Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6191-1 : 1996 CHẤT LƯỢNG NƯỚC - PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM SỐ BÀO TỬ VI KHUẨN KỊ KHÍ KHỬ SUNFIT (CLOSTRIDIA) - PHẦN - PHƯƠNG PHÁP TĂNG SINH TRONG MÔI TRƯỜNG CẤY LỎNG Water quality - Detection and enumeration of the spores of sulfite-reducing anaerobes (clostridia) Part 1: Method by enrichment in a liquid medium Phạm vi áp dụng Phần tiêu chuẩn qui định phương pháp phát đếm số lượng bào tử vi khuẩn kị khí khử sunfit (Clostridia) cách tăng sinh môi trường cấy lỏng Lĩnh vực áp dụng Phương pháp áp dụng loại nước kể nước đục Tiêu chuẩn trích dẫn ISO 3696 Nước dùng cho phịng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật TCVN 5992 : 1995 (ISO 5667-2) Chất lượng nước Lấy mẫu Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu TCVN 5993 : 1995 (ISO 5667-3) Chất lượng nước Lấy mẫu Hướng dẫn bảo quản xử lý mẫu ISO 8199 Chất lượng nước - Hướng dẫn chung cho việc kiểm tra vi sinh vật cách đếm số lượng vi sinh vật môi trường nuôi cấy Định nghĩa Sử dụng định nghĩa sau cho mục đích tiêu chuẩn này: Clostridia: Là vi sinh vật kị khí có khả hình thành bào tử, có khả khử sunfit thuộc họ Bacillaceae giống Clostridium Nguyên tắc Việc phát bào tử vi khuẩn kị khí - khử sunfit (Clostridia) có mặt thể tích qui định mẫu thử cần theo bước sau: 5.1 Lựa chọn bào tử Lựa chọn bào tử có mẫu cách đun nóng thời gian đủ để diệt vi khuẩn dinh dưỡng 5.2 Nuôi cấy tăng sinh Phát đếm số bào tử vi khuẩn kị khí khử sunfit cách cấy thể tích khác mẫu thử vào mơi trường tăng sinh dạng lỏng, tiếp ni điều kiện kị khí 37 oC ± 1oC 44h ± 4h Môi trường nuôi cấy thuốc thử 6.1 Các nguyên vật liệu Đề làm tăng độ tái lập kết quả, nên sử dụng thành phần khơ, mơi trường khơ hồn chỉnh để chuẩn bị dịch pha loãng môi trường nuôi cấy Tương tự vậy, thuốc thử dạng thương phẩm sử dụng Cần tuân theo nghiêm ngặt dẫn nhà sản xuất Các hóa phẩm sử dụng để pha chế môi trường nuôi cấy thuốc thử phải đạt chất lượng phân tích Nước sử dụng phải nước cất nước khử ion không chứa chất ức chế sinh trưởng vi sinh vật điều kiện thử nêu (xem ISO 3696) Đo pH pH mét, phép đo tương ứng với nhiệt độ 25oC Nếu môi trường nuôi cấy pha chế mà không đếm chúng phải bảo quản chỗ tối nhiệt độ khoảng 4oC, không tháng, trừ có dẫn khác 6.2 Các mơi trường ni cấy dịch pha lỗng 6.2.1 Dịch pha lỗng: sử dụng dịch pha loãng nêu ISO 8199 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn 6.2.2 Môi trường phân lập Clostridia tăng cường (DRCM): 6.2.2.1 Môi trường nồng độ đơn Thành phần: Pepton từ thịt bò phân giải tryptic 10g Cao thịt 10g Cao men 1,5g Tinh bột 1g Natri axetat ngậm nước 5g Glucoza 1g L-Xystein hidroclorua 0,5g Nước 1000 ml Pha chế Trộn pepton, cao thịt, natri axetat cao men với 800 ml nước Với 200 ml nước cất lại chuẩn bị dung dịch tinh bột sau: trộn tinh bột với nước lạnh để tạo thành bột nhão Đun tới sơi phần nước cịn lại thêm từ từ nước nóng vào khối bột nhão vừa khuấy liên tục Sau bổ sung dung dịch tinh bột vào hỗn hợp đun tới sơi đến hịa tan tồn Cuối bổ sung glucoza L-Xystein hidroclorua Khuấy cho tan Chỉnh pH tới 7,1 - 7,2 dung dịch natri hidroxit mol/l Chuyển vào lọ có nút xốy dung tích 25 ml, lọ 25 ml dịch mơi trường Khử trùng nồi hấp áp lực 121oC ± 1°C 15 phút 6.2.2.2 Môi trường nồng độ kép Pha chế môi trường nồng độ kép 6.2.2.1 giảm lượng nước xuống nửa Chuyển vào lọ dung tích 25 ml 100 ml có nút xốy, lọ 10 ml 50 ml dịch mơi trường, tương ứng với thể tích lọ 6.2.3 Natri sunfit (Na2SO3), dung dịch 4% (m/m) Hòa tan 4g natri sunfit khan 100 ml nước Khử trùng qua lọc Bảo quản khoảng từ 2oC đến 5oC Dung dịch dùng 14 ngày 6.2.4 Sắt (III) xitrat (C6H5O7Fe), dung dịch 7% (m/m) Hòa tan g sắt (III) xitrat 100 ml nước Khử trùng qua lọc Bảo quản khoảng từ 2oC đến 5oC Dung dịch dùng 14 ngày 6.2.5 Mơi trường hồn chỉnh 6.2.5.1 Đúng vào ngày phân tích, trộn lượng dung dịch natri sunfit (6.2.3) dung dịch sắt (III) xitrat (6.2.4) 6.2.5.2 Thêm 0,5 ml hỗn hợp (6.2.5.1) vào lọ môi trường nồng độ đơn (6.2.2.1) vừa đun nóng để nguội 6.2.5.3 Thêm 0,4 ml hỗn hợp (6.2.5.1) vào lọ chứa 10 ml môi trường ml hỗn hợp vào lọ chứa 50 ml môi trường nồng độ kép (6.2.2.2) xử lý Thiết bị dụng cụ thủy tinh Các thiết bị thông thường phịng thí nghiệm vi sinh, và: 7.1 Các lọ có nút lọ nhỏ có nút xốy nút thủy tinh bo silicat dung tích 200 ml, 100 ml 25 ml LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn 7.2 Các pipét định mức dung tích 10 ml ml 7.3 Nồi cách thủy, điều chỉnh nhiệt độ 7.4 Ống nghiệm 150 mm x 13 mm 7.5 Dây thép nhỏ 7.6 Tủ ấm, trì nhiệt độ 37oC ± 1oC Lấy mẫu Theo TCVN 5992 : 1995 (ISO 5667-2) ISO 8199 kỹ thuật lấy mẫu Tiến hành thử 9.1 Xử lý mẫu thử Tham khảo TCVN 5993 : 1995 (ISO 5667-3) hướng dẫn bảo quản xử lý mẫu, xem ISO 8199 9.2 Chọn bào tử (kỹ thuật) Trước tiến hành phép thử, mẫu nước cần đun nóng bình cách thủy nhiệt độ 75 oC ± 5oC, 15 phút kể từ đạt đến nhiệt độ Cần định kỳ sử dụng lọ tương tự có chứa thể tích nước mẫu thử kiểm tra đối chứng nhằm kiểm tra thời gian đun nóng cần thiết Nhiệt độ nước lọ đối chứng ln ghi lại qua nhiệt kế 9.3 Cấy mẫu nuôi ấm Thêm 50 ml mẫu thử (9.2) vào lọ dung tích 100 ml có nút xốy có chứa 50 ml mơi trường hồn chỉnh nồng độ kép (6.2.5.3) Thêm 10 ml mẫu thử (9.2) vào dãy lọ dung tích 25 ml có nút xốy, có chứa 10 ml mơi trường hồn chỉnh nồng độ kép (6.2.5.3) Thêm ml mẫu thử (9.2) vào dãy lọ dung tích 25 ml có nút xốy, có chứa 25 ml mơi trường hồn chỉnh nồng độ đơn (6.2.5.2) Nếu cần, thêm ml dung dịch pha lỗng 1÷10 mẫu thử (9.2) vào dãy lọ dung tích 25 ml có nút xốy chứa 25 ml mơi trường nồng độ đơn hồn chỉnh (6.2.5.2) Để tiến hành phép kiểm tra định tính 100 ml nước uống nước đóng chai mà không thực kỹ thuật đếm MPN, dùng lọ 200 ml đổ đầy hỗn hợp gồm 100 ml mơi trường nồng độ kép hồn chỉnh (6.2.5.3) 100 ml mẫu thử (9.2) Nếu cần, đổ lên mặt tất lọ mơi trường hồn chỉnh nồng độ đơn (6.2.5.2) để thể tích chất lỏng lên tới mức cổ lọ, đảm bảo lại thể tích nhỏ khơng khí, sau gắn kín lọ, đem ni điều kiện kị khí Ni lọ cấy mẫu tủ ấm nhiệt độ 37 oC ± 1oC 44h ± 4h Các lượng mẫu cấy lớn lọ thủy tinh gần kín gây nổ sinh khí Việc bổ sung đoạn dây thép nung đỏ đặt vào môi trường trước cấy mẫu vào, tạo điều kiện cho sinh vật kị khí phát triển 9.4 Đọc kết Các lọ thấy có vệt đen kết khử sunfit kết tủa sắt (II) sunphua coi dương tính 10 Biểu thị kết Biểu thị kết theo ISO 8199 11 Báo cáo kết Báo cáo kết phải nêu rõ phương pháp sử dụng, biểu thị kết theo số có xác suất cao (MPN) vi khuẩn kị khí - khử sunfit (Clostridia) thể tích mẫu thử Và đề cập đến chi tiết thao tác không rõ tiêu chuẩn chi tiết bất thường ảnh hưởng đến kết thử Báo cáo kết bao gồm thông tin cần thiết cho việc nhận biết hoàn toàn mẫu thử LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162