Luận văn ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới ion s5 x ltm trong giám định hài cốt lâu năm

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thống kê tỷ lệ đột biến hệ gen ty thể 16 Bảng 1.2 T ng hợp số công nghệ giải trình tự hệ 24 Bảng 2.1 Danh sách 14 cặp mồi dùng cho Pool Pool 31 Bảng 2.2: Danh sách loại Kit sử dụng chuẩn bị thƣ viện 32 Bảng 2.3: Nồng độ mẫu xây dựng đƣờng chuẩn: 35 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng Realtime PCR 35 Bảng 2.5: Qui trình chuẩn bị thƣ viện thủ cơng 38 Bảng 2.6 Phƣơng pháp khuếch đại với loại mẫu khác 38 Bảng 3.1: Thành phần PCR khuếch đại đoạn geb để tạo thƣ viện 49 Bảng 3.2: Nồng độ pha loãng thƣ viện 52 Bảng 3.5 Nồng độ ADN 15 mẫu có nồng độ thấp sau làm giàu thƣ viện lần 55 Bảng 3.6 Bảng t ng hợp kết giải trình tự NGS chip chip 59 Bảng 3.7: Tiêu chí đánh giá chất lƣợng giải trình tự 62 Bảng 3.8: Phân loại đánh giá kết Sanger S5 63 Bảng 3.9: Bảng t ng hợp mẫu phát có vùng bị phân hủy thơng qua phƣơng pháp đọc trình tự Ion Torrent S5 66 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện giới có hàng triệu ngƣời tích chiến tranh, thiên tai, tai nạn máy bay… chƣa xác định đƣợc danh tính Riêng Việt Nam, dù chiến tranh kết thúc 40 năm, nhƣng hậu chiến tranh để lại vô nặng nề Theo số liệu Cục Ngƣời có cơng, Bộ Lao Động, Thƣơng binh Xã hội có 1,1 triệu liệt sĩ hy sinh có khoảng 500.000 hài cốt liệt sĩ chƣa đƣợc định danh, 300.000 hài cốt đƣợc quy tập an táng nghĩa trang liệt sĩ khoảng 200.000 hài cốt chƣa đƣợc quy tập nghĩa trang liệt sĩ mà nằm rải rác tỉnh phía Nam, Lào Campuchia [1][2] Thông thƣờng, hệ gen nhân cho phép định danh xác đến cá thể thơng qua đoạn lặp từ 2-6 nucleotide STR (Short Tandem Repeat) locus khác nhiễm sắc thể Tuy nhiên, mẫu hài cốt lâu năm, phần mô, xƣơng bị phân hủy mạnh ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng (nhiệt độ, UV, pH, thành phần vô hệ vi sinh vật), dẫn đến toàn ADN hệ gen nhân gần nhƣ bị phân hủy hồn tồn khơng có khả phân tích Chính vậy, nay, việc giám định hài cốt liệt sĩ hồn tồn dựa vào phân tích ADN ty thể (Mitochondiral DNA mtADN), cấu trúc dạng vòng giúp loại ADN bền dƣới tác động mơi trƣờng [3] Việc xác định danh tính dựa việc so sánh nucleotide vùng siêu biến (HV1, HV2 HV3) thuộc hệ gen ty thể hài cốt với thân nhân Phƣơng pháp giải trình tự ADN ty thể dùng giám định đƣợc sử dụng ph biến Việt Nam nay, nhƣ số phịng thí nghiệm giới dựa nguyên lý Sanger Ƣu điểm phƣơng pháp dễ thực hiện, giá thành rẻ Tuy nhiên, giải trình tự Sanger đọc đƣợc mẫu, độ lặp lại thấp, chất lƣợng tín hiệu khơng n định nên gây nhiều khó khăn cho việc phân tích điểm Heteroplasmies Poly-Cytosine Hơn nữa, nồng độ ADN sử dụng cho phản ứng giải trình tự phƣơng pháp Sanger tƣơng đối cao (~10 ng/µl) [4] Do đó, nhằm nâng cao suất, độ xác nhƣ tận dụng đƣợc ƣu vƣợt trội hệ thống đọc trình tự hệ (NGS) cơng tác giám định hài cốt liệt sĩ Việt Nam, thực đề tài “Ứng dụng công nghệ giải trình tự Ion Torrent S5XLTM việc giám định hài cốt lâu năm” Nghiên cứu sử dụng kit Precision ID mtADN Control Region Panel (Thermofisher) dựa hệ thống giải trình tự hệ (NGS) IonS5-XL Thông qua việc sử dụng 14 cặp mồi với biến thể khác nhau, tạo điều kiện thuận lợi cho đọc trình tự 1,2 kb vùng HV1, HV2 HV3 Không vậy, phƣơng pháp cho kết tối đa từ mẫu với nồng độ ADN đầu vào khoảng pg Với coverage ~ 200x, phƣơng pháp giải khó khăn phân tích điểm Heteroplasmies and Poly-Cytosine [5] Đề tài đƣợc thực Trung tâm Giám định ADN, Viện Công nghệ Sinh học với hai mục tiêu: Xây dựng quy trình chạy bước đầu áp dụng phương pháp giải trình tự hệ (NGS) để giám định ADN hài cốt lâu năm Phân tích liệu vùng siêu biến ADN ty thể mẫu nghiên cứu từ kết thu thơng qua hệ thống giải trình tự hệ (NGS) CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẶC ĐIỂM GIẢI PHẪU VÀ MÔ HỌC XƢƠNG 1.1.1 Thành phần cấu trúc xƣơng Bộ xƣơng ngƣời trƣởng thành gồm 206 xƣơng (phần lớn xƣơng đơi) đƣợc phân thành nhóm [6]: Hình 1.1: Bộ xương người (nhìn từ phía trước) [7] + Xƣơng gồm có: - Cột sống: có 32 đốt sống, có đốt sống dính liền tạo nên xƣơng đốt sống cụt dính liền tạo nên xƣơng cụt (hình 1.1) - Lồng ngực: Gồm có đoạn cột sống ngực, xƣơng ức 12 đôi xƣơng sƣờn + Xƣơng sọ mặt: Gồm xƣơng sọ 14 xƣơng mặt họp thành hộp sọ khối xƣơng mặt + Xƣơng chi xƣơng chi dƣới: Chi dính vào thân đai vai (gồm xƣơng đòn xƣơng vai); Chi dƣới dính vào thân đai chậu (gồm xƣơng chậu dính thẳng vào xƣơng cột sống) Mỗi chi có đoạn: cánh tay đùi, cẳng tay cẳng chân, bàn tay bàn chân (gồm có c tay c chân, bàn tay bàn chân, ngón tay ngón chân) [6] Cấu trúc xƣơng đƣợc tạo thành từ hai loại mô xƣơng: xƣơng vị xƣơng ống Hình 1.2 Cấu trúc xương ống [8] Xƣơng loại mô liên kết đặc biệt bị canxi hóa có cấu trúc dạng Cấu tạo xƣơng gồm tế bào, chất sợi liên kết (chất sợi liên kết gọi chung chất ngoại bào xƣơng hay chất xƣơng hay chất xƣơng), chiếm tỷ lệ lớn Lá xƣơng đơn vị cấu tạo mô xƣơng, cấu tạo gồm tế bào xƣơng chất xƣơng [9] Xƣơng có chức chống đỡ vận động, ngồi cịn bảo vệ, hỗ trợ q trình tạo huyết chuyển hóa phospho-calci Mơ xƣơng thành phần quan trọng cấu tạo xƣơng Về mặt đại thể xƣơng gồm dạng (loại) cấu tạo: - Xƣơng dẹt đầu xƣơng dài: gồm có lớp bên ngồi vững (vỏ xƣơng) bao quanh mạng lƣới chịu lực hình thành từ xƣơng tạo thành hệ thống vách mỏng không đƣợc gọi bè xƣơng, xếp theo nhiều hƣớng khác nối với gọi mơ xốp Giữa bè có hốc chứa tủy xƣơng - Xƣơng dài: Phần thân xƣơng có xƣơng xếp đồng tâm tạo thành cấu trúc đặc biệt đƣợc gọi hệ thống Havers Mỗi hệ thống có dạng hình trụ, gồm xƣơng xếp vịng, khối trụ ống Havers chứa mạch máu, mô liên kết Ở mức độ hiển vi, xƣơng cấu tạo từ vật liệu cứng, đồng nhất, bên xen lẫn chúng ba loại tế bào đặc trƣng bao gồm: tạo cốt bào, cốt bào hủy cốt bào Những tế bào phân bố khắp bề mặt xƣơng, tùy thuộc vào trạng thái sinh lý mô xƣơng (đang trình hình thành bè xƣơng, khống hóa chất xƣơng hay sửa chữa) Hình 1.3: Ba loại tế bào xương [6] Tạo cốt bào (osteoblast – nguyên bào xƣơng) tế bào đơn nhân chƣa trƣởng thành chịu trách nhiệm cho hình thành xƣơng, sau tự nằm xƣơng tạo chất xung quanh trở thành cốt bào Nằm bề mặt giá đỡ tạo xƣơng, chúng tiết osteoid (một loại hỗn hợp protein) mà sau bị canxi hóa cách liên kết với hydroxyt apatite (HA - chất carbon chƣa cân hóa học) để hình thành bè xƣơng Tạo cốt bào sản xuất enzyme tham gia vào q trình canxi hóa, nhƣ prostaglandin (ức chế hoạt động hủy cốt bào) alkaline phosphate (tăng khả di động hủy cốt bào làm tăng hủy xƣơng) Nguồn gốc chúng từ loại tế bào trung mơ chƣa biệt hóa gọi tế bào sinh xƣơng [10] Cốt bào (Osteocyte) tế bào xƣơng trƣởng thành hình ngơi nằm hốc nhỏ chất gian bào gọi xƣơng (lacunae) Chúng có nguồn gốc từ tạo cốt bào Hủy cốt bào (osteoclasts) tế bào đa nhân lớn, từ đến vài chục nhân, nằm vách xƣơng cấu trúc gọi Howship (hay hố tái hấp thu), bào tƣơng có nhiều ti thể, bào quan khác phát triển Chúng tế bào tiêu hủy xƣơng hủy sụn nhiễm can xi với cƣờng độ cao, đóng vai trị định việc tu sửa xƣơng Các hủy cốt bào có nguồn gốc từ dịng tế bào đơn nhân (mono bào) đặc biệt tủy xƣơng Thành phần hóa học xƣơng chứa 70% chất vơ (gồm thành phần vơ định hình muối phốtphát canci [Ca9(PO4)6], thành phần tinh thể dạng hình que hình ống hydroxytapatít - HA) 30% chất hữu (osteroid) bao gồm chủ yếu collagen loại I, protein không collagen glycoprotein nhƣ: glycosaminoglycan, osteocalcin, osteonectin, ostepontin, sialoprotein xƣơng bào quan khác) Xƣơng cứng chất xƣơng chứa collagen bị calci hóa glycosaminoglycan [11] Calci hóa collagen ban đầu diễn vùng GZ, tinh thể HA dạng tiểu cầu điền vào vùng trống mở rộng dọc theo kênh sợi phân tử tropocollagen liền kề Trong giai đoạn cuối calci hóa, tinh thể HA phát triển lấp đầy khoảng sợi, ion khoáng thay dần phân tử nƣớc liên kết sợi Do phần lớn chất khống nằm khơng gian Mơ xƣơng hồn tồn trƣởng thành chứa khoảng 46% collagen, 46% HA (hydroxytapatít) 8% nƣớc [12] 1.1.2 Phân bố ADN xƣơng Thời gian tồn mô xƣơng sau thể chết phụ thuộc điều kiện môi trƣờng nhƣ chôn đất, phơi trực tiếp khơng khí hay ngâm nƣớc (mặn ngọt) Dƣới tác động tác nhân, trình phân hủy xƣơng diễn theo chế xác định, ví dụ nhƣ đất xƣơng phân hủy nấm, vi khuẩn đất xâm nhập vào khe hở màng xƣơng bắt đầu phân hủy ma trận khoáng, chất xƣơng sau vài năm, mơi trƣờng nƣớc vi khuẩn lam có vai trò định, chúng đẩy nhanh phân hủy cách tăng độ xốp xƣơng Mặc dù chế phân hủy mô xƣơng đƣợc nghiên cứu rõ ràng nhƣng thối hóa ADN xƣơng theo thời gian, đặc biệt nguồn gốc vị trí ADN nằm xƣơng lại chƣa đƣợc làm rõ Hiện tồn nhiều giả thuyết khác nhau, trái ngƣợc Tuy nhiên, hầu hết giả thuyết thống ADN mô xƣơng phần lớn có nguồn gốc từ tế bào xƣơng, cịn với xƣơng lâu năm ADN có nguồn gốc từ ma trận khoáng Sự tồn ADN lâu dài xƣơng nhờ vào ma trận khoáng q trình calci hóa đóng vai trị quan trọng việc “lƣu trữ, bảo quản” ADN Đây sở khoa học bƣớc decalci (khử khoáng) đƣợc áp dụng hầu hết phƣơng pháp tách chiết ADN từ xƣơng [13] Các tác giả Lindahl, 1993 Okazaki, 2001 cho ADN đƣợc hấp thụ HA (hydroxyapatite) trình hình thành tinh thể ma trận khoáng xƣơng [14] Các tác giả giả thuyết xƣơng tồn loại tinh thể bioapatite tạo thành từ hấp thụ ADN bề mặt HA Chính nhờ tƣơng tác mà cấu trúc ADN đƣợc bảo tồn thời gian dài Ở thể sống, hình thành bioapatite diễn q trình calci hóa tạo xƣơng q trình tiêu sụn tái cấu trúc xƣơng Một chế tạo bioapatite khác xƣơng sau thể bị chết thành phần tế bào mô xƣơng sau phân hủy giải phóng đoạn ADN có độ dài khác vào khe hở cực nhỏ xƣơng, chúng đƣợc trộn lẫn dung dịch bão hòa ion calci phosphate, sau đƣợc hấp thụ bị gói gọn trình kết tinh HA Hỗ trợ thêm cho giả thuyết chứng trình tự ADN tìm thấy xƣơng c xƣơng lâu năm thƣờng có kích thƣớc 60-150 bp xấp xỉ 25-54 nm tƣơng đƣơng với kích thƣớc điển hình tinh thể HA đƣợc tìm thấy xƣơng là: dày 2-5 nm; rộng 5-24 nm; dài 1555 nm [15] Các thực nghiệm invitro Kitamura năm 2011 mơ hình lý thuyết Mrevlishvili Svintradze năm 2005 lại đặt giả thuyết ADN nhân từ tế bào xƣơng liên kết chủ yếu với phân tử collagen, ADN nhân hoạt động nhƣ “giàn giáo” việc tập hợp phân tử collagen thành sợi Lực tƣơng tác collagen ADN chủ yếu đƣợc hình thành liên kết hydro, mối liên kết chặt chẽ [16][17] Orgel cộng năm 2005 cho mảnh ngắn ADN nhân, ADN ty thể mắc kẹt lại trình t ng hợp sợi calci hóa collagen, chủ yếu liên kết phân tử tropocollagen, phần khác hấp phụ lên bề mặt HA sau „đóng gói‟ tinh thể ma trận xƣơng [18] Điều hồn tồn xảy q trình calci hóa tạo xƣơng trình tiêu sụn, lƣợng lớn ADN ty thể, ADN nhân đƣợc giải phóng vào chất xƣơng sau hủy cốt bào tạo cốt bào bị chết (apoptosis) Những sợi hay đoạn ADN sau liên kết trực tiếp với bề mặt sợi collagen hấp phụ lên bề mặt tinh thể HA (HydroxytApatit) trình hình thành Áp dụng phƣơng pháp phân tích đại, năm 2012 nhóm nghiên cứu Paula F.Campos cộng đƣa giả thuyết vị trí ADN tồn xƣơng c , dựa vào liên kết ADN với HA collagen [19][20]: a) ADN liên kết với sợi collagen sau phủ HA hình thành sợi calci hóa b) ADN bị ràng buộc chặt chẽ đóng gói trình phát triển tinh thể HA khu vực bên sợi collagen q trình calci hóa c) ADN hấp phụ lên sợi collagen tự hình thành trình nƣớc xƣơng calci hóa (thay phân tử nƣớc sợi khống) dƣới tác động hóa chất cơng vi sinh vật xƣơng thối hóa d) ADN liên kết bọc tinh thể HA xƣơng tái kết tinh tiêu hủy Cơ chế (a) (b) diễn thể (c) (d) diễn sau chết Mơ hình lý thuyết đƣợc ủng hộ nhiều cả, đặc biệt kết phƣơng pháp tách chiết ADN từ xƣơng sử dụng bƣớc khử khống hồn tồn lẫn phân giải protein proteinase K cho kết khả quan 1.1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến cấu trúc tồn ADN hài cốt ADN mẫu hài cốt bị biến đ i tác động yếu tố môi trƣờng không thuận lợi nhƣ tia UV, nhiệt độ, độ ẩm cao Cấu trúc phân tử ADN bị ảnh hƣởng tiêu cực từ q trình oxy hóa, thủy phân Các yếu tố môi trƣờng (nhƣ acid humic từ đất, ADN vi khuẩn…) tách chiết mà không loại bỏ đƣợc ảnh hƣởng xấu đến trình PCR làm giảm thành cơng phân tích ADN Mức độ phân huỷ sinh học phụ thuộc chủ yếu vào hai yếu tố: thời gian điều kiện môi trƣờng [21] Hài cốt thƣờng tiếp xúc với điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt, ảnh hƣởng nhiều đến mức độ bảo quản mẫu Sau tế bào chết, ADN bắt đầu phân mảnh Tiến trình tích lũy theo thời gian, điều kiện môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, độ ẩm độ pH khác làm thay đ i tốc độ mức độ phân mảnh Tác động khác từ bên nhƣ: nhiệt độ cao, (đôi cháy), ngâm nƣớc, chôn đất vi sinh vật phát triển yếu tố làm gia tăng phân hủy hài cốt đứt gãy chuỗi ADN [22][23] Sự gia tăng nhiệt độ độ ẩm dẫn đến tăng trƣởng số lƣợng vi sinh vật tăng cƣờng hoạt động enzym ADNse Suy thoái ADN kết hợp yếu tố môi trƣờng tác động đơn lẻ yếu tố [24] Cơ chế biến đ i cấu trúc t n thƣơng phân tử ADN chế nội sinh tế bào yếu tố ngoại cảnh tác động [25] Nhƣng dù chế nào, phá hủy cấu trúc ADN ảnh hƣởng lớn đến trình nhân bội 64 3.3.3 Thơng qua hệ thống S5 phát trình tự bị phân hủy Đối với mẫu thân nhân mẫu lab member hệ thống S5 thu đƣợc tín hiệu tốt Đáng ngạc nhiên tƣợng mẫu phân hủy đƣợc quan sát thấy rõ mẫu hài cốt lâu năm nhờ viêc đọc tín hiệu tần suất gọi nu Điều thể rõ Hình 3.11 Hình 3.12 Với đoạn ADN bị phân hủy mạnh, tần suất để xác định đƣợc nu mức độ thấp (frequency 10-20% có màu đỏ, hệ thống phân tích báo tình trạng xác định nu mức “Likely” “fail” “unclear)) nu bình thƣờng cho tín hiệu tốt đạbị phân hủy mạnh, tần suất để 7) Ngoài ra, hệ thống phần mềm đồng thời so sánh với database khác EMPOP nhằm đƣa độ xác cao Điều hạn chế lớn giải trình tự Sanger Đối với mẫu hài cốt lâu năm, trình khử amin dƣờng nhƣ diễn bên ADN Quá trình chuyển đ i adenine (A) thành hypoxanthine, sau liên kết với cytosine (C) thay liên kết với thymine (T); guanine (G) đƣợc chuyển thành xanthine, tiếp tục bắt cặp với C, dẫn đến bắt cặp sai vị trí phân hủy Hoặc ảnh hƣởng điều kiện vật lý, hóa sinh làm phân liên kết sinh học chuỗi ADN Những biến thể đƣợc phần mềm Converge xác định dạng thối biến (ví dụ nhƣ Y =C/T hay R = G/A) Thơng qua giải trình tự S5, ngƣời thực biết đƣợc mức độ phân hủy mẫu, hiểu đƣợc lý trình amplified giải trình tự Sanger dù thực nhiều lần nhƣng khó thành cơng 65 Hình 3.11 Phần mềm Converge phát vùng/điểm bị phân hủy chất lượng mẫu hài cốt B11-H10-02 66 Hình 3.12 Ví dụ vị trí phát vùng/điểm bị phân hủy chất lượng thông qua phần mềm phân tích Converge mẫu hài cốt B11-H10-02 Bảng 3.9: Bảng t ng hợp mẫu phát có vùng bị phân hủy thơng qua phương pháp đọc trình tự Ion Torrent S5 Chip Mẫu Vùng phân tích thành cơng (Sanger) 27 40 15 33 Kết Sanger Ion Torrent S5 16024-16365 Tốt HV1, HV3 degraded 16024-16365 Tốt HV2, HV3 degraded Tốt HV2, HV2 degraded 16024-16365; 73340 16047-16193; 16210-16365 16038-16193; 16210-16365 Tốt Tốt HV1/ around C tract degraded HV1/ around C tract degraded 67 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Ứng dụng đƣợc phƣơng pháp giải trình tự hệ hệ thống Ion torrent S5 Ion Chef việc giải trình tự vùng D-loop hệ gen Ty thể Chúng tơi thực giải trình tự với mẫu than nhân, mẫu lab member 83 mẫu hài cốt Bƣớc đầu phân tích đƣợc kết giải trình tự thông qua phần mềm Converge: 34 mẫu cho kết tốt, 27 mẫu trung bình 35 mẫu cho kết xấu trùng khớp với chất lƣợng ADN đầu vào Cho thấy đƣợc ƣu điểm vƣợt trội so với hệ thống giải trình tự cũ Sanger: thu đƣợc tồn tín hiệu (tốt, xấu) với thơng số xác (tần xuất) độ tin cậy cao (có so sánh qua EMPOP) thể rõ vùng có bị phân hủy, vị trí bị phân hủy 4.2 KIẾN NGHỊ Với kết thu đƣợc sau tối ƣu phƣơng pháp giải trình tự NGS để phân tích mẫu hài cốt lâu năm áp dụng thành công 83 mẫu hài cốt, đề xuất số điểm nhƣ sau: 1.Tiến hành nghiên cứu phân tích sâu, tận dụng liệu có sẵn mà phần mềm Converge cung cấp Xây dựng lại tiêu chí đánh giá, đặt lại thƣớc đo cho xác định chất lƣợng mẫu trình chạy giải trình tự Mở rộng số lƣợng mẫu số lần lặp lại thí nghiệm Tiếp tục tối ƣu quy trình để tạo thƣ viện có số lƣợng mẫu lớn, đáp ứng cho việc tạo liệu ngƣời Việt phục vụ cho nghiên cứu giám định tƣơng lai 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Vietnam Ministry of Labour, War Invalids and Social Affairs, “Database of Fallen Soldier‟s Graves.” http://www.molisa.gov.vn/Pages/tintuc/chitiet.aspx?tintucID=28329 [2] Z Obermeyer, C J L Murray, Adn E Gakidou, “Fifty years of violent war deaths from Vietnam to Bosnia: Analysis of data from world health survey programme,” Bmj, vol 336, no 7659, pp 1482–1486, 2008, doi: 10.1136/bmj.a137 [3] C M Parsons TJ, “Increasing the forensic discrimination of mitochondrial DNA testing through analysis of the entire mitochondrial DNA genome.,” p 2001 Jun [4] A Alonso et al., “Specific quantification of human genomes from low copy number DNA samples in forensic Adn ancient DNA studies,” Croat Med J., vol 44, no 3, pp 273–280, 2003 [5] C Børsting, S L Fordyce, J Olofsson, H S Mogensen, adn N Morling, “Evaluation of the Ion TorrentTM HID SNP 169-plex: A SNP typing assay developed for human identification by second generation sequencing,” Forensic Sci Int Genet., vol 12, pp 144–154, 2014, doi: 10.1016/j.fsigen.2014.06.004 [6] GS Đỗ Xuân Hợp, Giải phẫu đại cương đầu mặt c 1971 [7] I Professor of Anatomy, Indiana University, Human skeleton [8] C Practice, “Skeletal system 1: the anatomy ADN physiology of bones,” vol 116(2), no 2, pp 38–42, 2020 [9] R Bartl, C Bartl, R Bartl, adn C Bartl, “Structure adn Architecture of Bone,” Bone Disord., pp 11–20, 2017, doi: 10.1007/978-3319-29182-6_2 [10] G Tortora ADN B Derrickson, “The skeletal system: Bone tissue,” Princ Anat Physiol., pp 171–193, 2014 [11] J W AGNA, H C KNOWLES, ADN G ALVERSON, “The 69 mineral content of normal human bone.,” J Clin Invest., vol 37, no 10, pp 1357–1361, 1958, doi: 10.1172/JCI103725 [12] W D Armstrong ADN L Singer, “Composition ADN constitution of the mineral phase of bone.,” Clin Orthop Relat Res., vol 38, pp 179– 190, 1965, doi: 10.1097/00003086-196500380-00025 [13] N Lynnerup ADN C Villa, “Age estimation of skeletal remains: principal methods,” Res Reports Forensic Med Sci., p 3, 2014, doi: 10.2147/rrfms.s35660 [14] L C Palmer, C J Newcomb, S R Kaltz, E D Spoerke, adn S I Stupp, “Biomimetic systems for hydroxyapatite mineralization inspired by bone ADN enamel,” Chem Rev., vol 108, no 11, pp 4754–4783, 2008, doi: 10.1021/cr8004422 [15] E S M Iwamura, J A Soares-Vieira, and D R Muñoz, “Human identification ADN analysis of DNA in bones.,” Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo., vol 59, no 6, pp 383–388, 2004, doi: 10.1590/S004187812004000600012 [16] D Corach et al., “Additional approaches to DNA typing of skeletal remains: The search for „missing‟ persons killed during the last dictatorship in Argentina,” Electrophoresis, vol 18, no 9, pp 1608–1612, 1997, doi: 10.1002/elps.1150180921 [17] SHIGEYUKI KITAMURA KAZUMI SUGIHARA MIE KUWASAKO KIYOSHI TATSUMI, “The Role of Mammalian Intestinal Bacteria in the Reductive Metabolism of Zonisamide,” 2011 [18] E Cunha et al., “The problem of aging human remains ADN living individuals: A review,” Forensic Sci Int., vol 193, no 1–3, pp 1–13, 2009, doi: 10.1016/j.forsciint.2009.09.008 [19] P F Campos, O E Craig, G Turner-Walker, E Peacock, E Willerslev, adn M T P Gilbert, “DNA in ancient bone - Where is it located ADN how should we extract it?,” Ann Anat., vol 194, no 1, pp 7–16, 2012, doi: 10.1016/j.aanat.2011.07.003 70 [20]R D G Alex H Taylor, Rachael Miller, “New Caledonian crows reason about hidden causal agents,” 2012 [21]N Nissanka ADN C T Moraes, “Mitochondrial DNA damage ADN reactive oxygen species in neurodegenerative disease,” FEBS Lett., vol 592, no 5, pp 728–742, 2018, doi: 10.1002/1873-3468.12956 [22]L M Fondevila M, Phillips C, Naverán N, Cerezo M, Rodríguez A, Calvo R, Fernández LM, Carracedo Á, “Challenging DNA: Assessment of a range of genotyping approaches for highly degraded forensic samples,” pp 26–28, 2008 [23]G P Thomas M, “Postmortem Damage of Mitochondrial DNANo Title,” Forensic Sci Int Genet, pp 257–264, 2018 [24]R S Meindl and C O Lovejoy, “Ectocranial suture closure: A revised method for the determination of skeletal age at death based on the lateral‐anterior sutures,” Am J Phys Anthropol., vol 68, no 1, pp 57–66, 1985, doi: 10.1002/ajpa.1330680106 [25]S Sudhir Ambekar, “DNA: Damage ADN Repair Mechanisms in Humans,” Glob J Pharm Pharm Sci., vol 3, no 3, 2017, doi: 10.19080/gjpps.2017.03.555613 [26]D Franklin, “Forensic age estimation in human skeletal remains: Current concepts ADN future directions,” Leg Med., vol 12, no 1, pp 1–7, 2010, doi: 10.1016/j.legalmed.2009.09.001 [27]A C Drohat adn A Maiti, “Mechanisms for enzymatic cleavage of the N-glycosidic bond in DNA,” Org Biomol Chem., vol 12, no 42, pp 8367–8378, 2014, doi: 10.1039/c4ob01063a [28]S R Tridico, S Koch, A Michaud, G Thomson, K Paul Kirkbride, ADN M Bunce, “Interpreting biological degradative processes acting on mammalian hair in the living ADN the dead: Which ones are taphonomic?,” Proc R Soc B Biol Sci., vol 281, no 1796, 2014, doi: 10.1098/rspb.2014.1755 71 [29] A W Briggs et al., “Targeted retrieval ADN analysis of five neADNertal mtDNA genomes,” Science (80- )., vol 325, no 5938, pp 318– 321, 2009, doi: 10.1126/science.1174462 [30] Nông Văn Hải, Một số kết nghiên cứu gen hệ gen người Việt Nam 2019 [31]E Murphy, “Forensic DNA Typing,” Annu Rev Criminol., 2017 [32]C Ginther et al., “Genetic variation among the Mapuche Indians from the Patagonian region of Argentina: mitochondrial DNA sequence variation ADN allele frequencies of several nuclear genes.,” EXS, vol 67, pp 211–219, 1993, doi: 10.1007/978-3-0348-8583-6_17 [33]M Eduardoff, C Xavier, C Strobl, A Casas-Vargas, ADN W Parson, “Optimized mtDNA control region primer extension capture analysis for forensically relevant samples ADN highly compromised mtDNA of different age ADN origin,” Genes (Basel)., vol 8, no 10, 2017, doi: 10.3390/genes8100237 [34]T D Cottrell DA, “Mitochondria ADN ageing,” Curr Opin Clin Nutr Metab Care, pp 473–478, 2000 [35]K Sekiguchi et al., “Mitochondrial DNA population data of HV1 ADN HV2 sequences from Japanese individuals,” Leg Med., vol 10, no 5, pp 284–286, 2008, doi: 10.1016/j.legalmed.2008.02.002 [36]W Thompson, S Ford, T Doom, M Raymer, ADN D E Krane, “Evaluating forensic DNA evidence: Essential elements of a competent defense review,” The Champion, vol XXVII, no 2, pp 16–25, 2003, [Online] Available: http://www.nacdl.org/public.nsf/698c98dd101a846085256eb400500c01/c1d6 3d2bd1a582cf85256e540074c146?OpenDocument%7B&%7DHighlight=0,ra ymer [37]M VADNewoestyne ADN D Deforce, “Laser capture microdissection in forensic research: A review,” Int J Legal Med., vol 124, no 6, pp 513–521, 2010, doi: 10.1007/s00414-010-0499-4 72 [38]PGS.TS Nguyễn Trọng Toàn, “nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật ADN việc giám định hài cốt liệt sĩ,” 2006 [39]H Minh, “Bàn giao 669 kết giám định ADN liệt sĩ.” https://vnexpress.net/ban-giao-669-ket-qua-giam-dinh-adn-liet-si4136656.html (accessed Oct 22, 2020) [40]F Sanger, S Nicklen, ADN A R Coulson, “DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.,” Proc Natl Acad Sci U S A., vol 74, no 12, pp 5463–5467, 1977, doi: 10.1073/pnas.74.12.5463 [41]B Quintáns, V Álvarez-Iglesias, A Salas, C Phillips, M V Lareu, ADN A Carracedo, “Typing of mitochondrial DNA coding region SNPs of forensic ADN anthropological interest using SNaPshot minisequencing,” Forensic Sci Int., vol 140, no 2–3, pp 251–257, 2004, doi: 10.1016/j.forsciint.2003.12.005 [42]W Parson et al., “Identification of West Eurasian mitochondrial haplogroups by mtDNA SNP screening: Results of the 2006-2007 EDNAP collaborative exercise,” Forensic Sci Int Genet., vol 2, no 1, pp 61–68, 2008, doi: 10.1016/j.fsigen.2007.08.007 [43]H D Lamlertthon W, Hayward MC, “Emerging technologies for improved stratification of cancer patients: a review of opportunities, challenges, ADN tools.,” Cancer, 2011 [44]M Margulies et al., “Genome sequencing in microfabricated highdensity picolitre reactors,” Nature, vol 437, no 7057, pp 376–380, 2005, doi: 10.1038/nature03959 [45]H P J Buermans ADN J T den Dunnen, “Next generation sequencing technology: Advances ADN applications,” Biochim Biophys Acta - Mol Basis Dis., vol 1842, no 10, pp 1932–1941, 2014, doi: 10.1016/j.bbadis.2014.06.015 [46]B Clinton, “President Clinton announces the completion of the first survey of the entire human genome,” 2000 73 [47]NIH, “International Consortium Announces the 1000 Genomes Project,” NIH News Releases, 2008 https://www.nih.gov/news-events/newsreleases/international-consortium-announces-1000-genomes-project [48]“Internation Human Epigenome Consortium (IHEC),” 2010 [49]S Goodwin, J D McPherson, ADN W R McCombie, “Coming of age: Ten years of next-generation sequencing technologies,” Nat Rev Genet., vol 17, no 6, pp 333–351, 2016, doi: 10.1038/nrg.2016.49 [50]D Ballard, J Winkler-Galicki, ADN J Wesoły, “Massive parallel sequencing in forensics: advantages, issues, technicalities, ADN prospects,” Int J Legal Med., vol 134, no 4, pp 1291–1303, 2020, doi: 10.1007/s00414-020-02294-0 [51]E L Van Dijk, Y Jaszczyszyn, ADN C Thermes, “Library preparation methods for next-generation sequencing: Tone down the bias,” Exp Cell Res., vol 322, no 1, pp 12–20, 2014, doi: 10.1016/j.yexcr.2014.01.008 [52]W Parson et al., “Reprint of: Evaluation of next generation mtGenome sequencing using the Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM),” Forensic Sci Int Genet., vol 7, no 6, pp 632–639, 2013, doi: 10.1016/j.fsigen.2013.09.007 [53]M Yuan et al., “Genome sequence ADN transcriptome analysis of the radioresistant bacterium deinococcus gobiensis: Insights into the extreme environmental adaptations,” PLoS One, vol 7, no 3, 2012, doi: 10.1371/journal.pone.0034458 [54]A Baez-Ortega et al., “IonGAP: Integrative bacterial genome analysis for Ion Torrent sequence data,” Bioinformatics, vol 31, no 17, pp 2870–2873, 2015, doi: 10.1093/bioinformatics/btv283 [55]Z Xue, M E Kable, ADN M L Marco, “Impact of DNA Sequencing ADN Analysis Methods on 16S rRNA Gene Bacterial Community Analysis of Dairy Products,” mSphere, vol 3, no 5, 2018, doi: 10.1128/msphere.00410-18 74 [56]M Fujimoto et al., “Application of ion torrent sequencing to the assessment of the effect of alkali ballast water treatment on microbial community diversity,” PLoS One, vol 9, no 9, 2014, doi: 10.1371/journal.pone.0107534 [57]M Chen et al., “Loss-of-function variants in FSIP1 identified by targeted sequencing are associated with one particular subtype of mucosal melanoma,” Gene, vol 759, 2020, doi: 10.1016/j.gene.2020.144964 [58]Y P Hsiao, C Te Lu, J Chang-Chien, W R Chao, ADN J J Yang, “Advances ADN applications of Ion torrent personal Genome Machine in cutaneous squamous cell carcinoma reveal novel gene mutations,” Materials (Basel)., vol 9, no 6, 2016, doi: 10.3390/ma9060464 [59]L Liu et al., “Comparison of next-generation sequencing systems,” J Biomed Biotechnol., vol 2012, 2012, doi: 10.1155/2012/251364 [60]I C Kit, I C Kit, ADN I C Kit, “Precision ID mtDNA Panels with the HID Ion for use with : Precision ID mtDNA Whole Genome Panel Precision ID mtDNA Control Region Panel for use with :” [61]“https://www.mitomap.org/MITOMAP.” 75 PHỤ LỤC Danh sách mẫu đọc trình tự chip 76 77 Danh sách mẫu đọc trình tự chip 78 ... ? ?Ứng dụng cơng nghệ giải trình tự Ion Torrent S5XLTM việc giám định hài cốt lâu năm” Nghiên cứu sử dụng kit Precision ID mtADN Control Region Panel (Thermofisher) dựa hệ thống giải trình tự hệ. .. ứng dụng công nghệ ADN việc x? ?c định hài cốt liệt sĩ" có mã số KC.04.23 [38] Hiện nay, công nghệ giám định gen ADN ti thể đƣợc ứng dụng thực tiễn Việt Nam, với hàng trăm trƣờng hợp đƣợc x? ?c định. .. trình tự genome vi khuẩn virus; đọc trình tự mẫu metagenomic; đọc trình tự RNA ngắn; Giá trị số liệu trình tự thu máy khác Nguyên lý công nghệ: Khác với cơng nghệ đọc trình tự khác, 26 cơng nghệ