TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9656 : 2013 ISO 8432 : 1987 TINH DẦU - PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - PHƯƠNG PHÁP CHUNG Essential oils - Analysis by high performance liquid chromatography - General method Lời nói đầu TCVN 9656:2013 hồn tồn tương đương với ISO 8432:1987; TCVN 9656:2013 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F2 Dầu mỡ động vật thực vật biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TINH DẦU - PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - PHƯƠNG PHÁP CHUNG Essential oils - Analysis by high performance liquid chromatography - General method Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp chung để xác định hàm lượng hợp chất đặc trưng và/hoặc nghiên cứu đặc tính tinh dầu phân tích sắc ký lỏng hiệu cao Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 8443 (ISO 356), Tinh dầu - Chuẩn bị mẫu thử Nguyên tắc Sắc ký lỏng phương pháp tách dựa nguyên tắc hấp thụ, phân bố, trao đổi và/hoặc lọc ion Phương pháp cho phép phân tích lượng nhỏ tinh dầu thơm nguyên liệu thô khác, dùng công nghiệp sản xuất nước hoa, cột sắc ký nhồi thích hợp điều kiện thích hợp, nhận biết thành phần khác định lượng hợp chất đặc trưng cách đo diện tích chiều cao pic chúng Thuốc thử vật liệu thử 4.1 Chất chuẩn, tương ứng với hợp chất cần xác định cần phát Chất chuẩn quy định tiêu chuẩn cụ thể Chất chuẩn phải tinh 4.2 Chất chuẩn nội chất chuẩn ngoại Chất chuẩn nội chất chuẩn ngoại quy định tiêu chuẩn tương ứng; chúng cần rửa giải gần với thành phần cần xác định tốt pic chúng không chồng lên pic thành phần tinh dầu, phát hệ thống detector sử dụng 4.3 Pha động Thành phần pha động ổn định q trình vận hành (rửa giải đẳng dịng) thay đổi phù hợp với chương trình quy định (rửa giải gradient) Pha động quy định tiêu chuẩn tương ứng 4.4 Dung môi rửa giải Bản chất chất lượng dung môi chọn theo mẫu cần phân tích theo chất cột detector sử dụng Dung dịch phần tử rắn nhỏ 0,5 µm 4.5 Khí Nếu hệ thống bơm u cầu sử dụng khí khí phải khí trơ Có thể sử dụng khí heli, nitơ agon Thiết bị, dụng cụ 5.1 Hệ thống tách 5.1.1 Máy sắc ký 5.1.2 Hệ thống bơm hệ thống khác, cho phép trì tốc độ dịng khơng đổi theo chương trình cài đặt trước 5.1.3 Hệ thống cấp dung mơi 5.1.4 Hệ thống khử khí dung mơi 5.1.5 Hệ thống detector thích hợp, xác định hợp chất có mặt mẫu 5.2 Bộ ghi tích phân (tùy chọn), tính chúng phải tương thích với phận khác thiết bị 5.3 Cột, làm vật liệu trơ (ví dụ: thủy tinh, thép khơng gỉ) có đặc tính học chịu áp lực Bản chất kích cỡ hạt pha tĩnh quy định tiêu chuẩn tương ứng Nhiệt độ cột phải ổn định cài đặt chương trình trước Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử xem TCVN 8443 (ISO 356) Nếu mẫu thử bơm cần chuẩn bị đặc biệt phải rõ tiêu chuẩn tương ứng Điều kiện vận hành 7.1 Nhiệt độ Nếu nhiệt độ khác với nhiệt độ môi trường phải quy định tiêu chuẩn tương ứng 7.2 Tốc độ dịng dung mơi rửa giải Điều chỉnh tốc độ dòng cho tách thành phần cần xác định Tính cột 8.1 Phép thử độ trơ hóa học Đảm bảo sản phẩm cần xác định không bị hư hỏng 8.2 Hiệu cột Xác định số đĩa lý thuyết (N), từ pic chuẩn nội quy định tiêu chuẩn tương ứng việc sử dụng dung môi quy định nhiệt độ đẳng nhiệt điều kiện đẳng dịng theo cơng thức sau: d N = 5,54 r b 0,5 Trong đó: dr khoảng cách đo đường từ điểm bơm mẫu đến điểm uốn pic cần xác định, tính milimet (mm); b0,5 độ rộng nửa chiều cao pic, tính milimet (mm) 8.3 Độ phân giải Tính hệ số phân giải, R, hai pic gần I II, theo công thức sau: R= dr (II) − dr (I) b0,5 (I) + b 0,5 (II) Trong đó: dr(I) khoảng thời gian lưu pic I; dr(II) khoảng thời gian lưu pic II; b0,5(I) độ rộng nửa chiều cao pic I; b0,5(II) độ rộng nửa chiều cao pic II (Xem Hình 1) Hình - Phép tính hệ số phân giải Phương pháp xác định 9.1 Điều kiện chung Ghi lại sắc đồ theo quy định tiêu chuẩn có liên quan Đối với phép xác định thành phần đặc trưng cụ thể tiêu chuẩn tương ứng quy định việc vận hành điều kiện đẳng dòng vận hành theo rửa giải gradient Trong trường hợp đó, tốc độ dịng phải điều chỉnh cho việc tách thu quy định tiêu chuẩn tương ứng Sau ổn định điều kiện vận hành, bơm lượng thích hợp phần mẫu thử Từ đó, thu sắc đồ "A" 9.2 Phương pháp nội chuẩn Ghi lại sắc đồ tinh dầu sắc đồ chất chuẩn nội (4.2), điều kiện thao tác Kiểm tra sắc đồ để chắn mẫu cần xác định tách khỏi thành phần tinh dầu, chất chuẩn nội không gây nhiễu cho thành phần khác tinh dầu 9.2.1 Xác định hệ số đáp ứng Nếu để định lượng hệ số đáp ứng thành phần tương ứng với chất chuẩn nội cần xác định, cân lượng thích hợp chất chuẩn nội (4.2) chất chuẩn (4.1) cho thu diện tích pic tương ứng xấp xỉ Dung mơi cần sử dụng để pha lỗng quy định tiêu chuẩn tương ứng Sau ổn định tồn hệ thống, bơm lượng thích hợp hỗn hợp tiến hành phân tích điều kiện quy định nêu 9.1 Thu sắc đồ "B" Tính hệ số đáp ứng, K, theo công thức sau: K= mR A E mE A R Trong đó: AR diện tích pic tương ứng với chất chuẩn có hệ số đáp ứng cần tính, tính đơn vị tích phân; AE diện tích pic tương ứng với chất chuẩn nội, tính đơn vị tích phân; mR khối lượng chất chuẩn, tính miligam (mg); mE khối lượng chất chuẩn nội, tính miligam (mg); 9.2.2 Xác định Nếu tiêu chuẩn tương ứng, có quy định việc sử dụng chất chuẩn nội, chuẩn bị hỗn hợp cách cân lượng thích hợp tinh dầu chất chuẩn nội, xác đến 0,1 mg Chọn lượng chất chuẩn nội cho diện tích pic hợp chất cần xác định diện tích chất chuẩn nội xấp xỉ Sau ổn định toàn hệ thống, bơm lượng thích hợp hỗn hợp tiến hành phân tích điều kiện quy định nêu 9.1 Thu sắc đồ "C" 9.3 Phương pháp thêm chuẩn Nếu sử dụng phương pháp chuẩn nội để xác định sử dụng phương pháp thêm chuẩn Trong trường hợp này, bơm lượng thích hợp tinh dầu X hợp chất cần xác định Y hợp chất cho pic gần với pic sắc đồ "D" thu Sau chuẩn bị cách cân hỗn hợp m gam mẫu thử mx gam chất chuẩn (4.1) tương ứng với hợp chất X cần xác định, xác đến 0,1 mg Bơm lượng thích hợp hỗn hợp Thu sắc đồ "E" 9.4 Phương pháp ngoại chuẩn Nếu sử dụng phương pháp quy định 9.2 9.3 sử dụng phương pháp ngoại chuẩn Phương pháp áp dụng thiết bị có hệ thống bơm tích bơm (ví dụ: van bơm) Chuẩn bị dung dịch có nồng độ chất chuẩn tăng dần Bơm lượng dung dịch khác Vẽ đồ thị diện tích pic theo nồng độ chất chuẩn dung dịch khác Đồ thị thu cho thấy diện tích pic chất chuẩn tương ứng với nồng độ dung dịch khác Bơm lượng tinh dầu "Z" hợp chất cần xác định Đo diện tích pic theo "Z" Từ diện tích cho theo "Z", ghi lại nồng độ "Z" từ đồ thị 10 Biểu thị kết 10.1 Phương pháp nội chuẩn Tính hàm lượng hợp chất cần xác định, cx, phần trăm khối lượng, theo công thức sau: A X x mE x K x 100 AE x mX Trong đó: AX diện tích pic tương ứng với hợp chất cần xác định, tính đơn vị tích phân; AE diện tích pic tương ứng với chất chuẩn nội, tính đơn vị tích phân; mX khối lượng tinh dầu, tính miligam (mg); mE khối lượng chất chuẩn nội, tính miligam (mg); K hệ số đáp ứng hợp chất cần xác định tương ứng với chất chuẩn nội 10.2 Phương pháp thêm chuẩn Tính hàm lượng hợp chất cần xác định, cx, tính theo phần trăm khối lượng, theo công thức: mR r x 100 (r' > r) x m r '−r Trong đó: mR khối lượng chất chuẩn (4.1), tính gam (g); m khối lượng tinh dầu, tính gam (g); r= AX AY Trong đó: AX diện tích pic tương ứng với hợp chất X sắc đồ "D"; AY diện tích pic tương ứng với hợp chất Y gần với X sắc đồ "D"; r' = A' X A'Y Trong đó: A'X diện tích pic tương ứng với hợp chất X sắc đồ "E"; A'Y diện tích pic tương ứng với hợp chất Y gần với X sắc đồ "E" 10.3 Kết độ lặp lại Lấy kết hệ số đáp ứng K hàm lượng cx hợp chất cần xác định, giá trị trung bình vài phép xác định (ít ba phép xác định) tiến hành mẫu thử Các giá trị khác không khác với giá trị trung bình chúng tỷ lệ phần trăm định Giá trị phần trăm số phép xác định quy định tiêu chuẩn tương ứng 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải gồm thông tin sau: a) hệ thống thiết bị; b) viện dẫn tiêu chuẩn này; c) đặc tính cột (vật liệu, kích thước, chất nhồi, pha tĩnh); d) đặc tính detector (tùy chọn) điều kiện vận hành; e) đặc tính pha động (tốc độ chất); f) nhận biết mẫu thử (lượng bơm dung dịch pha loãng cuối cùng); g) kết thu ... ứng Nhiệt độ cột phải ổn định cài đặt chương trình trước Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử xem TCVN 8443 (ISO 356) Nếu mẫu thử bơm cần chuẩn bị đặc biệt phải rõ tiêu chuẩn tương ứng Điều kiện