Nguyễn Như Hoa tgk Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ PHÂN LẬP, NHẬN DIỆN TRÌNH TỰ GEN MADS – BOX TẠO HOA Ở HOA THUỐC LÁ IN VITRO VÀ EX VITRO (NICOTIANA TABACUM L.CV SAMSUN) NGUYỄN NHƯ HOA*, BÙI VĂN LỆ** TÓM TẮT Nghiên cứu nhằm phân lập, giải trình tự đoạn gen MADS – box tạo hoa thuốc Nicotiana tabacum L.cv Samsun in vitro ex vitro, tạo sở để tìm hiểu vai trị gen đến q trình cảm ứng hoa invitro Trình tự phân lập thí nghiệm thuộc họ gen MADS – box loại II, dài 367bp, không chứa vùng MADS – box, từ bp – 87 thuộc vùng I, từ 88 – 297 thuộc K – box 298 – 367 thuộc vùng C Thí nghiệm ban đầu cho thấy giống mặt di truyền hoa in vitro ex vitro Từ khóa: Nicotiana tabacum L.cv Samsun, gen MADS – box, hoa invitro, hoa ex vitro ABSTRACT Isolating and identifying MADS – box gen of invitro and exvitro tobacco flower (Nicotiana tabacum L.cv Samsun) The purpose of this study was to isolate, sequenced a fragment of MADS - box gen in Nicotiana tabacum L.cv Samsun, to understand the role of this gen in in vitro flowering process The sequence of experiments involves MADS- box type II, 367bp long does not contain the MADS- box, from 1-87 bp in I region, 88-297 in K- box and 298-367 in C region This experiment initially showed genetic similarity between the in-vitro and ex- vitro flowering Keywords: Nicotiana tabacum L.cv Samsun, MADS - box gen, in vitro flowering, ex vitro flowering Mở đầu Sự hoa bước chuyển quan trọng đời sống thực vật, kiểm soát nhiều yếu tố nội sinh ngoại sinh Hiện nay, cảm ứng hoa điều kiện in vitro hướng nghiên cứu thú vị, thu hút ý nhiều nhà khoa học nước Trên giới, nhà khoa học nghiên cứu hoa in vitro Murraya paniculata (L.), Anethum graveolens, Pharbitis nil, Dendrocalamus hamiltonii, Dendrobium Madame Thong-In, Dendrobium Sonia 17… Việt Nam có nhiều nghiên cứu lãnh vực Chrysanthemum sp., Dendrobium Sonia, Coleogyne sp., Arabidopsis thaliana, Dianthus caryophyllus L… * ** ThS, Trường Đại học Sư phạm TPHCM PGS TS, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TPHCM Tuy nhiên, hoa in vitro thường khơng hồn tồn giống hoa điều kiện tự nhiên hình dạng, màu sắc, kích thước, khả thụ phấn… Có giả thuyết cho có diện hợp chất cản trở phát triển bình thường mơ phân sinh hoa mơi trường ni cấy Ngồi ra, mặt di truyền, thực vật bậc cao, phát triển hoa trải qua loạt giai đoạn chịu tác động nhiều gen điều hòa Phần lớn gen thuộc liên họ MADS-box MADS kết hợp chữ đầu tên bốn gen (MCM1 nấm men, AGAMOUS Arabidopsis, DEFICIENS Snapdragon, SRF người) có độ tương đồng trình tự cao Họ gen MADS – box xác định hộp MADS trình tự DNA bảo tồn cao, dài 180 bp; K-box domain bảo tồn, có vai trò tương tác protein-protein; vùng I nằm domain MADS domain K, đa dạng, với chiều dài khác nhau; vùng C bảo tồn [1] MADS-box gen cô lập mô tả đặc điểm nhiều loài Antirrhinum majus, Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum var Xanthi, Betula pendula… Vì vậy, bước đầu xác định trình tự gen MADS – box hoa in ex vitro từ tìm vai trị gen bất thường hình dạng, cấu tạo hoa in vitro cấp thiết có ý nghĩa Vật liệu, phương pháp 2.1 Đối tượng, vật liệu 2.1.1 Đối tượng Cây thuốc Nicotiana tabacum L.cv Samsun từ Phịng Thí nghiệm Cơng nghệ sinh học thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên 2.1.2 Vật liệu: - Hoa thuốc Nicotiana tabacum L.cv Samsun in vitro ex vitro tạo từ nghiên cứu Phịng Thí nghiệm Cơng nghệ sinh học thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Hóa chất tách chiết RNA tổng số, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) tạo cDNA, primer 2.2 Phương pháp nghiên cứu Thiết kế primer phần mềm AlleleID 7.0 dựa trình tự NAP1-1(cDNA gen MADS-box Nicotianatabacum var xanthi) tải từ ngân hàng gen NCBI - Tìm trình tự biết vị trí exon, tương đồng cao với NAP1-1 cách blast trình tự với thư viện genomic DNA - Sau tìm trình tự mong muốn với vị trí exon, tiến hành gióng cột so sánh trình tự với NAP1-1 để suy vị trí exon NAP1-1 - Đưa trình tự chọn vị trí exon vào phần mềm AlleleID 7.0, sử dụng tham số thiết kế mặc định phần mềm Kiểm tra, so sánh lại thông số primer như: Tm, chiều dài, cấu trúc kẹp tóc, khả hình thành dạng dimer… để chọn cặp primer cho thí nghiệm Primer tổng hợp IDT nồng độ 25µM Hoa thuốc in vitro ex vitro tách RNA tổng số phương pháp Trizol Sau đó, xử lí RNA tổng số Turbo DNA – freeTM, tổng hợp cDNA, thiết lập phản ứng PCR Giải trình tự mạch MACRO GEN Xử lí kết sau giải trình tự phần mềm ChromasPro công cụ BLAST (NCBI) Kết quả, thảo luận 3.1 Thiết kế primer Trình tự chọn để thiết kế primer NAP1-1 (dài 1143 bp, AF009126) Nicotiana tabacum var xanthi Sau tìm vị trí exon, xử lí phần mềm AlleleID 7.0 nhận cặp primer tương ứng Bảng Thông số thiết kế cặp primer Trình tự Vị trí Sense TATTCCACTGATT CTTCCATGG 366 Anti-sense CTGAGTCTGCTGA GCTAGC 749 mRNA NAP1-1 Chiều dài bp Tm GC % 22 54,8 40,9 19 55,1 57,9 C Sản phẩm bp 384 Các thông số cặp primer thể bảng cho thấy khơng có diện cấu trúc kẹp tóc hay cấu trúc hình thành bắt cặp mồi xuôi mồi ngược (Cross – dimer), tự bắt cặp mồi (Self – dimer) Kết primer :H1: Sense: 5’-TATTCCACTGATTCTTGCATGG-3’ H2: Anti-sense: 5’-CTGAGTCTGCTGAGCTAGC-3’ Sản phẩm PCR khoảng 384 bp 3.2 Tách chiết RNA tổng số RNA tổng số sau tách chiết định lượng kiểm tra độ tinh máy Nano Drop (bảng 2) Tỉ lệ OD260/OD280 hai mẫu nằm khoảng 1,8 – 2,0, RNA tổng số thu tinh Nồng độ RNA tổng số mẫu không cao, nhiên nồng độ cho phép sử dụng cho thí nghiệm M I E Hình Kết điện di RNA tổng số từ mẫu in vitro exvitro gel 2% agarose M: thang chuẩn (100bp plus blue DNA ladder/GeneON) Bảng Kết định lượng RNA tổng số Nano Drop Mẫu OD260/OD280 Nồng độ ng/µl I (in vitro) 1,88 326,9 E (ex vitro) 1,88 347,3 3.3 RT-PCR tạo cDNA, PCR đoạn gen mục tiêu Sau tạo cDNA, đoạn gen MADS – box tạo hoa thuốc thu nhận phản ứng PCR với cặp primer đặc hiệu H1, H2 Sản phẩm kiểm tra điện di gel agarose 2% , băng đặc hiệu, có độ dài khoảng 300 – 400 bp dự tính M I E Hình Kết điện di cDNA gel 2% agarose M: thang chuẩn (100bp plus blue DNA ladder/GeneON) Nguyễn Như Hoa tgk Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 3.4 Giải trình tự Kết giải trình tự sau xử lí phần mềm ChromasPro: Trình tự mẫu I có độ dài 322 bp CATATGCTGAGAGGCAGCTTACTGCTACTGATCATGAAACCCCGGGG AGCTGGACTTTGGAACATGCTAAGCTTAAGGCCAGACTTGAGGTTTTGCAA AGAAACCAAAGGCATTATGCAGGAGAAGATTTGGACTCATTAAGTATGAA AGAGCTTCAGAATCTTGAGCACCAGCTCGATTCTGCTCTTAAGCACATTCG ATCAAGAAAGAATCAATTGATGCATGAATCCATTTCTGAGCTGCAAAAGAA GGACAAGGCATTGCAAGAGCAAAACAACAATCTCTCAAAGCAGGTGAAAG AAAGGGAGAAAGAGCTAGCTCA Trình tự mẫu E có độ dài 367 bp TGATTCTTGCATGGAAAGGATTCTTGAAAGGTATGAAAGGTACTCATA TGCTGAGAGGCAGCTTACTGCTACTGATCATGAAACCCCGGGGAGCTGGAC TTTGGAACATGCTAAGCTTAAGGCCAGACTTGAGGTTTTGCAAAGAAACCA AAGGCATTATGCAGGAGAAGATTTGGACTCATTAAGTATGAAAGAGCTTCA GAATCTTGAGCACCAGCTCGATTCTGCTCTTAAGCACATTCGATCAAGAAA GAATCAATTGATGCATGAATCCATTTCTGAGCTGCAAAAGAAGGACAAGGC ATTGCAAGAGCAAAACAACAATCTCTCAAAGCAGGTGAAAGAAAGGGAGA AAGAGCTAGCTCAG Sau dùng công cụ blast NCBI so sánh trình tự, ta kết luận trình tự hồn tồn khơng khác biệt (trình tự mẫu I phần trình tự mẫu E) trình tự cần phân lập Hình Kết blast trình tự mẫu I trình tự mẫu E Khi tiến hành blast trình tự mẫu E với vùng MADS – box K – box NAP11 nhận thấy trình tự khơng chứa vùng MADS – box, trình tự từ bp – 87 thuộc vùng I, từ 88 – 297 thuộc K – box 298 – 367 thuộc vùng C Hình Kết blast trình tự mẫu E với vùng MADS – box gen NAP1-1 Hình Kết blast trình tự mẫu E với vùng K – box gen NAP1-1 Từ phân tích ta thấy đoạn gen MADS – box hoa in vitro ex vitro thí nghiệm giống Các gen MADS – box chứng minh đóng vai trị quan trọng q trình phát triển hoa, bao gồm việc xác định vị trí mô phân sinh hoa quan hoa (Ma 1994; Weigel Meyerowitz 1994) [1] Ngoài ra, kết blast trình tự mẫu E với ngân hàng gen cho thấy trình tự giống cDNA Ntsqua12 99%, cDNA NAP1-1 98% cDNA NAP1-1 NAP1-2 giải trình tự Nicotiana tabacum var xanthi thuộc họ gen MADS – box, giống với cDNA SQUA Snapdragon, cDNA PFG dã yên thảo (Petunia), cDNA AP1 Arabidopsis [2] Như vậy, kết luận trình tự phân lập thí nghiệm thuộc họ gen MADS – box loại II, dài 367bp, không chứa vùng MADS – box, từ bp – 87 thuộc vùng I, từ 88 – 297 thuộc K – box 298 – 367 thuộc vùng C Kết luận, kiến nghị Như vậy, nghiên cứu giải trình tự đoạn gen thuộc họ gen MADS – box loại II, dài 367bp, không chứa vùng MADS – box, từ bp – 87 thuộc vùng I, từ 88 – 297 thuộc K – box 298 – 367 thuộc vùng C Thí nghiệm ban đầu cho thấy giống mặt di truyền hoa in vitro ex vitro Từ đó, thấy triển vọng tạo hoa in vitro đại trà, ứng dụng việc kiểm soát hoa điều kiện ex vitro, cải tiến lai tạo giống điều kiện in vitro, nghiên cứu hoa in vitro sinh lí, sinh hóa thay ex vitro… Cần tiếp tục nghiên cứu biểu gen MADS-box tạo hoa mức độ khác để xác định cụ thể vai trò gen bất thường hoa in vitro TÀI LIỆU THAM KHẢO Beverley, J.G (2007), Understanding of flowers and flowering, Oxford University Press Inc., New York, The United States of America Seonghoe Jang (2002), Characterization of tobacco MADS-box genes involved in floral initiation, Plant cell physiol 43(1): 230-238 (Ngày Tòa soạn nhận bài: 25-6-2013; ngày phản biện đánh giá: 31-7-2013; ngày chấp nhận đăng: 16-5-2014) ... vùng MADS – box gen NAP1-1 Hình Kết blast trình tự mẫu E với vùng K – box gen NAP1-1 Từ phân tích ta thấy đoạn gen MADS – box hoa in vitro ex vitro thí nghiệm giống Các gen MADS – box chứng minh... với vùng MADS – box K – box NAP11 nhận thấy trình tự khơng chứa vùng MADS – box, trình tự từ bp – 87 thuộc vùng I, từ 88 – 297 thuộc K – box 298 – 367 thuộc vùng C Hình Kết blast trình tự mẫu E... truyền hoa in vitro ex vitro Từ đó, thấy triển vọng tạo hoa in vitro đại trà, ứng dụng việc kiểm soát hoa điều kiện ex vitro, cải tiến lai tạo giống điều kiện in vitro, nghiên cứu hoa in vitro sinh