ĐẠI HỌCHỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH TẠPTRƯỜNG CHÍ KHOA ISSN: 1859-3100 HO CHI MINH JOURNAL CITY UNIVERSITY EDUCATION OFOFSCIENCE KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ Tập NATURAL SCIENCES AND TECHNOLOGY 15, Số (2018): 139-148 Vol 15, No (2018): 139-148 Email: tapchikhoahoc@hcmue.edu.vn; Website: http://tckh.hcmue.edu.vn PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI NẤM CÓ KHẢ NĂNG KÍ SINH TIÊU DIỆT ẤU TRÙNG VE SẦU GÂY HẠI CÀ PHÊ Đỗ Thị Thanh Dung*, Lê Thanh Bình, Đỗ Thị Hồng Thịnh, Võ Đình Quang Chi nhánh Viện Ứng dụng Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh Ngày nhận bài: 18-01-2018; ngày nhận sửa: 17-3-2018; ngày duyệt đăng: 19-6-2018 TÓM TẮT Nghiên cứu nhằm tuyển chọn số chủng vi nấm có khả kí sinh tiêu diệt ấu trùng ve sầu gây hại cà phê Kết phân lập làm 26 chủng vi nấm Qua sàng lọc chọn chủng TN7N3, CF8N3, TN7N1 thuộc dịng Paecylomyces sp có khả kí sinh ức chế ấu trùng ve sầu gây hại có tiềm ứng dụng làm chế phẩm vi sinh giúp phòng trị bệnh ấu trùng ve sầu gây hại cà phê Từ khóa: ấu trùng Ve sầu, bệnh cà phê, Paecylomyces sp ABSTRACT Isolating and selecting some strains of the fungus capable of parasiting and killing cicada larvae on the coffee tree The aim of this study is to select some strains of the fungus that have the ability to parasitic and kill cicada larvae on the coffee tree As result, a total of 26 strains of fungus were isolated From these, three strains of TN7N3, CF8N3 and TN7N1 belonging to Paecylomyces sp were selected due to their high ability to parasitic, kill cicada larvae and with the potential to produce organic products in order to prevent and treat pathogenic caused by cicada larvae on the coffee tree Keywords: Cicada larvae, Disease of coffee trees, Paecylomyces sp Mở đầu Cà phê loại cơng nghiệp có giá trị kinh tế cao, cho sản phẩm xuất lớn Việt Nam sau lúa gạo [1] Cây cà phê thực làm thay đổi đời sống nhiều vùng dân cư, góp phần xóa bỏ tập quán du canh du cư đồng bào dân tộc Trồng cà phê góp phần phủ xanh đồi trọc, cải tạo mơi sinh, chống lũ lụt đặc biệt xói mòn Hiện nay, dịch ve sầu đe dọa sinh hoạt sản xuất nông nghiệp nhiều vùng nước tiếng kêu gây ồn tác động đến thần kinh, giảm suất lao động quan trọng ve sầu hút nhựa làm chết trồng, tàn phá mùa màng Tình hình gây hại ve sầu cà phê có chiều hướng gia tăng sau năm * Email: dothithanhdung1990@gmail.com TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM Tập 15, Số (2018): 139148 Tại Việt Nam thời điểm này, kết nghiên cứu ve sầu đề cập đến, số nghiên cứu có đề cập đến sử dụng thuốc hóa học để diệt ấu trùng ve sầu nhiên hiệu không cao [2] Giải pháp dùng thuốc hóa học diệt ve sầu tốn khả thi ấu trùng ve sầu nằm sâu đất ve sầu trưởng thành có khả bay, phát tán rộng kể khu dân cư Sử dụng thuốc hóa học khơng gây tác hại xấu đến chất lượng nơng sản, thiên địch có ích, mơi trường mà gây tác hại trực tiếp lên sức khoẻ người Vì vậy, tìm chế phẩm sinh học diệt ve sầu mà không làm ảnh hưởng đến sức khỏe người, không gây ảnh hưởng đến khả phát triển cây, không làm ảnh hưởng đến vi sinh vật đối kháng côn trùng có ích, khơng gây nhiễm mơi trường… coi biện pháp chiến lược mà nhiều nhà khoa học quan tâm hướng đến để phòng trừ dịch bệnh cho trồng Cũng nhiều loại côn trùng khác, ve sầu môi trường dinh dưỡng tốt cho số vi sinh Một số dòng vi sinh tiềm nghiên cứu đối tượng côn trùng khác Metarhizium[3],[4],[5], Paecilomyces [6],[7], Beauveri [8],[5]… Các vi sinh có khả phát triển mạnh hồn tồn có khả cơng ức chế trùng, ve sầu gây hại Do đó, phân lập, chọn lọc chủng vi sinh phát triển mạnh kí sinh trùng, ve sầu hồn tồn sử dụng để diệt ve sầu Mặt khác, ve sầu bị nhiễm vi sinh mang tổ (dưới đất) lây nhiễm vi sinh cho khác ấu trùng ve sầu, giúp diệt ve sầu tận gốc Trên tinh thần đó, nghiên cứu tìm số chủng vi sinh có khả tiêu diệt ấu trùng ve sầu để tạo sở cho việc hình thành chế phẩm sinh học an tồn để tiêu diệt ve sầu đường sinh học hướng cần thiết Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu • Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi nấm phân lập từ mẫu trùng, sâu bệnh, ve sầu chết có biểu nấm kí sinh lấy vườn cà phê dịch bệnh ve sầu rừng tự nhiên Đăk Nông Đồng Nai Ấu trùng ve sầu thu thập vườn cà phê tỉnh Đăk Nông Đồng Nai Cây cà phê bị ve sầu gây hại nặng khu vực tỉnh Đăk Nơng Đồng Nai • Mơi trường sử dụng nghiên cứu Môi trường phân lập vi nấm Potato Glucose Agar (PGA): Khoai tây 200g, Glucose 20g, Agar 20g; Nước 1000ml Môi trường thử nghiệm chitinase: NaNO 3,5g; K2HPO4 1,5g; MgSO4.7H2O 0,5g; KCl 0,5g; FeSO4.7H2O 0,01g; Bột chitin 10g; Agar 20g; Nước 1000ml; pH = 6,5 Khử trùng 1atm/30phút TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM Đỗ Thị Thanh Dung tgk 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập vi nấm Cho mẫu ve sầu côn trùng nhiễm nấm thu thập vào 20ml nước cất khử trùng để lắc 30 phút, tốc độ 180 vịng/phút Pha lỗng mẫu nồng độ pha loãng khác nhau: 10-3,10-4, 10-5 Hút 0,5 ml dịch pha loãng ba nồng độ nhỏ lên đĩa Petri chứa môi trường PGA Dùng que gạt trải dịch bề mặt thạch Đặt đĩa thạch tủ 250C, phân lập vi nấm từ khuẩn lạc riêng lẻ đĩa Bảo quản chủng theo phương pháp thạch nghiêng để khảo sát khả kí sinh ức chế ấu trùng ve sầu 2.2.2 Khảo sát khả phân giải chitin chủng vi nấm phân lập Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase, hấp khử trùng 121 0C 30 phút Dùng đĩa petri vơ trùng có kích thước nhau, cho 20ml mơi trường từ ống nghiệm vào đĩa, để nguội, sau 1-2 ngày kiểm tra tạp nhiễm Cấy chấm điểm chủng nấm sợi nghiên cứu vào đĩa, chấm điểm điểm đĩa petri Ủ nhiệt độ phòng (28-30 0C) 2-3 ngày Cho thuốc thử Lugol vào, để phút đo đường kính vịng phân giải thước đo khuẩn lạc Nếu D – d ≥ 25mm: hoạt tính enzyme mạnh D – d ≥ 20mm: hoạt tính enzyme mạnh D – d ≥ 15mm: hoạt tính enzyme trung bình D – d ≤ 10mm: hoạt tính enzyme yếu D: Đường kính vịng thủy phân d: Đường kính khuẩn lạc Từ chọn chủng có hệ enzyme chitinase từ mạnh trở lên để tiếp tục nghiên cứu 2.2.3 Khảo sát khả kí sinh tiêu diệt ấu trùng ve sầu chủng vi nấm phân lập điều kiện phịng thí nghiệm Ấu trùng ve sầu sống cho vào hộp nhựa có mơi trường sống thích hợp Gây nhiễm chủng vi sinh lựa chọn lên ấu trùng ve sầu sống, mật độ 10 6CFU/ml (5ml) Mỗi chủng vi sinh làm thí nghiệm lặp lại lần Thí nghiệm đối chứng xử lí nước cất vơ trùng khơng tiến hành lây nhiễm vi sinh lên ấu trùng ve sầu Đếm số ve sầu chết bắt đầu bị kí sinh sau 3, 6, ngày sau lây nhiễm Tỉ lệ % ấu trùng ve sầu chết bị kí sinh tính theo cơng thức: Tỉ lệ % ấu trùng ve sầu chết bị kí sinh chết = B/A*100 đó: A: số ấu trùng ve sầu sống trước xử lí; B: số ấu trùng ve sầu chết bắt đầu bị kí sinh sau xử lí 2.2.4 Khảo sát khả kí sinh tiêu diệt ấu trùng ve sầu chủng vi nấm lựa chọn tự nhiên Thí nghiệm thực vào đầu mùa mưa Đánh giá hiệu lực của chủng vi sinh lựa chọn ngồi đồng ruộng với diện tích thử nghiệm nhỏ (3 cây/1 chủng vi nấm), tưới khoảng 50 lít nước, tưới vào gốc (sử dụng bình tưới có vịi hoa sen) với mật độ trung bình chủng vi sinh 10 CFU/1ml, bố trí thí nghiệm theo thể thức hồn tồn ngẫu nhiên, với lần nhắc theo nghiệm thức khác Thu thập ấu TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM Tập 15, Số (2018): 139148 trùng ve sầu sau 30 ngày tiến hành thí nghiệm nghiệm thức Với gốc cà phê đào sâu 30 cm điểm khác nhau, diện tích điểm khoảng 30x30cm Hiệu kí sinh tiêu diệt ấu trùng ve sầu tính theo cơng thức: Hiệu kí sinh tiêu diệt ấu trùng ve sầu = B/A*100 A: Tổng số ấu trùng ve sầu thu sau xử lí; B: số ấu trùng ve sầu chết bị vi nấm kí sinh sau xử lí 2.2.5 Định danh xác định đặc tính sinh học chủng có khả kí sinh tiêu diệt ấu trùng ve sầu chủng vi nấm lựa chọn Dựa vào khóa phân loại đến lớp theo Robert A Samson (1984) để định danh chủng vi nấm 2.2.6 Phương pháp xử lí số liệu Dùng phần mềm excel để xử lí số liệu Các số liệu ghi nhận xử lí thống kê phương pháp One_Way ANOVA phần mền Statistical Program Scientific System (SPSS) phiên 19 Kết thảo luận 3.1 Phân lập chủng vi nấm Từ 20 mẫu côn trùng, sâu bệnh, ve sầu chết có biểu vi nấm kí sinh phân lập 26 chủng vi nấm môi trường PGA Trong 26 chủng vi nấm phân lập có 17/26 chủng vi nấm phân lập từ mẫu lấy vườn cà phê (chiếm tỉ lệ 65,38% ) Có 9/26 chủng phân lập từ mẫu lấy rừng tự nhiên (chiếm tỉ lệ 34,62%) Như vậy, kết cho thấy số lượng chủng vi nấm phân lập từ mẫu đất vườn cà phê lớn nhiều so với số lượng chủng vi nấm phân lập mẫu lấy từ rừng tự nhiên Hình Một số chủng vi nấm phân lập từ mẫu côn trùng, sâu bệnh, ve sầu lấy địa điểm vườn cà phê Đăk Nông Đồng Nai TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM Đỗ Thị Thanh Dung tgk 3.2 Khảo sát khả phân giải chitin chủng vi nấm phân lập Do ve sầu thuộc họ côn trùng với thành phần lớp vỏ ngồi chitin, thí nghiệm xác định khả phân giải chitin chủng vi nấm sở cho việc tuyển chọn chủng thử nghiệm ve sầu Việc khảo sát sơ khả phân giải chitin chủng vi nấm xác định thơng qua đường kính vòng phân giải chitin chủng (Bảng 1) Dựa kết thu nhận thấy đường kính vịng phân giải chitin (D − d 26 chủng vi nấm giao động từ mm 31,67 mm, đường kính ) vịng phân giải (D − d ) lớn chủng TN7N3 (31,6 mm) Lấy đường kính vòng phân giải (D − d chủng vi nấm có đường kính (D − d >= 25 mm làm chủng sinh trưởng ) ) mạnh thu chủng vi nấm TN7N3, CF8N3, TN7N1, TN2N1, CF10N2; đó, có chủng vi nấm phân lập từ mẫu côn trùng lấy rừng tự nhiên (chiếm tỉ lệ 66,67%), chủng vi nấm phân lập từ mẫu côn trùng lấy vườn cà phê (chiếm tỉ lệ 43,33%), thuộc tỉnh Đăk Nông Đồng Nai Các chủng tiếp tục sử dụng để khảo sát khả kí sinh tiêu diệt ấu trùng ve sầu điều kiện phịng thí nghiệm Bảng Đường kính vịng phân giải chitin chủng vi nấm phân lập STT Tên chủng TN7N3 CF8N3 (D − d ) mm TN7N1 31,33 TN2N1 30,67 CF10N2 27,00 CF5N1 18,33 CF4N1 16,33 CF8N4 13,67 CF2N1 12,33 10 CF10N1 12,00 11 TN1N2 10,33 12 CF6N2 9,67 13 CF5N2 9,00 14 TN1N1 8,67 15 CF7N1 8,33 16 CF6N3 7,67 17 CF8N2 5,00 31,67 31,33 TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM Tập 15, Số (2018): 139148 18 TN7N2 4,67 19 CF9N1 3,33 20 CF1N1 0,00 21 22 23 24 25 26 CF2N2 CF6N1 CF8N1 TN3N1 TN6N1 TN8N1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Hình Vịng phân giải chitin số chủng vi sinh phân lập côn trùng 3.3 Khảo sát khả kí sinh tiêu diệt ấu trùng ve sầu chủng vi nấm phân lập điều kiện phòng thí nghiệm Đối với ấu trùng ve sầu tiến hành đánh giá hiệu kí sinh chủng vi nấm điều kiện phịng thí nghiệm thu kết Bảng Kết cho thấy, khả kí sinh ấu trùng ve sầu chủng vi nấm lựa chọn có khác biệt rõ rệt nghiệm thức thời điểm thí nghiệm Tại thời điểm 3, ngày sau phun chủng nấm, tỉ lệ ấu trùng ve sầu chết bị nấm kí sinh dao động từ đến 6,67% chưa có khác biệt tất nghiệm thức Tuy nhiên, đến thời đểm ngày tỉ lệ ấu trùng ve sầu chết bị nấm kí sinh tăng lên rõ rệt tỉ lệ ấu trùng ve sầu chết bị nấm kí sinh dao động từ 0% đến 63,33% có khác biệt mặt thống kê nghiệm thức Nghiệm thức TN7N3, CF8N3 có tỉ lệ ấu trùng ve sầu chết bị nấm kí sinh tương ứng 63,33%, 60% cao khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê so với chủng lại Tại thời điểm ngày sau phun, tỉ lệ ấu trùng ve sầu chết bị nấm kí sinh biến động từ - 100%, hầu hết nghiệm thức thí nghiệm có tỉ lệ ấu trùng ve sầu chết bị nấm kí sinh tăng đều, ngoại trừ nghiệm thức TN2N1 khơng có tượng bị nấm kí sinh thời gian thử nghiệm, nghiệm thức TN7N3, CF8N3 tiếp tục cho hiệu kí sinh tốt đạt 100% khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê so với nghiệm thức lại TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM NT ĐC TN7N3 CF8N3 TN7N1 CF10N2 TN2N1 Đỗ Thị Thanh Dung tgk Bảng Hiệu kí sinh chủng vi nấm lên ấu trùng ve sầu điều kiện phịng thí nghiệm quan sát theo thời gian Tỉ lệ ấu trùng ve sầu chết bị nấm kí sinh (%) Sau ngày Sau ngày Sau ngày 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 100 ± 0,00 d 6,67 ± 3,33 a 63,33 ± 6,67 c 6,67 ± 6,67 a 60,00 ± 5,77 c 100 ± 0,00 d 3,33 ± 3,33 a 36,67 ± 6,67 b 76,67 ± 6,67 c 0,00 ± 0,00 a 23,33 ±3,33 b 46,67 ± 3,33 b 0,00 ± 0,00 a 0,00 ±0,00 a 0,00 ± 0,00 a Hình Ấu trùng Ve sầu trước phun vi nấm Hình Các nghiệm thức ấu trùng ve sầu ngày sau phun vi nấm điều kiện phịng thí nghiệm 3.4 Khảo sát khả kí sinh tiêu diệt ấu trùng ve sầu chủng vi nấm lựa chọn tự nhiên Việc thử nghiệm trực tiếp lên cà phê diện hẹp đồng ruộng nhằm đánh giá tốt khả kí sinh tiêu diệt ấu trùng ve sầu chủng vi nấm phân lập (mật độ trung bình 106CFU/ml dung dịch), cà phê làm thí nghiệm xác định có ấu trùng ve sầu gây hại cách cào lớp mặt hố cà phê Kết thí nghiệm thu Bảng Bảng Hiệu kí sinh tiêu diệt ấu trùng ve sầu của chủng vi nấm đồng ruộng sau 30 ngày thí nghiệm (%) NT NTĐC TN7N3 CF8N3 TN7N1 CF10N2 TN2N1 Hiệu (%) 0,00 ± 0,00 a 71,67 ± 2,96 c 62,92 ± 7,48 bc 55,63 ± 8,01 b 13,52 ± 4,38 a 0,00 ± 0,00 a In đậm thể tỉ lệ ấu trùng ve sầu chết bị nấm kí sinh cao Trong cột, giá trị trung bình có kí tự theo sau khác có khác biệt mặt thống kê (p= 25 mm) sử dụng để nghiên cứu khả tiêu diệt kí sinh ấu trùng ve sầu Từ chủng tuyển chọn chủng TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM Tập 15, Số (2018): 139148 vi nấm TN7N1, CF8N3, TN7N3 có khả tiêu diệt kí sinh ấu trùng ve sầu mạnh thí nghiệm phịng thí nghiệm thí nghiệm ngồi đồng ruộng Đối với thí nghiệm thực phịng thí nghiệm tỉ lệ vi nấm kí sinh ấu trùng ve sầu thời điểm ngày chủng TN7N1, CF8N3, TN7N3 tương ứng 76,67%, 100%, 100% Ở thí nghiệm bổ sung ngồi đồng ruộng cho thấy kết vi nấm kí sinh làm chết ấu trùng ve sầu sau 30 ngày chủng TN7N1, CF8N3, TN7N3 tương ứng với tỉ lệ 55,63%, 62,92%, 71,67% Các chủng xác định Paecilomyces sp Tuyên bố quyền lợi: Các tác giả xác nhận hồn tồn khơng có xung đột quyền lợi TÀI LIỆU THAM KHẢO Đinh Xuân Thức, Bài giảng công nghiệp dài ngày, Trường Đại học Nông lâm Huế, Dự án hợp tác Việt Nam - Hà Lan, 2009 Phạm Thị Vượng; Nguyễn Thị Thủy, “Thành phần ve sầu (Homoptera: Cicadidae) hại cà phê Tây Nguyên số biện pháp phịng trừ,” Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nơng thôn, số 1, tr 22-27, 2010 V Taborsky, Small-scale processing of microbial pestcides, FAO Agric, Service Bull 96, Food and Agriculture Organization of the United Nations Rome, 1992 M Shimazu, “Metarhizium cylindrosporae Chen et Guo (Deutero-mycotina: Hyphomycetes), a causative agent of an epizootic on Graptopsaltria nigrofuscata Motchulski (Homoptera: Cicadidae),” Applied Entomology and Zoology, vol.24, pp 430±434, 1989 Phạm Thị Thùy, “Nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất chế phẩm nấm Beauveria Metarhizium để phòng trừ sâu hại trồng nông, lâm nghiệp Việt Nam,” Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, số 12, tr 18-22, 2009 S Kiewnick, R.A Sikora, Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne incognita by Paecilomyces lilacinus strain 251, University of Bonn, Institute for Plant Diseases, 2006 Yi-qiu CHAI, Yi-wei JIN, Guan-ju CHEN, You-gao LIU, Xiao-la LI, Gen-e WANG (2007) Separation of Insecticidal Ingredient of Paecilomyces cicadae (Miquel) Samson, Agricultural Sciences in China, Volume 6, Issue 11, Pages 1352-1358 Nguyễn Đức Tiến, Trần Văn Tuân, Nguyễn Thùy Châu, “Phân lập tuyển chọn nấm Beauveria bassiiana cho mục đích diệt trùng kho cánh cứng (COLEOPTERA),” Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, số 5, tr 414-415, 2002 10 ... Hiệu kí sinh tiêu diệt ấu trùng ve sầu tính theo cơng thức: Hiệu kí sinh tiêu diệt ấu trùng ve sầu = B/A*100 A: Tổng số ấu trùng ve sầu thu sau xử lí; B: số ấu trùng ve sầu chết bị vi nấm kí sinh. .. ruộng chủng vi nấm có hiệu kí sinh làm chết ấu trùng ve sầu sau 30 ngày phun vi nấm Ở nghiệm thức có khác biệt rõ rệt, bên cạnh chủng nấm khơng có hiệu vi? ??c tiêu diệt ấu trùng ve sầu có chủng có khả. .. sinh phân lập trùng 3.3 Khảo sát khả kí sinh tiêu diệt ấu trùng ve sầu chủng vi nấm phân lập điều kiện phịng thí nghiệm Đối với ấu trùng ve sầu tiến hành đánh giá hiệu kí sinh chủng vi nấm điều