VÒNG HÓA TẠO GAMMA CYCLODEXTRIN Ở TRẠNG THÁI PHỨC VỚI METYLETYL XETON VÀ 1 NAPTHOL TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CÁC TRƢỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT SỐ 74 2009 97 VÒNG HÓA TẠO GAMMA CYCLODEXTRIN Ở TRẠNG THÁ[.]
TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ CÁC TRƢỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT SỐ 74 - 2009 VỊNG HĨA TẠO GAMMA CYCLODEXTRIN Ở TRẠNG THÁI PHỨC VỚI METYLETYL XETON VÀ 1-NAPTHOL GAMMA CYCLODEXTRIN PRODUCTION USING SOLVENT-COMPLEXING AGENTS (METHYETHYL KETONE AND 1-NAPHTHOL) Phạm Thu Thủy, Nguyễn Lan Hương, Đào Thị Thanh Thủy Trường Đại học Bách khoa Hà Nội TÓM TẮT Cyclodextrin (CDs) có cấu trúc vịng gồm 6, 7, đơn vị glucoza phân tử, α, β, γ-CD Do cấu trúc hình nón cụt nên CDs có khả tạo phức với nhiều hợp chất hữu cơ, làm thay đổi đặc tính hóa lý khách thể Vì vây, CDs có nhiều ứng dụng quan trọng cơng nghiệp thực phẩm mỹ phẩm Gamma-cyclodextrin (γ–CD) CDs ứng dụng rộng rãi, có kích thước vòng lớn, hòa tan tốt nước linh hoạt sinh học CDs khác γ–CD tổng hợp từ dịch thủy phân tinh bột dạng tự do, mà cịn vịng hóa tác nhân tạo phức Các tác giả nghiên cứu điều kiện vịng hóa tạo γ–CD trạng thái phức với metyletyl xeton (MEX) 1-napthol Phương pháp bề mặt đáp ứng với bố trí thí nghiệm kiểu tâm xoay đối xứng sử dụng nhằm tối ưu điều kiện vịng hóa Các biến thay đổi là: nồng độ enzym, thời gian vịng hóa tự do, nhiệt độ tỷ lệ phức sử dụng vịng hóa tạo phức Phân tích thống kê cho thấy, tỷ lệ chất tạo phức có ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất tạo γ–CD Điều o kiện tối ưu cho trình vịng hóa: nồng độ enzym (2%), thời gian (30 phút), nhiệt độ (55 C) tỷ lệ chất tạo phức(30%) Hiệu suất tạo phức γ–CD đạt 66,4 ± 1,57% theo mơ hình tối ưu, 64,6% thực nghiệm ABSTRACT Cyclodextrins (CDs) are closed-ring structure containing six, seven or eight glucose units, and known as α, β, and γ-CD, respectively Due to their caverned structure, CDs can easily form inclusion complexes with many organic substances which can change the physicochemical properties of the guest molecule This property makes CDs become increasingly important in the food and pharmaceutical industries Gamma-cyclodextrin (γ–CD) is the most widely used because of its larger cavity, higher water solubility, and more bioavailability than other cyclodextrins A process for producing γ–CD from starch hydrolysate solution with cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) and presence of methyethylketone and 1-naphthol was studied Response surface methodology and central composite rotary design was employed to optimize γ–CD production from liquefied starch using solvent-complexing agents The four variables involved in this study were: amount of CGTase, reaction time, temperature and amount of solvent-complexing agents The statistical analysis of the results showed that the amount of solvent-complexing agents had a significant effect on γ–CD productivity The optimized conditions were found to be comprised of: amount of CGTase (2%), o reaction time (30 min), temperature (55 C), and amount of solvent-complexing agents (30%) The yield of γ–CD complex was obtained 66.4±1.57% by model, and 64.6% by experiment nhờ đặc tính quan trọng này, CDs có nhiều ứng dụng to lớn ngành công nghiệp Đồng thời, nhờ vào khả tạo phức mà trình tổng hợp tách CDs dễ dàng nhờ kết hợp đặc hiệu với chất khác Quá trình tổng hợp γ-CD thường sử dụng hai tác nhân tạo phức Dịch tinh bột sau xử lý enzym vịng hóa bổ sung đồng thời hai tác nhân tạo phức Tác nhân xeton béo (aliphatic ketone) rượu béo (aliphatic alcohol) tác nhân thứ hai hợp I MỞ ĐẦU Cyclodextrins (CDs) tạo phức với nhiều hợp chất khác bao gồm hợp chất béo, aldehyt, axit hữu cơ, chất thơm, chất khí, hợp chất phân cực halogen, oxit axit amin Đây tượng chất “khách thể” bị giữ, bị bao bọc lỗ hang phân tử chủ thể CDs Phức bao CDs làm thay đổi đặc tính hóa lý chất khách thể, từ thay đổi ta sử dụng chất khách thể vai trị hữu ích Chính 97 TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ CÁC TRƢỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT SỐ 74 - 2009 chất vòng chứa 12 nguyên tử cacbon [4] Nhiều nghiên cứu rằng, bổ sung chất tạo phức với γ-CD q trình vịng hóa giảm nồng độ γ-CD tự có dung dịch, phản ứng vịng hóa ưu tiên tạo γ-CD Seres cộng (1989) bổ sung chất tạo phức sau thời gian vịng hóa 50 phút, kết hợp tác nhân phức MEX 2,4-dimetyl phenol (2,4-DMP), MEX 2,6-DMP, MEX 1-naphtol, MEX 2-naphtol với tỷ lệ chúng 1:1 khối lượng lượng, tổng khối lượng phức chiếm 10% so với chất tinh bột Kết cho thấy cặp phức cho hiệu suất cao cặp phức MEX 1-naphtol, hiệu suất thực tế 35% phức γ-CD thơ tính theo khối lượng nguyên liệu [3] Trong nghiên cứu tối ưu điều kiện vịng hóa tạo γ-CD trạng thái phức với mong muốn nâng cao hiệu suất tạo γ-CD Dịch tinh bột sắn thủy phân Giai đoạn tạo γ-CD tự pH = 7,5; T = 65oC Nồng độ enzym:1-2% Giai đoạn tạo phức vòng γ-CD pH = 7,5; T = 35-55oC Tỷ lệ MEX:1-naphtol (1:1) = 10-30% tinh bột Khuấy 300 vịng/phút Vơ hoạt enzym, gạn lọc kết tủa, sấy khơ Cân lƣợng phức vịng γ-CD II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình1 Sơ đồ q trình vịng hóa tạo γ-CD trạng thái phức 2.1 Nguyên vật liệu - Tinh bột sắn: sử dụng tinh bột sắn tỉnh Tây Ninh [1] - Phương pháp quy hoạch thực nghiệm: Bốn yếu tố lựa chọn để xây dựng mơ hình tối ưu cho hiệu suất tạo phức γ-CD hỗn hợp chất tạo phức MEX 1-napthol cao yếu tố có ảnh hưởng mạnh đến khả vịng hóa tạo γCD: nồng độ enzym, thời gian vịng hóa tạo γCD tự do, nhiệt độ vịng hóa với hỗn hợp chất tạo phức, tỷ lệ hỗn hợp chất tạo phức so với khối lượng nguyên liệu Thí nghiệm bố trí theo ma trận trình bày bảng Kết xử lý chương trình Design-Expert 7.1 (Stat-Ease, USA) [2] - Chế phẩm TORUZYM 3.0L (3KNU/g) dạng lỏng, hãng Novo (Đan Mạch) cung cấp -Các hóa chất phân tích: α-, β-, γ-cyclodextrin chuẩn (Sigma-Aldrich); thuốc thử Bromocresol Green (BCG, Trung quốc) - Hóa chất: MEX, 1-naphtol (Trung quốc) 2.2 Phƣơng pháp phân tích Hiệu suất tạo phức γ-CD tính lượng phức γ-CD nhận sau sấy khô khối lượng tinh bột sắn sử dụng Bảng Thí nghiệm tiến hành kết 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu TT - 100 ml dịch tinh bột thủy phân nhận các điều kiện sau: nồng độ tinh bột: 10g; CaCl2 0.3mg; enzym Toruzym: 0,2 ml; pH: 6,0; nhiệt độ dịch hóa: 80oC; thời gian dịch hóa: 40 phút Sau dịch hóa, vơ hoạt enzym 120oC thời gian 10 phút [1] 10 - Q trình tạo phức vịng γ-CD thực theo sơ đồ hình 98 Nồng độ enzym (%) 2,0 1,0 2,0 2,0 1,5 1,5 1,5 1,5 0,5 1,0 Thời gian (phút) Nhiê ̣t đô ̣ (oC) Tỷ lệ phức (%) Hiê ̣u suấ t (%) 30 30 30 80 55 55 55 55 30 55 35 35 55 25 45 45 65 45 55 10 30 10 10 20 20 20 20 10 30,0 59,6 33,8 32,0 47,0 54,2 0,0 41,0 55,8 31,8 TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CÁC TRƢỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT SỐ 74 - 2009 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Thời gian (phút) Nhiê ̣t đô ̣ (oC) Tỷ lệ phức (%) Hiê ̣u suấ t (%) 80 30 55 55 105 55 80 30 80 80 55 80 55 80 30 55 30 80 55 55 55 55 45 45 45 45 35 35 35 55 45 55 45 35 55 45 35 35 45 45 10 30 20 20 20 20 10 10 30 30 20 30 40 10 30 20 30 30 20 20 33,0 64,6 56,8 56,8 55,0 56,8 43,6 31,0 42,6 64,8 62,3 64,0 53,4 30,4 62,6 56,8 64,4 53,0 56,8 56,8 Kết quan sát cho thấy có γ-CD tạo phức với MEX+1-naphtol, cịn -, β-CD glucoza khơng có tượng tạo phức điều kiện vịng hóa Như lượng phức nhận thực nghiệm phức vòng γ-CD, kết phù hợp với nghiên cứu Seres cộng [3] 3.2 Thời điểm bổ sung hỗn hợp chất tạo phức Nghiên cứu lựa chọn thời điểm bổ sung hỗn hợp chất tạo phức cho hiệu suất tạo phức vòng γ-CD cao bổ sung hỗn hợp chất tạo phức (10% so với tinh bột) sau tiến hành vịng hóa tạo γ-CD tự 30, 50, 80 phút [3], q trình tạo phức vịng γ-CD tiến hành 36 Hieu suat tao phuc vong gamma-CD(%) TT Nồng độ enzym (%) 1,0 2,0 1,5 1,5 1,5 1,5 1,0 1,0 2,0 2,0 2,5 1,0 1,5 2,0 1,0 1,5 2,0 1,0 1,5 1,5 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khả tạo phức MEX + 1-naphtol với CDs glucoza 45 40 35 30 25 20 15 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Thoi diem bo sung hon hop chat tao phuc (phut) Để nghiên cứu khả tạo phức hỗn hợp MEX 1-naphtol với thành phần dịch tinh bột thủy phân đưa vào q trình vịng hóa, chúng tơi tiến hành cho -, β-, γ-CD chuẩn glucoza tinh khiết (0,05g) vào 50 ml nước cất, nâng nhiệt độ dịch lên 40°C bổ sung 4% chất tạo phức Lắc 24 Quan sát kết thu (bảng 2) Hình Ảnh hưởng thời điểm bổ sung hỗn hợp chất tạo phức đến hiệu suất tạo phức vòng γ-CD Hình cho thấy bổ sung hỗn hợp chất tạo phức sau 50 phút hiệu suất tăng lên 1,08 lần so với bổ sung phức sau 30 phút, sau 80 phút hiệu suất tăng 1,19 lần so với 50 phút Như thời điểm bổ sung hỗn hợp chất tạo phức có ảnh hưởng đến hiệu suất tạo phức vòng γ-CD Bảng Khả tạo phức MEX +1naphtol với CDs glucoza 3.3 Thời gian tạo phức vòng Mẫu Khả tạo phức với MEX + 1-naphtol α-CD Không tạo phức β-CD Không tạo phức γ-CD Tạo phức màu trắng đục, kết tủa lắng từ từ xuống đáy Glucoza Không tạo phức Để xác định thời gian tạo phức vịng γCD triệt để chúng tơi tiến hành bổ sung hỗn hợp chất tạo phức (10%) sau 50 phút vịng hóa tự do, thay đổi thời gian tạo phức vòng từ 12 đến 72 (hình 3) Kết cho thấy hiệu suất tạo phức vòng tối đa 36 99 Hieu suat tao phuc vong gamma-CD (%) TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CÁC TRƢỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT SỐ 74 - 2009 độ enzym (1-2%) nhiệt độ tạo phức vòng (35-55oC) 35 30 3.5 Tối ƣu điều kiện vịng hóa tạo γ-CD 25 Hiệu suất tạo γ-CD thay đổi yếu tố ảnh hưởng trình bày bảng cho thấy hiệu suất đạt từ 0% đến 64,8% Phức vịng γ-CD khơng tạo thành ta không sử dụng hỗn hợp chất tạo phức q trình vịng hóa, hỗn hợp chất tạo phức có ảnh hưởng trội đến hiệu suất tạo γ-CD q trình vịng hóa Tuy nhiên để xem xét cách tổng thể cần phải tính đến hệ số hồi quy bề mặt đáp ứng phương trình hồi quy 20 15 10 0 12 24 36 48 60 Thoi gian tao phuc vong (h) 72 Hình Ảnh hưởng thời gian tạo phức vòng đến hiệu suất tạo phức vòng γ-CD Bảng Kết phân tích hồi quy 3.4 Tỷ lệ hỗn hợp chất tạo phức Hieu suat tao phuc vong gamma-CD (%) Tiến hành bổ sung hỗn hợp chất tạo phức (MEX+1-naphtol) sau 50 phút vịng hóa tự do, tỷ lệ hỗn hợp chất tạo phức tăng từ 8% đến 30% so với tinh bột, giữ thời gian tạo phức vịng 36h Kết hình cho thấy, tỷ lệ hỗn hợp chất tạo phức tăng hiệu suất tạo phức vòng tăng 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 Phương sai Chuẩn F Mô hình A-Nồng độ E B-Thời gian C-Nhiệt độ D-Tỷ lệ phức AB AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2 452,51 0,38 6,83 6,41 4181,76 62,41 16,00 6,76 36,00 96,04 146,41 9,94 7,15 273,96 1536,86 29,07 0,024 0,44 0,41 268,65 4,01 1,03 0,43 2,31 6,17 9,41 0,64 0,46 17,60 98,73 Mức có nghĩa (p>F) < 0,0001 0,8787 0,5179 0,5308 < 0,0001 0,0637 0,3267 0,5199 0,1491 0,0253 0,0078 0,4366 0,5084 0,0008 < 0,0001 Mức có nghĩa thống kê mơ hình dựa vào chuẩn F phân tích ANOVA, theo kết thu bảng cho thấy, mức độ tin cậy mơ hình 99% hay mức có nghĩa p