ĐẶT VẤN ĐỀ 17 ĐẶT VẤN ĐỀ Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay đổi rất khác nhau ở các quần thể dân cư và các vùng địa lý khác nhau trên thế giới Nơi có tỷ lệ ung thư vòm cao nhất là miền Nam Trung[.]
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay đổi khác quần thể dân cư vùng địa lý khác giới Nơi có tỷ lệ ung thư vịm cao miền Nam Trung Quốc Grơnlen, châu Âu lại có tỷ lệ thấp Các nước đơng nam Á, có Việt nam có tỷ lệ UTVMH trung bình Virut EpsteinBarr (EBV), yếu tố môi trường khác nhạy cảm di truyền cho liên quan đến nguyên nhân ung thư vòm mũi họng EBV yếu tố nghiên cứu nhiều EBV có mặt 100% khối u vịm mũi họng thể ung thư biểu mơ khơng biệt hóa trìcác thể nhiễm tiềm ẩn I II, EBV biểu lộ gen quan trọng EBNA1, LMP1 LMP2 EBNA1 giúp trì gen EBV tế bào chủ, LMP1 lại gen có chức quan trọng liên quan đến dẫn truyền tín hiệu, chống lại chết theo chương trình tế bào có khả sinh ung thư cho tế bào bị nhiễm Các gen nằm cách xa gen EBV biểu lộ hoạt hóa promoter khác EBNA1 biểu lộ thể nhiễm tiềm ẩn nhờ hoạt hóa promoter: Cp, Wp Qp Tuy nhiên, ung thư vòm mũi họng hai promoter Cp Wp không hoạt động mà có Qp điều hịa biểu lộ gen EBNA1 Methyl hóa ADN vùng promoter yếu tố ngoại di truyền có vai trị quan trọng điều hịa biểu lộ genMức độ methyl hóa diễn vị trí đảo CpG vùng promoter exon1 có vai trị điều hịa biểu lộ gen, làm giảm biểu lộ khơng biểu lộ hồn tồn gen mà bình thường biểu lộ Việc xác định mức độ methyl hóa vùng promoter gen có ý nghĩa quan trọng tìm hiểu chế bệnh sinh bệnh liên quan đến chức gen nhiều q trình bệnh lý ác tính , đồng thời dấu ấn góp phần chẩn đốn sớm bệnh ung thư Ngồi ra, dùng chất hóa học để làm methyl hóa có tác dụng làm gen hoạt động trở lại thực chức chúng, giúp cho việc điều trị rối loạn hay bệnh lý khác Hiện nay, nhờ tiến sinh học phân tử người ta xác định mức độ methyl hóa gen đặc hiệu hay toàn bộ gen Các kỹ thuật dựa vào nguyên lý khác nhau, có kỹ thuật phức tạp, có kỹ thuật đơn giản thông dụng Chúng sử dụng kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóa sau xử lýADN phương pháp bisulfite để xác định mức độ methyl hóa promoter Wp, Cp Qp liên quan đến biểu lộ gen EBNA1, đồng thời phát triển PCR đa mồi promoter Việc phát triển PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa khơng giúp ích cho nghiên cứu ngoại di truyền mức độ ADN EBV mà nhiều gen khác liên quan đến ung thư, đặc biệt gen ức chế ung thư Đề tài nhằm mục đích sau: Phát triển phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa xác định mức độ methyl hóa promoter Wp, Cp Qp EBV tế bào dòng B95-8, Namalwa Raji Ứng dụng PCR đa mồi đặc hiệu xác định mức độ methyl hóa promoter điều hịa biểu lộ gen EBNA1 EBV mẫu sinh thiết bệnh nhân ung thư vòm mũi họng CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1.Tình hình ung thư vịm mũi họng giới Việt Nam Ung thư vòm mũi họng (UTVMH), khối u phát triển từ tế bào biểu mơ nằm vị trí cửa mũi sau vịm họng, loại bệnh đứng hàng đầu số ung thư vùng đầu mặt cổ với tính chất dịch tễ học đặc biệt liên quan tới địa lý[3] Tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi giới xếp thành vùng khác nhau: Khu vực có tỷ lệ mắc cao miền Nam Trung Quốc Grơnlen với tỷ lệ mắc từ 30 - 40/100.000 dân/năm Ngược lại, vùng có tỷ lệ mắc thấp, gồm châu Âu, Mỹ từ 0,7 - 1/100.000 dân/ năm [4] Cịn lại vùng có tỷ lệ mắc trung bình ngày có xu hướng tăng lên, vùng Bắc Phi, vùng biển Caribee đông nam Á với tỷ lệ từ - 12/100.000 dân Ở Việt nam UTVMH đứng hàng thứ ung thư nói chung đứng hàng đầu ung thư vùng đầu mặt cổ [1] 1.2 Những yếu tố nguy liên quan đến UTVMH 1.2.1 Vai trò virut Epstein-Barr Virut Epstein-Barr (EBV), yếu tố môi trường nghiên cứu nhiều cho thấy có liên quan chặt chẽ với UTVMH Người ta phát thấy EBV có mặt 100% khối u vịm mũi họng thể ung thư biểu mơ khơng biệt hóa (UCNT) Ngoài ra, sản phẩm gen EBV EBER, EBNA1 LMP-1,-2 xác định hầu hết mẫu sinh thiết UTVMH tổn thương q sản biểu mơ vịm họng gồm dịng tế bào tiền ác tính nhiễm EBV Điều phù hợp với giả thuyết cho EBV yếu tố khởi phát trình nhiều bước dẫn đến phát triển UTVMH [5] Ngoài việc phát EBV sản phẩm khối u vòm họng, người ta xác định kháng thể chống EBV huyết bệnh nhân Lượng kháng thể IgG IgA huyết bệnh nhân UTVMH cao - 10 lần so với bệnh nhân ung thư đầu mặt cổ khác người khỏe lâm sàng Đặc biệt IgA/VCA (kháng nguyên vỏ EBV), xét nghiệm sử dụng rộng rãi, thường qui nhiều nước giới, có Việt Nam có giá trị để theo dõi phát nguy mắc UTVMH, đồng thời có giá trị dấu ấn quan trọng theo dõi tái phát sau điều trị bệnh tăng cao [6,7] Người ta cho tái hoạt hóa, chép nhân lên EBV tượng xảy suốt trình phát triển UTVMH tương quan với nồng độ IgA/VCA 1.2.2 Mơi trường sống thói quen sinh hoạt Nhiều tác giả đề cập đến mơi trường sống khí hậu, bụi, khói nhiễm liên quan đến UTVMH, nói đến nhiều tập quán ăn uống Nhiều nghiên cứu bệnh - chứng tiến hành thu kết phù hợp với ý kiến cho rằng, tập quán ăn cá mối người Trung Quốc (vùng Quảng Đông) nguyên nhân quan trọng gây UTVMH, mối liên quan lớn ăn cá muối từ nhỏ Dùng cá muối hàng ngày làm tăng tỷ lệ UTVMH lên 1.8 đến 7.5 lần [8] Sử dụng thuốc cỏ liên quan đến UTVMH thơng qua hoạt hóa EBV trực tiếp thông qua ảnh hưởng đến tăng trưởng đến tế bào chuyển dạng EBV [9] Các chứng khác hút thuốc dùng formadehyde có giá trị thấp bệnh sinh ung thư vòm họng 1.2.3 Yếu tố di truyền Người ta thấy người Trung Quốc sinh Bắc Mỹ có tỷ lệ mắc thấp so với người sinh đất nước Trung Quốc, tỷ lệ mắc chuẩn cao dân số nói chung Điều cho thấy yếu tố di truyền có vai trị bệnh sinh UTVMH Nghiên cứu Trung quốc UTVMH có mối liên quan đến HLA-A2, B14 B46[10] Ở Việt Nam, kháng nguyên A11, A2, B17 liên kết cân A2-B17, A11- B17 có liên quan đến UTVMH [2] Việc xác định gen khác liên quan với tính cảm thụ bệnh lý nghiên cứu: CYP 2E1 (chuyển hóa nitrosamine), glutathion transferase M1 Cơ chế tác động chúng chưa rõ ràng, song điều khẳng định phát triển UTVMH phối hợp tác động yếu tố môi trường sống, EBV HLA 1.3 Virut Epstein-Barr 1.3.1 Sinh học EBV Trên thực tế, 90 % người trưởng thành giới nhiễm EBV tồn lâu dài thể nhiễm Việc lây nhiễm EBV chủ yếu thông qua nước bọt lứa tuổi sớm đời sống người mà thường khơng có triệu chứng Ngồi ra, EBV lây nhiễm qua máu, tổ chức qua sữa mẹ truyền sang con, chí thơng qua quan hệ tình dục EBV nhân lên tế bào biểu mơ tuyến nước bọt, sau qua biểu mơ vịm họng xâp nhập vào tế bào lympho B qua thụ thể CD21 bề mặt tế bào Sau vào nhân tế bào, EBV tồn dạng vòng chủ yếu tự nhân lên nhờ nguyên liệu tế bào Tuy nhiên, EBV tích hợp vào ADN nhiễm sắc thể tế bào chủ, ví dụ tế bào dịng Namalwa, tích hợp vào nhiễm sắc thể vị trí 1p35 Ở thể nhiễm tiềm ẩn lympho B, EBV biểu lộ kháng nguyên, với số lượng tế bào nhiễm thấp (1 tế bào lympho B/1ml máu) EBV khó bị tiêu diệt hệ miễn dịch Khi thể dung giải, EBV nhân lên nhiều giải phóng lại nhiễm vào tế bào lympho khác, chúng đến tuyến nước bọt hình thành chu kỳ nhân lên EBV thể Với tế bào biểu mô không biểu lộ rexeptơ CD21, người ta cho virut vào cách sau: Khả thứ nhất: xảy tiếp cận tế bào biểu mơ vịm họng tế bào nhiễm EBV Tế bào B vào chu trình dung giải, bung virus, cung cấp số lượng lớn hạt virus cho tế bào khác diện rộng Và khả thứ hai: virus vào tế bào biểu mô tượng thực bào qua trung gian rexeptơ với IgA Sixbey and Yao Ngoài ra, phân tử MHC lớp II đường virus xâm nhập vào tế bào biểu mơ Ngồi tế bào lympho B tế bào biểu mô, EBV cịn bị cơng tế bào máu khác đai thực bào, lympho T tế bào diệt tự nhiên (Natural Killer cell) 1.3.2 Cấu trúc EBV EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài gen khoảng 172kb ADN chuỗi đơi, GC chiếm 60% tổng số nucleotid EBV hình thành phân tử DNA dạng vòng tế bào bị nhiễm đầu TR (terminal repeat) (hình 1A) Khi xử lý EBV dòng tế bào B95-8 emzym cắt giới hạn BamHI, đoạn gen tạo ký hiệu theo bảng chữ theo thứ tự kích thước giảm dần (hình 1B) Thuật ngữ sử dụng cho đoạn sau: Mỗi chữ ký hiệu cho đoạn (A, B …), khung đọc mở trái phải thứ tự (0,1,2,3…) ví dụ BARF0 BARF1 Toàn bộ gen EBV dịng tế bào B95-8 giải trình tự gen đầu tiên, có mã số ngân hàng gen V01555 Các EBV sản xuất khoảng 100 kháng nguyên khác (các phân tử protein lớn) thể dung giải nó, ngược lại, có khoảng 10 kháng nguyên sản xuất thể nhiễm tiềm ẩn Reddy, Raslan, Gooneratne, Kathuria and Marks[2] A A BamHI B Hình Sơ đồ cấu trúc EBV: A) Cấu trúc EBV dạng vòng biểu thị vùng promoter gen thể nhiễm tiềm ẩn: EBER1 2: EBV Early RNA, EBNA1-6: EBV Nuclear Antigen, LMP1 và2: Latent Membrane Protein B) EBV dạng thẳng gồm đoạn gen tạo sau xử lý với enzym giới hạn BamH1 vị trí gen thể tiềm ẩn 1.3.3 Thể tiềm ẩn EBV Giống tất virut herpes, EBV tồn dạng không hoạt động tế bào bị nhiễm Ở thể này, EBV biểu lộ 12 gen, có 10 gen số dịch mã để tổng hợp protein, bao gồm loại protein kháng nguyên nhân (EBV Nuclear Antigen ): EBNA1, 2,3A,3B,3C, -LP; loại protenin màng tiềm ẩn (Latent Membrane Protein): LMP1, LMP2A 2B; loại RNA khơng mã hóa protein (EBV Early RNA): EBER1 và2 Có bốn thể tiềm ẩn phân loại dựa biểu lộ gen virut,được liệt kê bảng Bảng 1: Các thể tiềm ẩn EBV Thể tiềm ẩn Biểu lộ gen EBV Người thường bệnh liên quan EBER1 & LMP2A +/EBER1 & EBNA1 EBER1 & EBNA1 LMP1 LMP2A&2B EBER1&2 EBNA1- LMP1 LMP2A & B I II III Người thường U lympho Burkitt, UTVMH UTVMH, U lympho Hodgkin, U lympho tế bào T, ung thư tuyến nước bọt U lympho sau ghép tạng U lympho bệnh nhân AIDS, bạch cầu đơn nhân nhiễn khuẩn, LCL 1.3.4 Các gen EBV thể tiềm ẩn 1.3.4.1 EBNA1 Protein EBNA1 EBV thuộc dòng tế bào B95-8 có trọng lượng khoảng 6695 kDa chiều dài 641 axit amin Kích thước thay đổi chủng khác khác đoạn lặp lại glycin- alanin (Gly-Ala) Hennessy and Kieff Các cấu trúc EBNA1 chia thành bốn vùng rõ ràng: vùng nằm đầu N gồm 89 acid amin, vùng lặp lại Gly-Ala gồm 239 acid amin, vùng ngắn vùng gắn DNA đầu C có chiều dài từ axit amin 459-641 Ambinder, Mullen, Chang, Hayward and Hayward (Hình 2) Hình Cấu trúc EBNA1 Basic Gly-Ala repeats Basic DNA-binding NH2 COOH 33 83 90 328 382 459 604 EBNA1 protein biểu lộ tất tế bào nhiễm EBV Andersson-Anvret, Klein, Forsby and Henle đóng vai trị quan trọng việc trì episom EBV (dạng vịng) nhân tế bào chủ, chức phiên mã virut Yates JL Vùng gắn ADN protein EBNA1 tương tác với hai khu vực nằm vùng oriP promoter Cp, bao gồm gia đình lặp lặp lại FR (Family of Repeat) có chứa 20 đoạn nucleotid có trình tự lặp, đoạn DS (Dyad Symmetry) có vị trí gắn, vùng có hai vị trí gắn sau promoter Qp Liên kết EBNA1 với vùng FR có tính cao so với DS Qp gắn với FR điều hịa phiên mã gen EBNA Các gen biểu lộ kiểm soát promoter Cp hay Wp EBNA1 liên kết với intron xi chiều promoter Qp làm tự điều hịa biểu lộ protein EBNA1 Ở thể nhiễm tiềm ẩn I II, promoter Cp Wp không hoạt động biểu lộ EBNA1 thực Qp Cp Wp không hoạt động yếu tố phiên mã methyl hóa ADN Robertson, Hayward, Ling, Samid and Ambinder 1.3.4.2 EBNA2 Protein EBNA2 có trọng lượng phân tử từ 75-105 kDa Do có trình tự gen khác chủng EBV mà người ta xếp thành EBNA2A EBNA2B, dấu ấn quan trọng để xếp loại EBV typ I typ II Aitken, Sengupta, Aedes, Moss and Sculley Các protein EBNA2A EBNA2B chứa 484 443 axit amin cách tương ứng giống trình tự khoảng 57% EBNA2 protein virut biểu lộ tế bào lympho B bị nhiễm EBV, xuất khoảng 24-48 sau nhiễm EBV nuôi cấy tế bào in vitro Murray and Young Protein chất kích hoạt phiên mã số gen virut tế bào bao gồm gen CD21, CD23, Bcl-2 c-myc, cần thiết cho tế bào B in vitro EBNA2 không gắn trực tiếp với ADN, tác động thông qua protein in khác RBP-JK), PU1 protein khác tế bào 1.3.4.3 Gia đình EBNA3 ( EBNA3A, 3B 3C) Các gen gia đình EBNA3 bao gồm EBNA3A, 3B 3C nằm gen EBV, có cấu trúc exon-intron tương tự có trọng lượng phân tử từ 140-180 kDa Các chuỗi acid amin EBNA3A, 3B 3C EBV typ I II có giống 84%, 80% 72% cách tương ứng Các protein hoạt động có chức phiên mã tương tác với protein RBP-JK Robertson ES 1.3.4.4 EBNA-LP Các protein EBNA dẫn đầu EBNA-LP có kích thước khác từ 20130 kDa, kết hoạt động promoter Wp Cùng với EBNA2, EBNALP protein biểu lộ sau nhiễm EBV vào tế bào lympho B in vitro 1.3.4.5 LMP1 Protein LMP1 phiên mã từ vùng BNLF1 nằm gần cuối đầu 3' gen EBV có trọng lượng khoảng 60-66kD, tùy thuộc vào chủng virus [104, 105] Ở chủng EBV tế bào dịng B95-8, protein có 386 axit amin chia thành ba vùng,(i) vùng đầu N gồm 24 axit amin, (ii) sáu vùng xuyên màng kỵ nước kết nối ba vịng bên ngồi hai vịng nội bào(iii) vùng đầu C có 200 axít amin bao gồm hai lĩnh vực chức quan trọng Hennessy, Fennewald, Hummel, Cole and Kieff gọi vùng hoạt hóa CTAR1 (C-Terminal Activation Region 1: aa194-232) CTAR2 ( aa 351-386) LMP1 tham gia ba chức chuyển dạng, di chống lại chết theo chương trình LMP1 coi sản phẩm gen sinh ung thư làm chuyển dạng nguyên bào sợi động vật gặm nhấm Biểu LMP1 tác động ảnh hưởng đáng kể đến tăng trưởng tế bào biểu mơ, ức chế biệt hóa chúng, gây biến đổi hình thái số dịng tế bào biểu mô , làm tăng biểu yếu tố tăng trưởng biểu bì EGFR Miller WE 1.3.4 LMP2A/2B LMP2 mã hóa chỗ ghép nối hình thành dạng vịng EBV [119] LMP2 có hai loại LMP2A LMP2B, khác LMP2A có thêm đoạn 119 acid amin đầu N tận cịn LMP2 khơng có Mặc dù chưa biết chức cụ thể LMP2B, việc biểu lộ nhiều cho thấy đóng vai trị quan trọng sinh học EBV Trong chức LMP2A xác định tế bào B Tuy nhiên, protein biểu lộ tỷ lệ thấp khối u vòm họng 1.4 Yếu tố ngoại di truyền Ngoại di truyền nghiên cứu chế làm không biểu lộ gen mà khơng liên quan đến thay đổi trình tự nucleotid gen Những biến đổi ngoại di truyền di truyền từ hệ tế bào sang tế bào khác Khi nói đến ngoại di truyền người ta thường nhấn mạnh yếu tố là: methyl hóa ADN, sửa chữa histon nucleosom Các thay đổi độc lập với methyl hóa xảy mức độ ADN yếu tố lại diễn mức độ protein 1.4.1 Methyl hóa ADN điều hịa biểu lộ gen Methyl hóa ADN kiện diễn gốc CH3 liên kết đồng hóa trị với vị trí cacbon số Cytosin nằm vị trí hai nucleotid CytosinGuanin viết tắt CpG (p liên kết phosphodieste) Khi CpG tập hợp nhiều khoảng 200bp ví trí gen có GC chiếm 50% người ta gọi đảo CpG Khoảng 10-15% CpG động vật có vú nằm vùng ung thư vịm mũi họng, đồng thời ứng dụng cho nhiều gen khác bệnh lý khác Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Thời gian địa điểm nghiên cứu -Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/2011 đến tháng 10/2011 - Mẫu thu thập Bệnh viện K Hà Nội - Các kỹ thuật phân tử tiến hành Phòng thí nghiệm Bộ mơn Miễn dịch - Sinh lý bệnh Labo Y sinh , Trường Đại học Y Hà nội 2.2 Đối tượng nghiên cứu 2.2.1 Tế bào dòng Các nguyên liệu tế bào dòng B95-8, Namalwa, Raji tài trợ Labo nghiên cứu ung thư vòm mũi họng, MTC, Viện Karolinska, Stockholm, Thụy điển 2.2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân - Bệnh nhân mới, chẩn đốn xác định từ mơ sinh thiết lấy từ khối u vịm họng UTVMH thể khơng biệt hóa (UCNT) - Những mô sinh thiết tươi mô sinh thiết đúc farafin bệnh nhân chẩn đoán UTVMH thể khơng biệt hóa 2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ - Các thể mơ bệnh học khác ngồi UCNT - Bệnh nhân tái phát đến khám định kỳ 2.3 Phương pháp tiêu nghiên cứu: 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu: - Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang - Trình tự kỹ thuật cần thực hiện: + Thiết kế mồi + Chiết tách kiểm tra chất lượng:ADN, ARN, Protein + Xử lý ADN Bisulfite + Chạy kỹ thuật PCR đơn mồi + Chạy kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu 2.3.2 Biến số số nghiên cứu: - Các số nghiên cứu PCR đơn mồi đa mồi đặc hiệu methyl hóa nghiên cứu bao gồm thơng số nồng độ mồi, nhiệt độ gắn mồi, Nồng độ Mg++, lượng DNA làm khuôn mẫu - Các biến số nghiên cứu mẫu sinh thiết bệnh nhân mức độ methyl hóa hay khơng methyl hóa promoter EBNA1 2.3.3 Phương pháp thu thập thông tin - Quan sát ghi kết nghiên cứu thực nghiệm - Hồi cứu thông tin từ hồ sơ bệnh án điền phiếu theo mẫu (phụ lục kèm theo) 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Xử lý số liệu phần mềm chương trình SPSS 15.0 với test thống kê thích hợp y học 2.5 Sơ đồ nghiên cứu Mẫu PCR đơn mồi ADN ARN Bisulfite cDNA PCR đa mồi Protein WB RT-PCR Điện di, nhuộm sản phẩm PCR chụp ảnh Thu thập thông tin xử lý số liệu CHƯƠNG DỰ KIẾN KẾT QUẢ 3.1 Dự kiến kết cho mục tiêu 1: Sáu bảng kết thông số nồng độ mồi, DNA khuôn mẫu, Nồng độ Mg++, Nhiệt độ gắn mồi Các ảnh minh họa kèm theo 3.1.1 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng PCR đơn mồi nồng độ (N) mồi khác nhau: Bảng 3.1.1 (+/-) % Nồng độ mồi (NoA) NoA1 NoA2 NoA3 NoA4 NoA5 NoA6 (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) Promotor Wp Cp Qp Biểu đồ 3.1.1 Nhận xét: 3.1.2 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng PCR đơn mồi nồng độ ADN (N ‘)khác nhau: Bảng 3.1.2 (+/-) % Nồng độ ADN (NoB) NoB1 N0B2 NoB3 NoB4 NoB5 NoB6 (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) Promotor Wp Cp Qp Biểu đồ 3.1.2 Nhận xét: 3.1.3 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng PCR đơn mồi nồng độ Mg ++ (NC)khác nhau: Bảng 3.1.3 Nồng độMg ++ (NoC) (+/-) % NoC1 NoC2 NoC3 NoC NoC5 NoC6 (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) Promotor Wp Cp Qp Biểu đồ 3.1.3 Nhận xét3.1.4 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu nồng độ (NA) mồi khác nhau: Bảng 3.1.4 (+/-) % Nồng độ mồi (NA) NA1 NA2 NA3 NA4 NA5 NA6 (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) Promotor Wp Cp Qp Biểu đồ 3.1.4 Nhận xét: 3.1.5 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi nồng độ ADN (NB)khác nhau: Bảng 3.1.5 (+/-) % Nồng độ ADN (NB) NB1 NB2 NB3 NB4 NB5 NB6 (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) Promotor Wp Cp Qp Biểu đồ 3.1.5 Nhận xét 3.1.6 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng PCR đơn mồi nồng độ Mg ++ (NC) khác nhau: Bảng 3.1.6 ... ngoại di truyền mức độ ADN EBV mà nhiều gen khác liên quan đến ung thư, đặc biệt gen ức chế ung thư Đề tài nhằm mục đích sau: Phát triển phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa xác định mức độ methyl... triển UTVMH tương quan với nồng độ IgA/VCA 1.2.2 Mơi trường sống thói quen sinh hoạt Nhiều tác giả đề cập đến môi trường sống khí hậu, bụi, khói nhiễm liên quan đến UTVMH, nói đến nhiều tập quán