PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN Puecilomtyces Sp CÓ KHẢ NĂNG DIỆT SÂU HẠI CÂY TRÔNG

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG ® KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN Paecilomyces sp CÓ KHẢ NĂNG DIỆT SÂU HẠI CÂY TRỒNG Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Lớp: Khóa: ThS NGUYỄN NHƯ NHỨT NGUYỄN HOÀNG CHINH 08SH1D 2008 – 2013 TP Hồ Chí Minh, năm 2013 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm chấp nhận hình thức xử lý Nhà trường vi phạm Luật sở hữu trí tuệ Quyền tác giả Sinh viên thực Nguyễn Hoàng Chinh LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp này, không ngừng nhận giúp đỡ, lời động viên quan tâm thầy cô, gia đình bạn bè Tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng, Ban chủ nhiệm khoa Khoa học ứng dụng, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập trường Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến thầy ThS Nguyễn Như Nhứt, người tận tâm hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức quý báo tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt đề tài khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến quý Công ty TNHH Gia Tường – chi nhánh tỉnh Bình Dương anh chị nhân viên công ty chị Yến, anh Linh, anh Quí… tạo điều kiện thuận lợi nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận Con xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, người thân gia đình hết lịng quan tâm tạo điều kiện để hoàn thành nhiệm vụ học tập Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến bạn lớp 08SH1D có giúp đỡ chia sẻ suốt thời gian học tập làm khóa luận Sinh viên thực Nguyễn Hồng Chinh i MỤC LỤC Trang Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Danh mục biểu đồ viii CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược Paecilomyces sp 2.1.1 Vị trí phân loại 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Đặc điểm sinh học 10 2.1.3.1 Môi trường sống 10 2.1.3.2 Sự đa dạng nguồn chất 11 2.1.3.3 Ảnh hưởng yếu tố môi trường 11 2.1.4 Sự biến dưỡng 13 2.1.4.1 Sự sản xuất enzyme 13 2.1.4.2 Sự sản xuất kháng sinh chất biến dưỡng thứ cấp 14 2.1.5 Khả kiểm soát sinh học 15 2.1.5.1 Sự ký sinh 15 2.1.5.2 Cơ chế tác động nấm lên côn trùng 18 2.1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả diệt côn trùng 19 2.1.6 Khả tương thích với số thuốc bảo vệ thực vật 23 2.1.7 Khả điều hòa tăng trưởng thực vật 23 2.1.8 Mối nguy hiểm triệu chứng 24 ii 2.1.9 Ứng dụng Paecilomyces 26 2.1.9.1 Sản xuất enzyme 26 2.1.9.2 Sản xuất chất màu, kháng sinh hợp chất thứ cấp 26 2.1.9.3 Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật 29 2.1.9.4 Xử lý môi trường 30 2.2 Tình hình dịch hại Việt Nam giới 30 2.2.1 Ở Việt Nam 31 2.2.2 Trên giới 32 2.2.3 Một số biện pháp kiểm soát 36 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 3.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị thí nghiệm 42 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 42 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 42 3.1.3 Hóa chất mơi trường thí nghiệm 42 3.2 Phương pháp 43 3.2.1 Nội dung 1: Thu thập mẫu đất côn trùng bị nhiễm nấm bệnh 43 3.2.2 Nội dung 2: Phân lập Paecilomyces sp từ mẫu đất môi trường PDA+ 44 3.2.3 Nội dung 3: Phân lập Paecilomyces sp từ mẫu côn trùng nhiễm nấm môi trường PDA+ 45 3.2.4 Nội dung 4: Thử nghiệm hoạt lực sinh học chủng Paecilomyces sp số loài sâu gây hại trồng điều kiện phịng thí nghiệm 45 3.2.4.1 Thử nghiệm hoạt lực sinh học chủng Paecilomyces sp sâu khoang (Spodoptera litura) điều kiện phịng thí nghiệm 45 3.2.4.2 Thử nghiệm hoạt lực sinh học chủng Paecilomyces sp sâu tơ (Plutella xylostella) điều kiện phòng thí nghiệm 46 3.2.4.3 Sàng lọc chủng Paecilomyces sp có khả diệt sâu hại mạnh có tiềm ứng dụng 48 3.2.5 Nội dung 5: Khảo sát ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy lên hành thành bào tử chủng nấm Paecilomyces sp 48 iii 3.2.6 Nội dung 6: Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng nước bổ sung vào môi trường nuôi cấy lên hành thành bào tử chủng nấm Paecilomyces sp 49 3.2.7 Xử lý số liệu 49 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 4.1 Kết thu mẫu đất côn trùng bị nhiễm nấm bệnh 50 4.2 Kết phân lập Paecilomyces sp 51 4.3 Kết thử nghiệm hoạt lực sinh học chủng Paecilomyces sp sâu khoang (Spodoptera litura) điều kiện phòng thí nghiệm 56 4.4 Kết thử nghiệm hoạt lực sinh học chủng Paecilomyces sp sâu tơ (Plutella xylostella) điều kiện phòng thí nghiệm 58 4.5 Kết khảo sát ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy lên hành thành bào tử chủng nấm Paecilomyces sp 61 4.6 Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng nước bổ sung vào môi trường nuôi cấy lên hành thành bào tử chủng nấm Paecilomyces sp 63 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 5.1 Kết luận 65 5.2 Kiến nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 4-ASD : 4-beta acetoxyscirpendiol Bt : Bacillus thuringiensis cAMP : cyclic adenosine monophosphate CAPD : continuos ambulatory peritoneal dialysis CFU : colony – forming unit EFSA : European Food Safety Authority EPA : Environmental Protection Agency FDA : Food and Drug Administration GA : gibberellin GDP : Gross Domestic Product IAA : indole acetic acid ICAMA : Institute for the Control of Agrochemicals, Ministry of Agriculture IPC : Integrated Pest Control IPM : Integrated Pest Management MDR : multidrugresistan MEA : malt extract agar MT : môi trường NAA : 1-naphthaleneacetic acid NAPPO : North American Plant Protection Organization NSC : ngày sau chủng nấm NT : nghiệm thức NPV : nucleopolyhedrosis virus P01 : Paecilomyces javanicus FP48 P02 : Paecilomyces javanicus FP49 P03 : Paecilomyces javanicus FP50 P04 : Paecilomyces javanicus FP59 P05 : Paecilomyces javanicus FP61 P06 : Paecilomyces lilacinus v T0 : nhiệt độ PDA : Potato Dextrose Agar TNHH : trách nhiệm hữu hạn USD : United States dollar USEPA : United States Environmental Protection Agency vi DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1 Thành phần môi trường dùng thử nghiệm khảo sát môi trường nuôi cấy Paecilomyces sp 43 Bảng 4.1 Các mẫu đất côn trùng bị nhiễm nấm bệnh thu 50 Bảng 4.2 Danh sách chủng nấm Paecilomyces sp phân lập 52 Bảng 4.3 Kết định danh chủng nấm Paecilomyces sp 56 Bảng 4.4 Hoạt lực diệt sâu khoang (Spodoptera litura) chủng nấm Paecilomyces sp điều kiện phịng thí nghiệm 57 Bảng 4.5 Hoạt lực diệt sâu tơ (Plutella xylostella) chủng nấm Paecilomyces sp điều kiện phịng thí nghiệm 59 Bảng 4.6 Mật độ bào tử chủng nấm Paecilomyces sp tạo thành môi trường nuôi cấy 61 Bảng 4.7 Mật độ bào tử chủng nấm Paecilomyces sp tạo thành mơi trường ni cấy có bổ sung hàm lượng nước khác 64 vii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1 Paecilomyces leycettanus Hình 2.2 Đặc điểm hình thái Paecilomyces sinensis Hình 2.3 Đặc điểm hình thái Paecilomyces lilacinus Hình 2.4 Đặc điểm hình thái Paecilomyces tenuipes Hình 2.5 Đặc điểm hình thái Paecilomyces carneus Hình 2.6 Đặc điểm hình thái Paecilomyces amoeneroseus Hình 2.7 Đặc điểm hình thái Paecilomyces cateniannulatus Hình 2.8 Đặc điểm hình thái Paecilomyces fumosoroseus Hình 2.9 Đặc điểm hình thái Paecilomyces javanicus Hình 2.10 Cấu trúc paecilotoxin C 14 Hình 2.11 Tiến trình lây nhiễm nấm trùng 19 Hình 4.1 Một số mẫu côn trùng bị nhiễm nấm bệnh thu thập 51 Hình 4.2 Đặc điểm hình thái chủng nấm P01 môi trường PDA 52 Hình 4.3 Đặc điểm hình thái chủng nấm P02 môi trường PDA 53 Hình 4.4 Đặc điểm hình thái chủng nấm P03 mơi trường PDA 53 Hình 4.5 Đặc điểm hình thái chủng nấm P04 mơi trường PDA 54 Hình 4.6 Đặc điểm hình thái chủng nấm P05 mơi trường PDA 55 Hình 4.7 Đặc điểm hình thái chủng nấm P06 mơi trường PDA 55 Hình 4.8 Mơ hình thử nghiệm khả diệt sâu khoang (Spodoptera litura) ngày thứ sau chủng nấm Paecilomyces sp 58 Hình 4.9 Sâu tơ (Plutella xylostella) chết mọc lại nấm sau tiến hành thử nghiệm khả diệt sâu chủng chủng nấm P04 60 Hình 4.10 Thử nghiệm khảo sát môi trường nuôi cấy chủng Paecilomyces sp 63 Phụ lục 1.3 Kết định danh chủng nấm P03 Phụ lục 1.4 Kết định danh chủng nấm P04 Phụ lục 1.5 Kết định danh chủng nấm P05 Phụ lục 1.6 Kết định danh chủng nấm P06 Phụ lục Bảng ANOVA phân tích kết thử nghiệm hoạt lực sinh học chủng nấm Paecilomyces sp sâu khoang (Spodoptera litura) điều kiện phịng thí nghiệm Anova: Two-Factor With Replication SUMMARY NSC NSC NSC NSC 10 NSC Total P01: Count Sum Average Variance 0 0 0.2 0.066667 0.003333 0.333333 0.023333 1.21052632 0.40350877 0.04524469 15 2.410526 0.160702 0.042255 P02: Count Sum Average Variance 0 0 0.4 0.133333 0.023333 0.7 0.233333 0.023333 0.33333333 0.00369344 15 2.1 0.14 0.02548 P03: Count Sum Average Variance 0 0 0.1 0.033333 0.003333 0.8 0.266667 0.013333 0.8 0.266667 0.013333 15 1.7 0.1133333 0.0212381 P04: Count Sum Average Variance 0 0.1 0.033333 0.003333 0.3 0.1 0.01 0.7 0.233333 0.013333 0.89473684 0.29824561 0.02585411 15 1.9947368 0.1329824 0.0216639 P05: Count Sum Average Variance 0 0 0.2 0.066667 0.003333 0.7 0.233333 0.003333 1.21052632 0.40350877 0.00369344 15 2.110526 0.140702 0.027778 P06: Count 3 3 15 Sum Average 0.1 0.033333 0.5 0.166667 0.333333 1.6 0.533333 2.15789474 0.71929825 5.357895 0.357193 Variance 0.003333 0.003333 0.003333 0.003333 0.00369344 0.067554 18 0.1 18 0.6 18 2.2 18 5.5 18 7.27368421 0.005556 0.000556 0.033333 0.004706 0.122222 0.015948 0.305556 0.021732 0.40409357 0.03496352 SS df MS F P-value Total Count Sum Average Variance ANOVA Source of Variation F crit Sample Columns 0.62046 2.179645 0.124092 0.544911 16.03401 70.40829 5.1897E-10 5.6001E-22 2.36827024 2.5252151 Interaction 0.239561 20 0.011978 1.547691 0.0986228 1.74798413 Within 0.464358 60 0.007739 Total 3.504025 89 Phụ lục Bảng ANOVA phân tích kết thử nghiệm hoạt lực sinh học chủng nấm Paecilomyces sp sâu tơ (Plutella xylostella) điều kiện phịng thí nghiệm Anova: Two-Factor With Replication SUMMARY NSC NSC NSC NSC Total 3 3 12 Sum Average Variance 0.5 0.1666667 0.0364583 1.227273 0.409091 0.006198 1.2272727 0.4090909 0.0061983 1.2272727 0.4090909 0.0061983 4.1818182 0.3484848 0.0220307 P02: Count Sum Average Variance 1.75 0.5833333 0.0364583 2.045455 0.681818 0.006198 3 3 12 9.7954545 0.8162879 0.0458967 P03: Count 3 3 12 Sum Average Variance 0.3333333 0.0208333 1.636364 0.545455 0.006198 2.7272727 0.9090909 0.0061983 8.3636364 0.6969697 0.0856812 P04: Count Sum Average Variance 1.5 0.5 0.015625 2.454545 0.818182 0.006198 3 3 12 9.9545455 0.8295455 0.0494694 P05: Count Sum 0.5 2.318182 2.4545455 2.5909091 12 7.8636364 0.1666667 0.0364583 0.772727 0.006198 0.8181818 0.0061983 0.8636364 0.655303 0.0968335 3 3 12 Sum Average 1.875 0.625 2.590909 0.863636 3 10.465909 0.8721591 Variance 0.046875 0.018595 0 0.0374982 18 18 P01: Count Average Variance P06: Count Total Count 18 18 Sum Average Variance 7.125 0.3958333 0.0592831 12.27273 0.681818 0.032815 15.409091 0.8560606 0.0491614 15.818182 0.8787879 0.0500729 SS df MS F P-value F crit 0.4450919 0.8947734 0.0328674 0.0111287 39.995004 80.402417 2.9533924 5.368E-16 9.825E-19 0.0022329 2.408514 2.798061 1.880175 ANOVA Source of Variation Sample Columns Interaction Within 2.2254595 2.6843201 0.4930107 0.534177 15 48 Total 5.9369673 71 Phụ lục Bảng ANOVA phân tích kết ảnh hưởng loại mơi trường lên hình thành bào tử chủng nấm P02 Anova: Single Factor SUMMARY Groups MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 Count 3 3 3 Sum 27.825 25.3245 7.317 0.8031 7.089 7.3035 Average 9.275 8.4415 2.439 0.2677 2.363 2.4345 Variance 0.889219 1.253305 0.029729 0.000461 0.005392 0.12013 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups SS 206.4046 4.59647 df MS 41.28092 0.383039 F 107.7721 Total 211.0011 12 P-value F crit 1.52E-09 3.105875 17 Phụ lục Bảng ANOVA phân tích kết ảnh hưởng loại mơi trường lên hình thành bào tử chủng nấm P04 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance MT1 MT2 MT3 MT4 3 3 3.8757 2.3745 10.8495 5.07 1.2919 0.7915 3.6165 1.69 0.01066 0.000895 0.001413 0.051431 MT5 1.5825 0.5275 0.0633 MT6 0.9795 0.3265 0.000543 ANOVA Source of Variation SS df Between Groups Within Groups 21.86558 0.256483 12 Total 22.12206 17 MS F 4.373116 0.021374 204.6041 P-value F crit 3.51E-11 3.105875 Phụ lục Bảng ANOVA phân tích kết ảnh hưởng loại mơi trường lên hình thành bào tử chủng nấm P05 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance MT1 MT2 MT3 MT4 3 3 12.405 8.9625 14.235 5.694 4.135 2.9875 4.745 1.898 0.436406 0.105544 0.412556 0.056849 MT5 8.5725 2.8575 0.012544 MT6 3.7995 1.2665 0.058717 SS df MS F P-value F crit 5.142662 0.180436 28.50131 2.9E-06 3.105875 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 25.71331 2.165232 12 Total 27.87854 17 Phụ lục Bảng ANOVA phân tích kết ảnh hưởng hàm lượng nước môi trường nuôi cấy lên hình thành bào tử chủng nấm P02 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance 45% 50% 3 278.25 38.288 92.75 12.76267 8.892188 0.296277 55% 17.2782 5.7594 0.274603 60% 65% 3 6.81745 2.272483 0.13 0.003066 70% 4.739 1.579667 0.030592 Source of Variation SS df MS F 3893.834 14.94274 260.5837 ANOVA Between Groups Within Groups 19469.17 179.3128 12 P-value F crit 8.37E-12 3.105875 Total 19648.48 17 Phụ lục Bảng ANOVA phân tích kết ảnh hưởng hàm lượng nước mơi trường ni cấy lên hình thành bào tử chủng nấm P04 Anova: Single Factor SUMMARY Groups 45% 50% 55% 60% 65% 70% Count 3 3 3 Sum 108.495 49.712 20.4972 7.74 4.2822 3.864 Average 36.165 16.57067 6.8324 2.58 1.4274 1.288 Variance 0.01413 0.942165 0.43002 0.0532 0.007118 0.030576 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups SS 2814.952 3.208759 df MS 562.9903 0.267397 F 2105.45 Total 12 2818.16 P-value F crit 3.19E-17 3.105875 17 Phụ lục Bảng ANOVA phân tích kết ảnh hưởng hàm lượng nước môi trường ni cấy lên hình thành bào tử chủng nấm P05 Anova: Single Factor SUMMARY Groups 45% 50% 55% 60% 65% 70% Count 3 3 3 Sum 142.35 64.512 39.846 39.6 22.23 14.532 Average 47.45 21.504 13.282 13.2 7.41 4.844 Variance 4.125562 0.437248 1.100028 1.12 4.891536 1.027354 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups SS 3630.277 118.1559 df MS 726.0555 9.846329 F 73.7387 Total 3748.433 12 P-value F crit 1.38E-08 3.105875 17 Phụ lục 10 Phương pháp định lượng vi sinh vật cách đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu Tiến trình đếm sau: - Lắc ống nghiệm pha loãng mẫu - Đậy kính lên lưới đếm - Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho giọt vào mép kính, lực mao dẫn dịch tụ dàn vào mặt lưới đếm Chú ý, không để thành bọt khí lưới đếm tràn dịch mẫu xuống rãnh - Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi để yên – phút, sau tiến hành đếm tế bào lớn chéo vật kính X40, đếm tế bào nằm lồng ô tế bào nằm cạnh liên tiếp chiều Đếm từ ô đến ô thứ 16 - Dùng xong buồng đếm kính phải rửa lau khô - Số lượng tế bào 1ml mẫu nghiên cứu tính cơng thức: N (tế bào/ml) = 0,25a  106  b Trong đó: N (tế bào/ml): mật độ tế bào a: số tế bào bình qn lớn b: độ pha loãng mẫu Lưu ý: số tế bào đếm ô lớn phải 200 đảm bảo mức độ xác phương pháp ... điều kiện phịng thí nghiệm 45 3.2.4.1 Thử nghiệm hoạt lực sinh học chủng Paecilomyces sp sâu khoang (Spodoptera litura) điều kiện phịng thí nghiệm 45 3.2.4.2 Thử nghiệm hoạt lực sinh học... lập Paecilomyces sp 51 4.3 Kết thử nghiệm hoạt lực sinh học chủng Paecilomyces sp sâu khoang (Spodoptera litura) điều kiện phịng thí nghiệm 56 4.4 Kết thử nghiệm hoạt lực sinh học... lập 52 Bảng 4.3 Kết định danh chủng nấm Paecilomyces sp 56 Bảng 4.4 Hoạt lực diệt sâu khoang (Spodoptera litura) chủng nấm Paecilomyces sp điều kiện phịng thí nghiệm 57 Bảng 4.5