đâm hoa kết trái lâu mà vụ cà phê kéo dài gần năm trời xảy trường hợp vừa có hoa, vừa có Thơng thường cà phê chứa hai hạt Chúng bao bọc lớp thịt bên [6] 1.1.3 Một số bệnh thường gặp cà phê Một vấn đề đáng quan tâm năm qua tình hình phát sinh sâu bệnh cà phê diễn biến phức tạp, việc áp dụng biện pháp phòng trừ sâu bệnh nhiều hạn chế, nhiều loại bệnh chưa có thuốc đặc trị, việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật cà phê có nhiều vấn đề đáng bàn… Một ví dụ cụ thể xuất loại ve sầu gây hại cà phê huỷ diệt diện rộng đến hàng chục ngàn cà phê nhiều tỉnh thành nước, đặc biệt vùng chuyên canh cà phê Đắk Lắk, Lâm Đồng, Gia Lai, Đắk Nông… gây thiệt hại lớn cho người dân làm cho phát triển cà phê thời gian tới chưa bền vững Cho nên, cà phê phát triển ổn định bền vững vấn đề bảo vệ thực vật cho cà phê cần thiết đáng quan tâm [9] Theo kinh nghiệm thực tế sâu bệnh thường xuất sau thu hoạch xong cà phê cuối mùa nắng, đầu mùa mưa Đây giai đoạn phát triển nhanh nhiều loại sâu bệnh cà phê Theo Cục Bảo vệ thực vật cho biết, tập đoàn sâu bệnh hại cà phê phong phú đa dạng gồm 18 loại sâu bệnh Các lồi sâu hại quan trọng thuộc họ gồm: cánh cứng, cánh đều, cánh vảy Trong xuất phổ biến loại bệnh sau: rệp sáp, ve sầu hại rễ, sâu đục thân, đục cành, đục quả; bệnh gỉ sắt loại bệnh nấm…[10] Một số bệnh gây hậu nghiêm trọng cà phê loại bệnh sau: a, Bệnh rễ tuyến trùng (Nematodes) Một số loại tuyến trùng gây hại cà phê Việt Nam là: - Tuyến trùng gây vết thương: Pratylenchus coffea - Tuyến trùng gây nốt sần: Meloidogyne spp - Tuyến trùng nội sinh nửa nội sinh là: Tylenchus Pratylenchus,… Tuyến trùng gây tác hại thời kỳ vườn ươm chủ yếu vườn trồng Cây cà phê bị tuyến trùng thường sinh trưởng kém, mùa khơ thường bị vàng héo, bị nặng chết khô lô trồng Triệu chứng tuyến trùng gây vết thương làm cho rễ bị sưng u, có đường nứt nẻ Cịn tuyến trùng gây nốt sần rễ phụ có u dạng nốt sần Biện pháp phòng trừ: Những bị bệnh nặng nhổ đem đốt Những vùng bị bệnh nặng cần luân canh với trồng khác, cải tạo đất phân xanh từ - năm sau trồng lại cà phê Con đường chọn lọc giống chống bệnh dùng gốc ghép chống bệnh thường ý để phòng chống bệnh Những bị bệnh nhẹ tăng cường bón phân hữu cơ, dùng số loại thuốc sau để bơm vào đất xử lý: Nemaphos, Teracur, Nemagon, Methylbromid Cây cúc vạn thọ có khả diệt tuyến trùng Trồng vùng bị bệnh xung quanh gốc cà phê để chúng tiết chất diệt tuyến trùng đất vùng xung quanh rễ Có th ể đem băm thân rễ cúc vạn thọ sau đem vùi vào gốc cà phê b, Bệnh thối rễ Một số loại nấm đất thuộc chi Rhizoctonia, Fusarium công gây tác hại vào rễ cà phê Triệu chứng: Trên rễ ngang, chóp rễ, phần rễ chuột xuất vết thối mềm có màu thâm đen Cây bị bệnh sinh trưởng cằn cỗi, vàng, héo, bị nặng bị chết [19] Biện pháp phòng trừ: Chú ý tới biện pháp thâm canh, tăng cường bón phân hữu cơ, cải thiện đặc điểm lý hóa tính đất đặc biệt giảm độ chua đất Hiện chưa có loại thuốc hóa học để phịng trừ bệnh thối rễ có hiệu [11] 1.2 TUYẾN TRÙNG THỰC VẬT VÀ TUYẾN TRÙNG HẠI CÂY CÀ PHÊ 1.2.1 Cấu tạo phân loại tuyến trùng thực vật Tuyến trùng thực vật nhóm động vật khơng xương sống có đặc điểm sinh thái thích nghi với đời sống ký sinh thực vật Nhóm tuyến trùng có số đặc trưng quan trọng so với nhóm ký sinh động vật nhóm sinh thái khác, có kích thước hiển vi, phần miệng có cấu tạo kim hút chuyển hóa để châm chích mơ thực vật hút chất dinh dưỡng, kích thước trứng lớn kích thước thể, đời sống chúng có quan hệ bắt buộc trực tiếp với thực vật phát triển Trong đó, cấu tạo kim hút chuyển hóa khác biệt quan trọng Về mặt phân loại học, tuyến trùng ký sinh thực vật gồm nhóm liên quan đến tuyến trùng là: Bộ Tylenchida (chỉ trừ số loài tuyến trùng họ Tylenchidae); Bộ Aphelenchida; Các loài tuyến trùng họ Longidoridae Dorylaimida; Các loài tuyến trùng họ Trichodoridae thuộc Triplonchida Trong nhóm ký sinh nhóm lồi thuộc Tylenchida nhóm tuyến trùng ký sinh đơng đảo có tầm quan trọng sản xuất nông nghiệp Tuyến trùng thực vật sống ký sinh tất phần thực vật phát triển, hoa, lá, hạt, thân rễ, rễ nơi gặp nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh Tuyến trùng ký sinh thực vật có tập quán dinh dưỡng khác nhau, số loài dinh dưỡng mơ ngồi thực vật, số khác thâm nhập vào mô sâu hơn, số khác làm cho chủ tạo nguồn dinh dưỡng đặc biệt nơi chúng ký sinh Tác hại tuyến trùng gây thực vật thường tương đối nhẹ, nhiên mật độ lớn chúng gây hại nghiêm trọng, chí chúng gây chết thực vật Ngồi ra, vài tuyến trùng làm giảm khả thực vật việc kháng lại xâm nhập tác nhân vi sinh vật gây bệnh khác làm cho tác hại chúng thực vật trầm trọng thêm Một số tuyến trùng ký sinh chuyển hóa có khả lan truyền virus gây bệnh cho thực vật Tuyến trùng ký sinh làm giảm 12,5% sản lượng trồng thiệt hại tuyến trùng ký sinh trồng nông nghiệp ước tính hàng trăm tỷ la Mỹ năm Về hình thức ký sinh thực vật, tuyến trùng phân thành nhóm ký sinh sau: - Ngoại ký sinh: tuyến trùng không xâm nhập vào bên mô thực vật mà bám bên bề mặt rễ, dinh dưỡng tuyến trùng việc sử dụng kim chích châm chích hút chất dinh dưỡng tế bào thực vật - Bán nội ký sinh: phần đầu tuyến trùng xâm nhập vào rễ, phần sau thể tuyến trùng đất - Nội ký sinh: toàn tuyến trùng xâm nhập vào bên rễ Nhóm chia thành nhóm nhỏ: + Nội ký sinh di chuyển: tuyến trùng giữ khả di chuyển mô thực vật chúng chuyển động từ mô đến mô khác để hút dinh dưỡng + Nội ký sinh cố định: sau xâm nhập vào rễ, tuyến trùng dinh dưỡng nơi cố định tạo nên tế bào dinh dưỡng, chúng khả di chuyển trở nên phình to (béo phì) 1.2.2 Thành phần lồi tuyến trùng gây hại cà phê Theo White T., thành phần tuyến trùng kí sinh hại cà phê gồm lồi sau: Bảng 1.1 Thành phần loài tuyến trùng ký sinh hại cà phê [12] Lồi Nội kí sinh (endoparasit) Bán ký sinh (semi – ectoparasit) ngoại sinh (ectoparasit) Cà phê chè (Coffea arabica Line) ∗Meloidogyne sp , M.africana, M exigua, M coffeicola, M decalineata, M megadora ∗Pratylenchus sp., P coffea ∗ Radopholus similis ∗ Rotylenchulus reniformis ∗Ditylenchus procerus ∗ Helicotylenchus erythrinea ∗ Paratylenchus besoekianus, Paratylenchus acrophallus ∗ Trichodorus christiae, T monchystera ∗ Xiphinema mericantum, X.brevicola, X.insigne, X.radicicola Cà phê vối (Coffea canephora Line) ∗Meloidogyne sp., M megadora ∗Pratylenchus sp., P brachyurus, P coffea ∗Radopholus similis * Ditylenchus procerus ∗Helicotylenchus erythrinea 1.2.3 Tình hình tuyến trùng hại cà phê Việt Nam Việc đẩy mạnh tái canh, thay vườn già cỗi đứng trước khơng trở ngại cho ngành cà phê Việt Nam chi phí q trình tái canh cao, tỷ lệ sâu bệnh nhiều, đặc biệt nghiêm trọng bệnh tuyến trùng hại rễ - khó khăn ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất cà phê giới Các nhóm tuyến trùng phổ biến gây hại nhiều cà phê Meloidogyne Pratylenchus Tại Việt Nam loài tuyến trùng Pratylenchus coffea, Meloidogyne spp Radopholus arabocoffea biết đến tác nhân gây hại cho 24%, 9% and 12% mẫu rễ cà phê phân tích Tại Việt Nam vào năm 1970, tuyến trùng Pratylenchus coffeae làm suy yếu chết hàng loạt vườn cà phê chè Phủ Quỳ - Nghệ An Đến năm 1994, tượng vàng bệnh hại rễ xuất phổ biến số tỉnh trồng cà phê tỉnh Đăk Lăk sau vùng trồng khác Tây Nguyên, gây hại hàng trăm cà phê Đăk Lăk Năm 1997, Đăk Lăk có 3.000 cà phê bị vàng lá, có gần 50% diện tích vàng bệnh hại rễ Gần nhất, năm 2008 vùng Phủ Quỳ - Nghệ An có gần 100ha cà phê chè Catimor trồng lại đất cà phê lý bị tuyến trùng gây hại chết hàng loạt Tuyến trùng gây tác hại thời kỳ vườn ươm chủ yếu đồng ruộng Cây cà phê bị tuyến trùng thường sinh trưởng kém, mùa khô thường bị vàng héo, bị nặng chết khô lô trồng Triệu chứng tuyến trùng gây vết thương làm cho rễ bị sưng u, có đường nứt nẻ Cịn tuyến trùng gây nốt sần rễ phụ có u dạng nốt sần [13] Việc phịng trừ nhóm tuyến trùng gây hại khó khăn sử dụng biện pháp hóa học, sinh học Ngồi biện pháp canh tác để hạn chế nhóm tuyến trùng sử dụng việc để đất hoang hóa thời gian dài trước canh tác hay luân canh không mang lại hiệu cao ảnh hưởng trực tiếp đến thu nhập kinh tế người trồng cà phê Đây vấn đề nan giải đòi hỏi biện pháp giải triệt để nhằm đảm bảo phát triển ổn định bền vững ngành cà phê Việt Nam [14] 10 Các nghiên cứu gần cho thấy chất đất hệ vi sinh vật tồn đất nguyên nhân tác động đến phân bố tuyến trùng Số lượng thành phần tuyến trùng khác mẫu đất có đặc điểm khác P Q Trinh đồng [15] xác định tuyến trùng thuộc nhóm Meloidogyne spp tìm thấy nhiều đất sét, nhóm tuyến trùng R Arabocoffeae tập trung chủ yếu đất cát đất mùn Pratylenchus spp tồn với số lượng lớn đất cát Nhóm tác giả điều kiện nhà kính vi khuẩn Pasteuria penetrans có khả hạn chế đáng kể số lượng tuyến trùng đất trồng cà phê Theo thống kê Viện Khoa học kỹ thuật nông- lâm nghiệp Tây Ngun có khoảng 30% diện tích trồng cà phê già cỗi cần phải tái canh, tập trung chủ yếu Đắk Lắk Lâm Đồng Đắk Lắk có 185.000 cà phê, sản lượng hàng năm đạt 380.000 cà phê nhân Tuy nhiên, 51% diện tích cà phê tỉnh có độ tuổi 15 năm, nên 5-10 năm nữa, bị “lão hóa”, hết chu kỳ kinh doanh cho hiệu quả, phải cưa đốn, phục hồi, tái canh Diện tích cà phê già cỗi cần phải trồng thay chuyển đổi - 10 năm tới không ảnh hưởng trực tiếp tới suất chất lượng cà phê Việt Nam Thực tế chứng minh thực tiễn sản xuất cà phê Đắk Lắk: Một số diện tích cà phê già cỗi bị sâu bệnh hại hủy để trồng lại Các diện tích khơng luân canh với trồng khác mà sau nhổ cày bừa làm đất lại đem trồng cà phê Hậu diện tích bước sang năm thứ có số vàng héo chết, sang năm thứ tỷ lệ chết tăng lên cuối phải hủy vườn Một số vườn hủy bỏ vài xấu, bị sâu bệnh đem trồng cà phê sau từ đến năm trồng lại già cỗi, vàng héo chết Các kết nghiên cứu nước cho thấy nhiều loại sinh vật gây hại cho cà phê tuyến trùng, nấm, rệp sáp, mối…Ngoài chế độ dinh dưỡng chế độ canh tác ảnh hưởng đến cà phê Để tái canh bền vững phải phịng trừ yếu tố Theo Nguyễn Văn Tuất cộng [16], nghiên cứu nguyên nhân gây vàng lá, chết nhóm cà 48 tăng đáng kể chiều dài rễ số rễ nhánh cà phê giai đoạn Tiến hành theo dõi số rễ nhánh chiều dài rễ cà phê thí nghiệm nghiên cứu; thí nghiệm chọn mẫu có sinh trưởng tương đối đồng để đo tiêu theo dõi, kết trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10 Ảnh hưởng vi khuẩn B.megaterium đến chiều dài rễ số rễ nhánh cà phê 20 ngày tuổi sau lây nhiễm Thời gian Số rễ nhánh Chiều dài rễ (cm) ĐC TN1 TN2 ĐC TN1 TN2 ngày 2,3±0,1 2,3±0,1 2,3±0,1 3,5±0,1 3,3±0,1 3,4±0,1 ngày 2,3±0,1 2,6±0,1 3,5±0,1 3,6±0,1 4,1±0,2 4,2±0,1 14 ngày 2,3±0,1 3,1±0,1 4,5±0,2 3,8±0,1 4,6±0,3 4,7±0,2 21 ngày 2,3±0,1 3,4±0,2 5,1±0,1 3,9±0,1 4,9±0,1 5,0±0,1 28 ngày 2,6±0,2 4,3±0,2 5,1±0,3 4,1±0,1 5,5±0,3 5,8±0,2 Kết bảng 3.10 cho thấy: Chiều dài rễ cơng thức thí nghiệm ln cao hơn công thức đối chứng qua ngày theo dõi Chiều dài rễ đo sau 28 ngày theo dõi công thức 5,5 5,8cm cịn cơng thức đối chứng 4,1cm Số rễ phụ cơng thức thí nghiệm tăng sinh nhiều so với công thức đối chứng Cụ thể, số rễ phụ công thức đối chứng không tăng sinh trình theo dõi với số rễ 2,3 cơng thức thí nghiệm số rễ tăng từ 2,3 lên 5,1 4,3 Số rễ phát triển nhanh thời điểm từ đến ngày thí nghiệm đối chứng gần không phát triển mà bắt đầu phát triển chậm sau 14 ngày Điều giúp cho hấp thu dinh dưỡng phát triển khỏe nhạnh giai đoạn phát triển sau 49 3.3.2.2 Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B megaterium đến sinh trưởng của cà phê sau 3,6,9 tháng theo dõi Kết bảng 3.11 hình 3.9 cho thấy: Chiều dài thân cơng thức thí nghiệm ln cao hơn công thức đối chứng qua tháng theo dõi Số cặp cơng thức thí nghiệm tăng sinh nhiều so với công thức đối chứng Số cặp triển nhanh thời điểm từ đến tháng thí nghiệm đối chứng gần không phát triển mà bắt đầu phát triển chậm lại Khi so sánh công thức cho thấy hấp thu dinh dưỡng phát triển khỏe nhạnh giai đoạn phát triển sau Bảng 3.11 Sinh trưởng cà phê vườn ươm sau 3,6 tháng Thời gian Chiều cao thân (cm) Số (cặp) ĐC TN1 TN2 ĐC TN1 TN2 tháng 39,2±1,1 39,1±0,9 39,0±0,5 4,6±0,2 4,68±0,1 4,64±0,1 tháng 41,1±0,8 42,5±0,7 45,2±0,6 5,2±0,1 5,43±0,1 5.51±0,2 tháng 51,7±1,2 60,3±1,7 62.4±1,5 6,2±0,2 7,1±0,2 7.3±0,3 50 TN2 TN1 ĐC (a): Cây cà phê sau tháng lây nhiễm TN2 TN1 (b): Cây cà phê sau tháng lây nhiễm ĐC 51 TN2 ĐC TN1 (c): Cây cà phê sau tháng lây nhiễm Hình 3.9 Cà phê vườn ươm sau tháng, tháng, tháng lây nhiễm 3.3.2.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B Megaterium 18 đến sinh trưởng của cà phê 1,5 tuổi Mỗi cơng thức thí nghiệm thực 20 cà phê Các tiêu sinh trưởng phát triển theo dõi 15 cà phê thí nghiệm (trừ bỏ cà phê không thu số liệu cà phê tiếp giáp cơng thức thí nghiệm cơng thức đối chứng) Kết thí nghiệm thể bảng 3.12 Bảng 3.12 Ảnh hưởng vi khuẩn vật nội sinh tới khả sinh trưởng phát triển cà phê TT Số cành/cây Chiều dài cành số (cm) TN 25,86±0,9 ĐC 22,53±1,2 Chiều dài cành số (cm) Số cặp lá/cành Số cặp lá/cành 29,42±1,1 41,3±1,0 5,3±0,2 7,6±0,3 22,67±0,9 32,87±0,8 3,6±0,2 6,03±0,2 52 Bảng 3.12 cho thấy: Số cành/cây; chiều dài cành số ; số cành, số cặp lá/cành cà phê 1,5 tuổi công thức thí nghiệm nhiều so với cơng thức đối chứng Cụ thể: Số cành cấp có cà phê cơng thức thí nghiệm 25,86 cành chênh 3,33 cành so với công thức đối chứng 22,53 cành; Chiều dài cành số cành số (tính từ xuống) cà phê cơng thức thí nghiệm dài so với công thức đối chứng 6,75 cm 8,67 cm; Số cặp lá/cành có cành số cành số cà phê cơng thức thí nghiệm nhiều so với cơng thức đối chứng 1,7cm 0,57cm Tóm lại, qua thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium lên sinh trưởng cà phê giai đoạn cà phê tái canh 1,5 tuổi Bước đầu cho thấy sử dụng chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 giai đoạn vườn ươm nhà lưới cà phê sinh trưởng tốt sau tháng theo dõi; cà phê tái canh 1,5 tuổi bước đầu ghi nhận sinh trưởng phát triển tốt, số cành/cây 25,86 cành/cây, chiều dài cành số 29,42cm, chiều dài cành số 41,3cm 53 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN - Chủng Bacillus megaterium 18 có hình thái tế bảo có khuẩn lạc lồi, khơng bóng, nhầy, nhăn, khả phân giải chất CMC tinh bột Thời gian tối ưu cho sinh trưởng chủng vi khuẩn 30 giờ; khả sinh tổng hợp chitinase với lượng enzyme sinh tối đa thời điểm 36 giờ, nuôi nhiệt độ 37oC; chủng Bacillus megaterium18 sinh trưởng tối ưu pH 7; nồng độ NaCl 1% Chủng Bacillus megaterium 18 phát triển tốt mơi trường có nguồn cacbon saccharose nguồn nitơ KNO3 - Chủng Bacillus megaterium 18 xác định khả phân hủy trứng tuyến trùng nồng độ 10-30%, tỷ lệ trứng bị phân hủy từ 94,2 – 96,8%; ấu trùng nở bị chết phân hủy, ấu trùng chết kiểu bị co rút thể, tỷ lệ ấu trùng bị phân hủy từ 72-85% sau ngày - Thử nghiệm lên thuốc in vitro cho thấy chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 giúp tăng trưởng chiều cao thân chiều dài rễ - Thử nghiệm ảnh hưởng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium lên sinh trưởng cà phê giai đoạn nhà lưới cho thấy sinh trưởng tốt sau tháng theo dõi - Kết đánh giá ảnh hưởng vi khuẩn nội sinh B megaterium 18 đến sinh trưởng cà phê tái canh 1,5 tuổi bước đầu ghi nhận tháng sinh trưởng phát triển tốt 4.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu khả phòng trừ bệnh hại tuyến trùng dòng vi khuẩn nội sinh khác cà phê - Tiếp tục đánh giá hiệu lực chế phẩm vi sinh vật nội sinh với thời gian dài để có kết tồn diện hơn, biện pháp phịng trừ sinh học thường có tác dụng chậm kéo dài bền vững 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Báo cáo tổng kết đề tài cấp Nhà nước KHCN-TN3/11-15 (2011-2015): Nghiên cứu phát triển ứng dụng số chế phẩm có nguồn gốc sinh học canh tác chè, cà phê, hồ tiêu theo hướng phát triển bền vững Tây Nguyên Nguyễn Thị Lài Đỗ Thị Mỹ Hiền , 2019, Thách thức xuất khuẩn cà phê Việt Nam nay, Tạp chí Cơng thương, Số 9: 85-89 Ủy ban nhân dân tỉnh Đắk Lắk , 2013, Báo cáo Đề án tiếp tục phát triển cà phê bền vững tỉnh Đắk Lắk đến năm 2020, tầm nhìn 2030, Đắk Lắk Trương Hồng, Đinh Thị Nhã Trúc Nguyễn Xuân Hòa, 2013, Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật tổng hợp tiết kiệm chi phí đầu vào cà phê Tây Nguyên, Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ nhất, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội: 914-922 Báo cáo tổng kết đề tài cấp Nhà nước KHCN-TN3/11-15 (2011-2015): Nghiên cứu hồn thiện chuyển giao cơng nghệ sản xuất sản phẩm sinh học POLYFA-TN3 góp phần cải tạo đất cho vùng Tây Nguyên Báo cáo tổng kết đề tài cấp Nhà nước KHCN-TN3/11-15 (2011-2015): Nghiên cứu quy trình cơng nghệ sản xuất phân urê NPK nhả chậm ứng dụng triển khai cho trồng Tây Nguyên Báo cáo tổng kết Đề tài Khoa học cấp Nhà nước KHCN.02.07B (19962000): Nghiên cứu công nghệ vi sinh (vi khuẩn, nấm, virut) để sản xuất chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật phòng trừ sâu hại trồng Cục Bảo vệ thực vật Viện Bảo vệ thực vật, 1995, Báo cáo khoa học cải tiến công tác BVTV Việt Nam (dự án VNM.8910-030, giai đoạn 1990-1995) 55 Nguyễn Thị Chắt, 1999, Cà phê sâu bệnh, cỏ dại biện pháp phịng trừ Nhà xuất bản Nơng nghiệp 10 Nguyễn Văn Thao, Nguyễn Thị Thu, Hà Việt Hải cộng , 2010, Giới thiệu số sản phẩm khoa học áp dụng phục vụ sản xuất nông nghiệp Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam (1975 - 2010) Tiểu ban chất có hoạt tính sinh học - 10/2010 11 Trần Kim Loang, 2002, Nghiên cứu số nguyên nhân gây tượng vàng lá, thối rễ cà phê vối (Coffea canephora pierre exfroehner) Đắc Lắc khả phịng trừ, Luận án Tiến sĩ nơng nghiệp 12 White T, T Burns, S Lee, J Taylor, 1990, Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, In: PCRprotocols A guide to methods and applications Academic Press, Inc., San Diego, Calif 315-322 13 Nguyễn Ngọc Châu, 2003, Tuyến trùng thực vật sở phòng trừ, NXB Khoa học Kỹ thuật 14 Nguyễn Thu Hà, Vũ Thúy Nga, Trương Thị Tú Anh, Lương Hữu Thanh, Đặng Thị Thu Thảo, Đào Văn Thông, 2007, Nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học trừ tuyến trùng, nấm bệnh vùng rễ cà phê hồ tiêu (Tài liệu dẫn) 15 P.Q.Trinh , Eduardo de la Peña, Chau N Nguyen, Hoa X Nguyen and Maurice Moens, 2009, Plant-parasitic nematodes associated with coffee in Vietnam 16 Nguyễn Tất Thắng, Đỗ Tấn Dũng Nguyễn Văn Tuất, 2011, Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Raltonia solanacearum Smith) hại khoai tây vùng Hà Nội - phụ cận biện pháp phòng trừ Tạp chí Khoa học Phát triển 9(5): 725 – 734 56 17 Bacon CW, White JF, 2000, Microbial endophytes New York Marcel Dekker 18 Hallmann J, Quadt-Hallmann A, Mahaffee WF & Kloepper JW, 1997, Bacterial endophytes in agricultural crops Can J Microbiol 43: 895–914 19 Kado, C I., 1992, “Plant pathogenic bacteria”, The prokaryotes, ed Balows, A., et al., Springer-Verlag, New York, 660 – 662 20 Bacon, Charles W and White, James F., 2000, Microbial endophytes, Marcel Dekker, New York 21 Verma, Subhash C., Ladha, Jagdish K and Tripathi, Anil K., 2001, "Evaluation of plant growth promoting and colonization ability of endophytic diazotrophs from deep water rice", Journal of Biotechnology, Vol 91(2): 127- 141 22 Bressan, Wellington and Borges, Marcela T., 2004, "Delivery methods for introducing endophytic bacteria into maize", Biocontrol, Vol 49(3): 315-322 23 McInroy, J.A and Kloepper, J.W., 1994, "Novel bacterial taxa inhabiting internal tissue of sweet corn and cotton", in Ryder, M.H., Stephens, P.M., and Bowen, G.D (Editors), Improving plant productivity with rhizosphere bacteria, CSIRO, Melbourne, Australia 24 Oliveira, Marcelo N V., Santos, Thiago M A., Vale, Helson M M., Delvaux, Júlio C., Cordero, Alexander P., Ferreira, Alessandra B., Miguel, Paulo S B., Tótola, Marcos R., Costa, Maurício D., Moraes, Célia A and Borges, Arnaldo C , 2013, "Endophytic microbial diversity in coffee cherries of Coffea arabica from Southeastern Brazil", Canadian journal of microbiology, Vol 59(4): 221-230 57 25 Ryan, Robert P., Germaine, Kieran, Franks, Ashley, Ryan, David J and Dowling, David N , 2008, "Bacterial endophytes: recent developments and applications", FEMS microbiology letters, Vol 278(1): 1-9 26 Compant, Stéphane, Clément, Christophe and Sessitsch, Angela, 2010, "Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization", Soil Biology and Biochemistry, Vol 42(5): 669-678 27 Lodewyckx, Cindy, Taghavi, Safieh, Porteous, Fiona, Moore, Edward R B., Mezgeay, Max, der Lelie, Daniel van and Vangronsveld, Jaco, 2002, "Endophytic bacteria and their potential applications", Critical Reviews in Plant Sciences, Vol 21(6): 583-606 28 Jasim, B., John Jimtha, C., Jyothis, Mathew and Radhakrishnan, E K (2013), "Plant growth promoting potential of endophytic bacteria isolated from Piper nigrum", Plant Growth Regulation, Vol 71(1): 1-11 29 Nguyễn Thị Huỳnh Như, Nguyễn Hữu Hiệp, Nguyễn Minh Đời, Trần Nguyễn Nhật Khoa Thái Trần Phương Minh, 2013, "Phân lập dòng vi khuẩn nội sinh có khả tổng hợp IAA cố định đạm chuối", Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ Số 27 (Phần B): 24-31 30 Milca, Rachel Costa Ribeiro Lins, Jssica, Martins Fontes, Nataliane, Marques Vasconcelos, Danilo, Mamede Silva Santos, Ozias, Elias Ferreira, Joo, Lcio de Azevedo, Janete, Magali Arajo and Glucia, Manoella Souza Lima (2014), "Plant growth promoting potential of endophytic bacteria isolated from cashew leaves", African Journal of Biotechnology, Vol 13(33): 3360-3365 31 Rosenblueth, Mónica and Martínez-Romero, Esperanza (2006), "Bacterial endophytes and their interactions with hosts", Molecular plant-microbe interactions, Vol 19(8): 827-837 58 32 Chanway CP., 1997, Inoculation of tree roots with plant growth promoting soil bacteria: an emerging technology for reforestation Forest Sci 43: 99–112 33 Murugappan, R M., Begum, S Benazir and Roobia, R Raja (2013), "Symbiotic influence of endophytic Bacillus pumilus on growth promotion and probiotic potential of the medicinal plant Ocimum sanctum", Symbiosis, Vol 60(2): 91-99 34 Nguyễn Thu Hà , Hà Thanh Toàn Cao Ngọc Điệp, 2009, Phân lập đặc tính dịng vi khuẩn nội sinh số cỏ chăn nuôi Tạp chí cơng nghệ sinh học, 7(2): 241-250 35 Nguyễn Thu Hà, Phạm Văn Toản cs., 2005, Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus cho sản xuất phân bón vi sinh vật chức Khoa học Công nghệ Phát triển nông thôn 20 năm đổi mới, Tập 1-Trồng trọt BVTV, Bộ NN&PTNT, Nhà xuất Chính trị quốc gia 36 Lương Thị Hồng Hiệp Cao Ngọc Điệp, 2011, Phân lập nhận diện vi khuẩn nội sinh cúc xuyến chi (Wedelia Trilobata (L.) Hitche) kỹ thuật PCR Tạp chí khoa học, trường Đại học Cần Thơ, 18a: 168-176 37 Văn Thị Phương Như, Cao Ngọc Điệp, 2013, Phân lập đặc tính vi khuẩn nội sinh lúa (Oryza sativa L.) trồng đất tỉnh Phú Yên, Việt Nam, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2: 450-454 38 Cao Ngọc Điệp Nguyễn Thành Dũng, 2010, Đặc tính vi khuẩn nội sinh phân lập Khóm trồng đất phèn Vĩnh Thuận, tỉnh Kiên Giang Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 15a: 54-63 39 Cao Ngọc Điệp Nguyễn Ái Chi, 2009, Phân lập đặc tính vi khuẩn nội sinh phân lập Khóm trồng đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An, Việt Nam Tuyển tập cơng trình nghiên cứu của hội 59 nghị Công nghệ sinh học năm 2009 tổ chức thành phố Hồ Chí Minh, 23-24, tháng 10 năm 2009 40 Vega, Fernando E., Pava-Ripoll, Monica, Posada, Francisco and Buyer, Jeffrey S (2005), "Endophytic bacteria in Coffea arabica L", Journal of Basic Microbiology, Vol 45(5): 371 41 Mekete, Tesfamariam, Hallmann, Johannes, Kiewnick, Sebastian and Sikora, Richard (2009), "Endophytic bacteria from Ethiopian coffee plants and their potential to antagonise Meloidogyne incognita", Nematology, Vol 11(1): 117- 117 42 Miguel, Paulo Sérgio Balbino, Delvaux, Julio Cesar , de Oliveira, Marcelo Nagem Valério , Monteiro, Larissa Cassemiro Pacheco , Freitas, Fernanda de Souza, Costa, Maurício Dutra , Tótola, Marcos Rogério , de Moraes, Célia Alencar and Borges, Arnaldo Chaer (2013), "Diversity of endophytic bacteria in the fruits of Coffea canephora ", African Journal of Microbiology Research, Vol 7(7): 586-594 43 Silva, Harllen S A., Tozzi, João P L., Terrasan, César R F and Bettiol, Wagner (2012), "Endophytic microorganisms from coffee tissues as plant growth promoters and biocontrol agents of coffee leaf rust", Biological Control, Vol 63(1): 62 44 Garbeva, P., van Veen, J A and van Elsas, J D (2004), "Microbial diversity in soil: Selection of microbial populations by plant and soil type and implications for disease suppressiveness", Annual Review of Phytopathology, Vol 42 (1): 243-270 45 Berg, Gabriele and Hallmann, Johannes (2006), "Control of plant pathogenic fungi with bacterial endophytes", in Schulz, Barbara J E , Boyle, Christine J C., and Sieber, Thomas N., Editors, Microbial root endophytes, Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg: 53-69 60 46 Shiomi, Humberto Franco, Silva, Harllen Sandro Alves, Melo, Itamar Soares de, Nunes, Flávia Vieira and Bettiol, Wagner (2006), "Bioprospecting endophytic bacteria for biological control of coffee leaf rust", Scientia Agricola, Vol 63(1) 47 Kloepper, Joseph W., Ryu, Choong-Min and Zhang, Shouan (2004), "Induced systemic resistance and promotion of plant growth by Bacillus spp.", Phytopathology, Vol 94(11): 1259-1266 48 Sikora, R A., Schäfer, K and Dababat, A A (2007), "Modes of action associated with microbially induced in planta suppression of plantparasitic nematodes", Australasian Plant Pathology, Vol 36(2): 124-134 49 Kloepper, Joseph W and Ryu, Choong-Min, 2006, "Bacterial endophytes as elicitors of induced systemic resistance", in Schulz, B., Boyle, C., and Sieber, T (Editors), Soil biology, microbial root endophytes,, Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg: 33-52 50 Nguyễn Ngọc Mỹ, 2012, Nghiên cứu, phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh rễ cà phê chè (Coffea arabica) Tây Nguyên, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Tây Nguyên 51 Trương Vĩnh Thới, 2012, Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh rễ cà phê vối (Coffea canephora Pierre var robusta) Đắk Lắk, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Tây Nguyên, Đắk Lắk 52 Ngô Văn Anh, Nguyễn Anh Dũng Trần Trung Dũng, 2017, "Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn nội sinh rễ cà phê (Coffea canephora Pierre var robusta) có hoạt tính cố định đạm sinh tổng hợp Indole Acetic Acid (IAA) Đắk Lắk", Tạp chí Khoa học Trường Đại học Tây Nguyên 23: 59-64 61 53 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty, 1976, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 54 Brijwal L, Aseesh P ADN Sushma T., 2013, An overview on phytomedicinal approaches of Zanthoxylum armatum DC.; An important magical medicinal plant Journal of Medicinal Plants Research 7: 366-370 55 Khan, M R., Khan, S M., Mohiddin, F A and Askary, T H., 2007, “Effect of certain phosphate-solubilizing bacteria on root-knot nematode disease of mungbean”, First International Meeting on Microbial Phosphate Solubilization, Springer Netherlands, Dordrecht: 341-346 56 Holt, J H., Sneath, P H and Krieg, N R., 1994 Bergey’s Manual of determinative bacteriology th ed., Lippincott Williams and Wilkins, New York, 192-194 57 Lee S., Lee J., Jin, Y I., Jeong J C., Chang Y H., Lee Y., Kim, M., 2017, Probiotic characteristics of Bacillus strains isolated from Korean traditional soy sauce LWT-Food Science and Technology, 79: 581-524 58 Jungjoon Seough, Peter H Yoon, 2012, Quasilinear theory of anisotropy‐beta relations for proton cyclotron and parallel firehose instabilities 59 L.T.M Linh, N.T Duyen, T.Q Phap, N.T.P Anh, and P.V Ty, 2015, Biologycal control of Meloidogyne incognita on Coffee by Paecilomyces javanicus, Vietnam Journal of Biotechnology 13: 421– 424 (in Vietnamese) 60 Mahmoud, Mohamed Ahmed Youssef, Hassan, Abd-El-Khair and Wafaa, Mohamed Abd El-Hameed El-Nagdi, 2017, "Management of root knot nematode, Meloidogyne incognita infecting sugar beet as affected by 62 certain bacterial and fungal suspensions", CIGR Journal, Special issue: 293-301 61 Gao, Huijuan, Qi, Gaofu, Yin, Rong, Zhang, Hongchun, Li, Chenggang and Zhao, Xiuyun, 2016, "Bacillus cereus strain S2 shows high nematicidal activity against Meloidogyne incognita by producing sphingosine", Scientific Reports, Vol 6: 1-11 62 Ongena, M and Jacques, P., 2008, "Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol", Trends Microbiol, Vol 16(3): 115-125 63 Krebs, Birgit, Höding, Birgit, Kübart, Sabine, Workie, Melkamu, Junge, Helmut, Schmiedeknecht, G., Grosch, Rita, Bochow, Helmut and Hevesi, Mária, 1998, "Use of Bacillus subtilis as biocontrol agent I Activities and Characterization of Bacillus subtilis strains", Journal of Plant Diseases and Protection, Vol 105(2): 181-197 64 Lian, L.H., Tian, B.Y., Xiong, R., Zhu, M.Z., Xu, J and Zhang, K.Q., 2007, "Proteases from Bacillus: a new insight into the mechanism of action for rhizobacterial suppression of nematode populations", Letters in Applied Microbiology, Vol 45(3): 262-269 ... ? ?Đánh giá khả diệt tuyến trùng kích thích sinh trưởng cà phê chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium” Mục đích, yêu cầu: - Mục đích: Đánh giá khả diệt tuyến trùng kích thích sinh trưởng cà. .. collagenase chitinase sản sinh chủng vi khuẩn Bacillus nguyên nhân gây chết tuyến trùng 3.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐỐI VỚI CÂY CÀ PHÊ CỦA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH Bacillus megaterium... - Nội dung 1: Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 24 - Nội dung 2: Đánh giá khả diệt tuyến trùng cà phê chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 - Nội