TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9653:2013 ISO 7609:1985 TINH DẦU - PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝ KHÍ TRÊN CỘT MAO QUẢN - PHƯƠNG PHÁP CHUNG Essential oils - Analysis by gas chromatography on capillary columns - General method Lời nói đầu TCVN 9653:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 7609:1985; TCVN 9653:2013 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F2 Dầu mỡ động vật thực vật biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Lời giới thiệu Phần mô tả phương pháp phân tích sắc ký khí dài, mặt cần thiết lập phương pháp chung, đưa thông tin chi tiết tất thông số chung, thiết bị, dụng cụ, sản phẩm, phương pháp, công thức v.v… mặt khác xây dựng tiêu chuẩn có thơng tin ngắn gọn phương pháp xác định thành phần cụ thể tinh dầu, đưa điều kiện thao tác cụ thể Các tiêu chuẩn cụ thể viện dẫn đến tiêu chuẩn phép phân tích cột mao quản viện dẫn đến TCVN 9652 (ISO 7359) phép phân tích sắc ký cột nhồi TINH DẦU - PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝ KHÍ TRÊN CỘT MAO QUẢN - PHƯƠNG PHÁP CHUNG Essential oils - Analysis by gas chromatography on capillary columns - General method Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp chung để xác định hàm lượng thành phần đặc trưng và/hoặc nghiên cứu đặc tính tinh dầu phân tích sắc ký khí cột mao quản Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 8443 (ISO 356), Tinh dầu - Chuẩn bị mẫu thử TCVN 9652 (ISO 7359), Tinh dầu - Phân tích sắc ký khí cột nhồi - Phương pháp chung Nguyên tắc Phân tích lượng nhỏ1) tinh dầu sắc ký khí cột có đường kính nhỏ dài, thành cột phủ trước pha tĩnh quy định chất (cột phủ bên chất nền) điều kiện quy định Nhận biết thành phần khác dựa vào số lưu chúng, cần Định lượng thành phần đặc trưng cách đo diện tích pic Thuốc thử 1) Lấy cẩn thận để đảm bảo phần mẫu thử bơm vào khơng bão hịa cột Trong q trình phân tích, sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sản phẩm chưng cất, trừ có quy định khác 4.1 Khí mang: hydro2), heli nitơ, phù hợp với kiểu detector sử dụng Nếu sử dụng detector có u cầu khí mang khác loại khí nêu phải có quy định cho loại khí 4.1.1 Khí phụ trợ: loại khí thích hợp với detector sử dụng Đối với detector ion hóa lửa khơng khí hydro phải có độ tinh khiết cao 4.2 Sản phẩm dùng để kiểm tra độ trơ hóa học cột: linalyl axetat, có độ tinh khiết 98% 4.3 Sản phẩm dùng để kiểm tra hiệu cột 3) 4.3.1 Linalol, có độ tinh khiết 99 % xác định sắc ký 4.3.2 Metan, có độ tinh khiết 99 % xác định sắc ký 4.4 Chất chuẩn, tương ứng với thành phần cần xác định cần phát Chất chuẩn xác định rõ tiêu chuẩn tương ứng 4.5 Chất chuẩn nội Chất chuẩn nội quy định tiêu chuẩn tương ứng; chất chuẩn nội cần rửa giải gần với thành phần cần xác định tốt pic chúng không chồng lên pic thành phần tinh dầu 4.6 Alkan chuẩn, có độ tinh khiết 95 % xác định sắc ký Dải alkan chuẩn sử dụng tiêu chuẩn cụ thể phụ thuộc vào số lưu thành phần điều kiện thử nghiệm CHÚ THÍCH Chỉ sử dụng alkan chuẩn xác định số lưu 4.7 Hỗn hợp thử nghiệm Chuẩn bị hỗn hợp chứa lượng của: - limonen, - axetophenon, - linalol, - linalyl axetat, - naphthalen, - alcohol cinnamic Tất thuốc thử phải có độ tinh khiết 95 % xác định sắc ký CHÚ THÍCH Có thể sử dụng sản phẩm khác, quy định tiêu chuẩn cụ thể Thiết bị, dụng cụ 5.1 Máy sắc ký, gắn với bơm đặc biệt dùng cho cột mao quản, cho phép bơm lượng 10-6 g, có detector thích hợp cài đặt chương trình nhiệt độ Hệ thống bơm detector phải phù hợp với phận để kiểm soát độc lập nhiệt độ tương ứng chúng 5.2 Cột, làm vật liệu trơ (ví dụ thủy tinh thép không gỉ, silica silica nung chảy), có đường kính từ 0,2 mm đến 0,5 mm có chiều dài từ 15 m đến 100 m 2) 3) Cần tuân thủ nghiêm ngặt quy định an tồn sử dụng khí Có thể sử dụng sản phẩm khác để kiểm tra hiệu cột, chúng quy định tiêu chuẩn tương ứng Bản chất pha tĩnh quy định tiêu chuẩn tương ứng Hiện pha tĩnh sử dụng nhiều metyl- phenylpolysiloxan polyetyleneglycol có nhóm hydroxy cuối chúng tự este hóa 5.3 Bộ ghi tích phân, tính chúng phải tương thích với phận khác thiết bị Chuẩn bị mẫu thử Xem TCVN 8443 (ISO 356) Nếu mẫu thử cần chuẩn bị đặc biệt trước bơm phải rõ tiêu chuẩn tương ứng Điều kiện vận hành 7.1 Nhiệt độ Nhiệt độ lò, hệ thống bơm mẫu detector phải quy định tiêu chuẩn tương ứng 7.2 Tốc độ dịng khí mang Điều chỉnh tốc độ dịng khí cho thu hiệu cần thiết (xem 8.2) 7.3 Tốc độ dịng khí phụ trợ Theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất để thu độ nhạy tối ưu từ detector Tính cột 8.1 Phép thử độ trơ hóa học Bơm lượng linalyl axetat điều kiện thử nghiệm (xem 7.1) Chỉ thu pic (trong giới hạn xác định độ tinh khiết) 8.2 Hiệu cột Xác định hiệu cột từ pic linalol chế độ đẳng nhiệt 130 oC Xác định số đĩa lý thuyết N, 25 000, theo công thức: Công thức số 1: (xem Hình 1) d' N 16 r Công thức số 2: d' N 5,54 r b Trong đó: d'r khoảng thời gian lưu giảm, biểu thị đơn vị chiều dài (khoảng thời gian lưu pic linalol trừ thời gian lưu pic khơng khí pic metan 130 oC, so sánh với pic khơng khí); khoảng cách, biểu thị đơn vị chiều dài giống đơn vị khoảng thời gian lưu, hai điểm giao đường với hai đường tiếp tuyến điểm uốn pic linalol; b độ rộng pic hợp chất quy định (linalol) nửa chiều cao pic, tính milimet (mm) Tốc độ ghi phải cho 10 mm, để thu độ chụm thích hợp Tốc độ ghi phải cho b mm, để thu độ chụm thích hợp Hình 8.3 Độ phân giải độ tách Để xác định độ phân giải và/hoặc độ tách, bơm lượng thích hợp hỗn hợp mẫu thử nghiệm (4.7) điều kiện thử nghiệm 8.3.1 Xác định độ phân giải (xem Hình 2) Tính hệ số phân giải, R, hai pic gần I II, theo công thức sau: R 2 d r (II ) d r (I ) (I ) (II ) Trong đó: dr(I) khỏang thời gian lưu pic I; dr(II) khoảng thời gian lưu pic II; (I) độ rộng chân pic I; (II) độ rộng chân pic II Nếu (I) = (II) tính R theo cơng thức sau: R d r (II ) d r (I ) d r (II ) d r (I ) 4 Trong độ lệch chuẩn (xem Hình 1) Nếu khoảng cách hai pic, dr(II) - dr(I) = hệ số phân giải R = (xem Hình 2) Nếu hai pic khơng phân giải hồn tồn đường tiếp tuyến điểm uốn hai pic gặp điểm C Để phân giải hoàn toàn, khoảng cách pic phải bằng: dr(II) - dr(I) = 6 từ R = 1,5 (xem Hình 3) Hình Hình 8.3.2 Xác định độ tách (xem Hình 4) Với đường thẳng nối đỉnh pic có liên quan Từ đường nền, dựng đường vng góc qua điểm cực tiểu hai pic Đo khoảng cách, h, theo đường vng góc này, đường điểm cắt với đường thẳng nối hai đỉnh pic Hình Đo khoảng cách, v, theo đường vng góc từ đường đến điểm uốn thấp hai pic Tính độ tách, p, biểu thị phần trăm, theo công thức: p 00( h v ) h 8.3.3 Kiểm tra độ phân giải theo chương trình nhiệt độ Sử dụng điều kiện sau: - cột dimetylpolysiloxan polyetylen glycol; - nhiệt độ cài đặt theo chương trình từ 80 oC đến 220 oC, với tốc độ tăng nhiệt oC/min o C/min Tốc độ dịng khí mang phải cho phép rửa giải tất thành phần hỗn hợp thử nghiệm (4.7) alkan chuẩn (4.6) cần thiết cho phép đo số lưu chúng, trước kết thúc chương trình nhiệt độ 8.3.3.1 Bơm lượng thích hợp hỗn hợp thử nghiệm (4.7) Trên sắc đồ thu được: a) trường hợp dùng cột dimetylpolysiloxan, pic limonen axetophenon phải có độ tách 95 % (xem 8.3.2); b) trường hợp dùng cột polyetylen glycol (Mr = 20 000), pic linalol linalyl axetat phải có độ tách 95 % (xem 8.3.2) Nếu sử dụng cột nhồi khác quy định tiêu chuẩn cụ thể cần phải theo tiêu chuẩn 8.3.3.2 Bơm lượng thích hợp hỗn hợp thử nghiệm (4.7) tính số lưu (xem Điều 9) thành phần hỗn hợp Trong trường hợp dùng cột dimetylpolysiloxan sử dụng alkan từ C 10 đến C16 Trong trường hợp dùng cột polyetylen glycol (Mr = 20 000) sử dụng alkan từ C11 đến C24 Các số lưu phải rõ độ phân cực cột so với đặc tính cấu trúc khác thành phần phân tích Các kết thu cột khác với chất nhồi chuẩn chấp nhận số lưu thành phần hỗn hợp thử nghiệm khác không đáng kể cột khác nhau1) Xác định số lưu Nếu cần xác định số lưu chuẩn bị hỗn hợp phần mẫu thử với alkan chuẩn gồm npentan Chọn alkan chuẩn phù hợp với dải số lưu dự kiến Sau nhiệt độ cột ổn định, bơm lượng thích hợp hỗn hợp tiến hành phân tích theo điều kiện quy định 10.1.1 Thu sắc đồ "B" 9.1 Đo số lưu So sánh sắc đồ "A" (xem 10.1.1) sắc đồ "B" (xem Điều 9) ghi lại pic tương ứng với alkan chuẩn sắc đồ "B" Trên sắc đồ "B", thực phép đo sau đây: 9.1.1 Điều kiện đẳng nhiệt Tính chênh lệch khoảng cách lưu đỉnh pic cần xác định đỉnh pic metan Độ chênh lệch dx', tính milimet Tính độ chênh lệch khoảng cách lưu đỉnh pic khơng khí đỉnh pic alkan chuẩn xuất trước pic cần xác định Độ chênh lệch dn', tính milimet Tính độ chênh lệch khoảng cách lưu đỉnh pic khơng khí đỉnh pic alkan chuẩn xuất sau pic cần xác định Độ chênh lệch d'n+1, tính milimet 9.1.2 Quy trình sử dụng chương trình nhiệt độ tuyến tính từ trình bơm Đo khoảng cách đường đỉnh pic có số lưu cần xác định đỉnh pic alkan chuẩn (n nguyên tử cacbon) xuất trước pic cần xác định Khoảng cách x, tính milimet Đo khoảng cách đường đỉnh pic alkan chuẩn liền kề (với n nguyên tử cacbon với n + nguyên tử cacbon xuất sau pic cần xác định) Khoảng cách y, tính milimet 9.2 Tính số lưu 9.2.1 Trong điều kiện đẳng nhiệt Tính số lưu, l, theo cơng thức: 1) Giới hạn chênh lệch quy định sau l 100 log d ' x log d ' n 100 n log d 'n 1 log d 'n Trong đó: d'x khoảng cách đỉnh pic có số lưu cần tính đỉnh pic khơng khí (hoặc pic metan) (xem 9.1.1), tính milimet (mm); d'n khoảng cách đỉnh pic alkan chuẩn có n nguyên tử cacbon đỉnh pic metan (xem 9.1.1), tính milimet (mm); d'n+1 khoảng cách đỉnh pic alkan chuẩn có (n + 1) nguyên tử cacbon đỉnh pic metan (xem 9.1.1), tính milimet (mm); CHÚ THÍCH Cơng thức có ý nghĩa d'n+1 > d'x > d'n 9.2.2 Quy trình sử dụng chương trình nhiệt độ tuyến tính từ q trình bơm Phép tính có giá trị thành phần có thời gian lưu nằm vùng tuyến tính chương trình nhiệt độ Tính số lưu, I, theo công thức: l 100 x 100 n y Trong x khoảng cách đỉnh pic có số lưu cần tính đỉnh pic alkan chuẩn có n nguyên tử cacbon (xem 9.1.2), tính milimet (mm); y khoảng cách đỉnh pic alkan chuẩn có n nguyên tử cacbon đỉnh pic alkan chuẩn có (n + 1) nguyên tử cacbon (xem 9.1.2), tính milimet (mm) CHÚ THÍCH Nếu tiến hành theo chương trình nhiệt độ khác khơng thể tính số lưu 10 Phương pháp xác định 10.1 Điều kiện chung 10.1.1 Sắc đồ tinh dầu Ghi lại sắc đồ theo quy định tiêu chuẩn tương ứng Các điều kiện nhiệt độ dịng khí phải giống điều kiện sử dụng cho phép thử hiệu cột (xem 8.2); Đối với phép xác định thành phần đặc trưng cụ thể tiêu chuẩn tương ứng quy định việc sử dụng điều kiện đẳng nhiệt nhiệt độ quy định Trong trường hợp đó, tốc độ dịng khí phải kiểm sốt cho việc tách chiết thu tiêu chuẩn tương ứng Sau nhiệt độ cột ổn định, bơm lượng phần mẫu thử thích hợp (lần lượt 10 -6 g) Thu sắc đồ "A" 10.2 Phương pháp nội chuẩn Ghi lại sắc đồ tinh dầu chất chuẩn nội (4.5) điều kiện thao tác Kiểm tra sắc đồ xem sản phẩm cần xác định tách khỏi thành phần khác tinh dầu chưa chất chuẩn nội không gây nhiễu cho thành phần khác tinh dầu 10.2.1 Xác định hệ số đáp ứng Nếu để định lượng hệ số đáp ứng thành phần tương ứng với chất chuẩn nội cần xác định, cân lượng thích hợp chất chuẩn nội (4.5) chất chuẩn (4.4) cho thu diện tích pic tương ứng gần Nếu sử dụng dung mơi quy định tiêu chuẩn tương ứng Sau nhiệt độ cột ổn định, bơm lượng thích hợp hỗn hợp tiến hành phân tích điều kiện quy định 10.1.1 Thu sắc đồ "F" Tính hệ số đáp ứng, K, thành phần tương ứng với chất chuẩn nội theo công thức sau: K AE mR AR mE Trong đó: AR diện tích pic tương ứng với chất chuẩn có hệ số đáp ứng cần tính, tính đơn vị tích phân; AE diện tích pic, tương ứng với chất chuẩn nội, tính đơn vị tích phân; m khối lượng chất chuẩn, tính miligam (mg); R m khối lượng chất chuẩn nội, tính miligam (mg) E 10.2.2 Xác định Nếu tiêu chuẩn tương ứng có quy định việc sử dụng chất chuẩn nội chuẩn bị hỗn hợp cách cân lượng thích hợp tinh dầu chất chuẩn nội, xác đến 0,001 g Chọn lượng chất chuẩn nội cho diện tích pic thành phần cần xác định chất chuẩn nội gần Sau nhiệt độ cột ổn định, bơm lượng thích hợp hỗn hợp tiến hành phân tích điều kiện quy định 10.1.1 Thu sắc đồ "C" 10.3 Phương pháp thêm chuẩn Nếu sử dụng phương pháp nội chuẩn để xác định sử dụng phương pháp thêm chuẩn Trong trường hợp này, bơm lượng tinh dầu thích hợp X thành phần cần xác định Y thành phần cho pic gần với X sắc đồ "D" thu Sau chuẩn bị hỗn hợp m gam tinh dầu mR gam chất chuẩn (4.4), xác đến 0,001 g, tương ứng với thành phần X cần xác định Bơm hỗn hợp Thu sắc đồ "E" 10.4 Phương pháp chuẩn hóa nội Phương pháp phương pháp xác định đúng, mà cho phép ước tính sơ nồng độ tương đối thành phần khác rửa giải khỏi hỗn hợp phép so sánh diện tích pic chúng, khơng xác định phần trăm khối lượng chúng 11 Biểu thị kết 11.1 Phương pháp nội chuẩn Tính hàm lượng cX, thành phần cần xác định, phần trăm khối lượng, theo cơng thức: AX mE K 100 AE m Trong đó: AX diện tích pic tương ứng với thành phần cần xác định (xem 10.2.2), tính đơn vị tích phân; AE diện tích pic tương ứng với chất chuẩn nội (xem 10.2.2), tính đơn vị tích phân; m khối lượng tinh dầu, tính miligam (mg); mE khối lượng chất chuẩn nội, tính miligam (mg); K hệ số đáp ứng thành phần cần xác định tương ứng với chất chuẩn nội (xem 10.2.1) 11.2 Phương pháp thêm chuẩn Tính hàm lượng cX, thành phần cần xác định, phần trăm khối lượng, theo công thức sau: mR r 100 (r' > r) m r ' r Trong đó: mR khối lượng chất chuẩn (4.4), tính gam (g); m khối lượng tinh dầu, tính gam (g) Và r Ax AY AX diện tích pic tương ứng với thành phần X sắc đồ "D" (xem 10.3); AY diện tích pic tương ứng với thành phần Y gần với X sắc đồ "D" Và r' A' X A'Y A'X diện tích pic tương ứng với thành phần X sắc đồ "E" (xem 10.3); A'Y diện tích pic tương ứng với thành phần y gần với X sắc đồ "E" 11.3 Phương pháp chuẩn hóa nội Khi phần mẫu thử bay hoàn toàn (tinh dầu khơng cịn cặn) điều kiện thử sắc đồ thu khơng có mặt q nhiều pic nhỏ, tính hàm lượng cX, thành phần cần xác định, phần trăm, theo công thức sau: AX 100 A Trong đó: AX diện tích pic thành phần cần xác định, tính đơn vị tích phân; A tổng tất diện tích pic, tính đơn vị tích phân 11.4 Kết độ lặp lại Lấy kết hệ số đáp ứng K hàm lượng cX thành phần cần xác định trung bình giá trị vài phép xác định (ít ba phép xác định) tiến hành mẫu thử Các giá trị sử dụng để tính khơng khác nhiều tỷ lệ phần trăm định (thường 2,5 %) so với giá trị trung bình Phần trăm số phép xác định quy định phương pháp khác tiêu chuẩn tương ứng 12 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải gồm thông tin sau: a) kiểu loại thiết bị, dụng cụ sử dụng; b) đặc tính cột (vật liệu, chiều dài, kích thước trong, pha tĩnh, chất tỷ lệ pha tĩnh với chất nền, phép đo độ hạt chất nền, nhiệt độ cột nhiệt độ chương trình); c) đặc tính hệ thống bơm (kiểu loại nhiệt độ); d) đặc tính detector (kiểu loại nhiệt độ); e) tốc độ khí mang tốc độ dịng; f) đặc tính ghi (chiều cao tín hiệu tối đa, tốc độ ghi, thời gian phản ứng toàn thang đo); g) phép nhận biết mẫu ... nhiệt độ cột ổn định, bơm lượng phần mẫu thử thích hợp (lần lượt 10 -6 g) Thu sắc đồ "A" 10.2 Phương pháp nội chuẩn Ghi lại sắc đồ tinh dầu chất chuẩn nội (4.5) điều kiện thao tác Kiểm tra sắc đồ... chất chuẩn nội gần Sau nhiệt độ cột ổn định, bơm lượng thích hợp hỗn hợp tiến hành phân tích điều kiện quy định 10.1.1 Thu sắc đồ "C" 10.3 Phương pháp thêm chuẩn Nếu sử dụng phương pháp nội chuẩn. .. Phương pháp xác định 10.1 Điều kiện chung 10.1.1 Sắc đồ tinh dầu Ghi lại sắc đồ theo quy định tiêu chuẩn tương ứng Các điều kiện nhiệt độ dịng khí phải giống điều kiện sử dụng cho phép thử hiệu cột