BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH : CHẨN ĐOÁN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN HỌC CỦA SRI LANKA MOSAIC VIRUS GÂY BỆNH KHẢM LÁ CÂY SẮN

NTTU-NCKH-04 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2019 Tên đề tài: CHẨN ĐOÁN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN HỌC CỦA SRI LANKA MOSAIC VIRUS GÂY BỆNH KHẢM LÁ CÂY SẮN Số hợp đồng: 2019.01.73/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thanh Việt Đơn vị công tác: Viện Kỹ Thuật Công Nghệ Cao NTT Thời gian thực hiện: 06 tháng (05-12/2019) TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 11 năm 2019 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc - Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2019 Tên đề tài: CHẨN ĐOÁN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN HỌC CỦA SRI LANKA MOSAIC VIRUS GÂY BỆNH KHẢM LÁ CÂY SẮN Số hợp đồng: 2019.01.73/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thanh Việt Đơn vị công tác: Viện Kỹ Thuật Công Nghệ Cao NTT Thời gian thực hiện: 06 tháng (05-12/2019) TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 11 năm 2019 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 Giới thiệu chung Sri Lanka mosaic virus…………………………………………………….2 1.1.1 Lịch sử virus khảm sắn………………………………………………………………………… 1.1.2 Phân loại………………………………………………………………………………………………….2 1.1.3 Genome………………………………………………………………………………………………… 1.1.4 Sự chép Geminivirus…………………………………………………………………… 1.1.5 Chu trình lây nhiễm………………………………………………………………………………… 1.1.6 Đặc điểm triệu chứng bệnh khảm virus hại sắn………………………………………… 1.1.6.1 Triệu chứng………………………………………………………………………………………… 1.1.6.2 Trung gian truyền bệnh……………………………………………………………………………6 1.2 Cây sắn (cassava) 1.2.1 Đặc điểm 1.2.2 Tình hình nhiễm bệnh khảm virus hại sắn Việt Nam 1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh khảm virus hại sắn 1.3.1 Các nghiên cứu giới 1.3.2 Các nghiên cứu nước 11 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nơi thực 12 2.2 Nội dung nghiên cứu 12 2.3 Đối tượng nghiên cứu 12 2.4 Chẩn đốn phịng thí nghiệm 12 2.4.1 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) .12 2.4.1.1 Thu mẫu 12 2.4.1.2 Tách chiết DNA 12 2.4.1.3 Chuẩn bị mồi tiến hành phản ứng PCR 14 2.4.1.4 PCR genome 15 2.4.2 Giải trình tự 16 2.4.3 Phân tích nucleotide, amino acid, phả hệ 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 3.1 Thu Mẫu 17 3.2 Tách chiết DNA 18 3.3 Phản ứng PCR phát SLCMV mẫu bệnh phẩm 18 3.4 Phản ứng PCR với genome hoàn chỉnh SLCMV 19 3.5 Giải trình tự gene xây dựng phát sinh loài 20 3.6 Kết so sánh mức độ tương đồng 32 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT SLMV: Virus khảm Sri Lanka (Sri Lanka mosaic virus) CMD : Bệnh khảm sắn (Cassava mosaic disease) SLCMV: Virus khảm sắn Sri Lanka (Sri Lanka cassava mosaic virus) ACMV : Virus khảm sắn Châu Phi (Affica cassava mosaic virus) EACMV : Virus khảm sắn Đông Phi (East Affica cassava mosaic virus) ICMV: Virus khảm sắn Ấn Độ (India cassava mosaic virus) PCR: Phản ứng khuếch đại gene (The Polymearase chain reaction) ssDNA: Sợi đơn DNA (Single strand DNA) dsDNA: Sợi đôi DNA (Double strand DNA) CR: Vùng dùng chung (common region) CP: Protein vỏ (Coat protein) MP: Protein chuyển động (Moverment protein) Rep: Protein khởi động nhân lên (Replication initiation protein) TrAP: Protein hoạt hóa phiên mã (Transcription activator protein) ORF: Khung đọc mở (Open reading frame) REn: Protein kéo dài nhân lên (Replication enancer protein) NSP : Nuclear shuttle protein FAO: Tổ chức Nông Lương Liên hiệp quốc (Food and Agriculture Organization) PLS1: Đệm ly giải thực vật (Plant lysis buffer 1) PLS2: Đệm ly giải thực vật (Plant lysis buffer 2) PBB: Đệm gắn DNA thực vật lên cột (Plant binding buffer) PWB: Đệm rửa giải (Plant wash buffer) EB: Đệm ly trích (Elution buffer) NCBI: Nation center for Biotechnology information DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Genome Begomovirus…………………………………………………………………….4 Hình 0.1 Bệnh tích bệnh khảm sắn………………………………………………… Hình 0.2 Bemisia tabaci……………………………………………………………… .7 Hình 0.3 Cây sắn……………………………………………………………………… Hình 0.4 Hình ảnh bệnh tích khảm sắn SLCMV…………………………………………….17 Hình 0.5 DNA tổng số sản phẩm sau tách chiết…………………………………………….18 Hình 0.6 Sản phẩm PCR phát SLCMV mẫu bệnh phẩm………………… 18 Hình 0.7 Kết PCR full genome A………………………………………………………………… 19 Hình 0.8 Kết PCR full genome B………………………………………………………………… 20 Hình 0.6 Cây phả hệ genome A B………………………………………………… 21 Hình 0.7 Cây phả hệ gene AV1………………………………………………………………………… 23 Hình 0.8 Cây phả hệ gene AV2………………………………………………………………………… 24 Hình 0.9 Cây phả hệ gene AC1………………………………………………………………………… 25 Hình 0.109 Cây phả hệ gene AC2…………………………………………………………………………26 Hình 0.11 Cây phả hệ gene AC3…………………………………………………………………………27 Hình 0.12 Cây phả hệ gene AC4…………………………………………………………………………28 Hình 13 Cây phả hệ gene BV1……………………………………………………………………… 29 Hình 0.14 Cây phả hệ gene BC1…………………………………………………………………………30 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng 0.1 Các thành phần phản ứng PCR………………………………………………………4 Bảng 0.2 Chu kì nhiệt phản ứng PCR…………………………………………………………14 Bảng 0.3 Mồi PCR full genome A………………………………………………… 15 Bảng 0.4 Mồi PCR full genome B……………………………………………………………………15 Bảng 0.1 Kết thu nhận mẫu……………………………………………………………………….17 Bảng 0.2 Kích thước sản phẩm PCR full genome A………………………………… 19 Bảng 0.3 Kích thước sản phẩm PCR full genome B………………………………… 19 Bảng 0.4 Mức độ tương đồng nucleotide (amino acid) chủng SLCMVs nghiên cứu chủng tham chiếu………………………………………………………………………31 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Sản phẩm thực đạt Sản phẩn đăng ký thuyết minh  Báo cáo tổng hợp kết đề tài  Báo cáo tổng hợp kết đề tài  Bài báo khoa học gửi đăng tạp chí  Bài báo khoa học đăng tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Đh Nguyễn khoa học chuyên ngành Tất Thành (phụ lục)  Đã đào tạo sinh viên Trần Kiên Cường, Khoa CNSH thực KLTN với nội dung tương đương bảo vệ thành công KLTN Hội đồng (phụ lục) Sản phẩm khác:  Bài tóm tắt tham gia Hội Nghị Cơng Nghệ Sinh Học Toàn Quốc Năm 2019 (phụ lục) Thời gian đăng ký: 06 tháng (05-12/2019) Thời gian nộp báo cáo: 25/11/2019  Đào tạo 01 sinh viên chuyên ngành CNSH MỞ ĐẦU Thống kê lương thực chủ yếu vùng khí hậu nhiệt đới bao gồm lúa, ngô, khoai, sắn đậu tương Sản lượng giá trị kinh tế trồng mang lại to lớn sống an ninh lương thực người Cây sắn hay cịn gọi khoai mì thuộc loại lấy củ dễ sinh trưởng, trồng trăm nước nguồn thực phẩm cho năm trăm triệu người, đem lại nguồn nhiên liệu quan trọng sản xuất xăng sinh học, chất phụ gia thực phẩm Tuy nhiên, năm gần có nhiều báo cáo nhiều nước khác bệnh sắn hay gọi bệnh khảm sắn Sri Lanka Mosaic Virus (SLMV), gây qua trung gian truyền bệnh chủ yếu bọ phấn trắng (Bemisia tabaci) có nguy lây lan thành dịch quy mô lớn khiến thiệt hại cho lương thực nói chung cho ngành canh tác sắn nói riêng SLMV gây bệnh tích nhiều loại trồng khác nhau, thiệt hại nặng suất chí hư hại hồn tồn Cuối năm 2017 nước ta có tỉnh bao gồm Tây Ninh, Bình Dương, Bà Rịa – Vũng Tàu Đồng Nai báo cáo tình hình nhiễm bệnh khảm sắn với diện tích 29.160 ha, bệnh khảm sắn lan rộng, gây thiệt hại 90 % diện tích trồng sắn Tây Ninh có nguy lan mạnh sang tỉnh lân cận khác Mặc dù có nhiều nước cơng bố tình trạng báo cáo SLCMV, Việt Nam đặc thù khí hậu có phần khác biệt, bệnh lại xuất cách không lâu nên am hiểu nghiên cứu nước cịn ít, chưa có thống kê cụ thể trạng xác việc đoán trước xu hướng phát triển trở thành dịch bệnh quy mô lớn lây lan khó khăn việc kiểm sốt phịng trừ lây lan thiệt hại Xuất phát từ lý trên, đề xuất thực đề tài: “Chẩn đoán xác định đặc điểm di truyền học Sri Lanka Mosaic Virus gây bệnh khảm sắn.” CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Sri Lanka mosaic virus 1.1.1 Lịch sử virus khảm sắn Virus khảm sắn phân chia thành nhiều chủng khác dựa vào đặc tính biến chủng phân bố theo vùng địa lý gồm có virus khảm sắn Châu Phi (Affica cassava mosaic virus, ACMV), virus khảm sắn Đông Phi (East Affica cassava mosaic virus, EACMV), virus khảm sắn Ấn Độ (India cassava mosaic virus, ICMV) Sri Lanka cassava mosaic virus (SLCMV) Báo cáo bệnh khảm sắn bắt nguồn từ Đơng Phi năm 1894, kể từ dịch bệnh xảy khắp lục địa Châu Phi gây thiệt hại kinh tế lớn dẫn đến tình trạng khủng hoảng lương thực nghiêm trọng Năm 1971, dịng sắn có khả kháng virus nghiên cứu thành công sử dụng Viện Nông nghiệp Nhiệt đới Quốc tế Nigeria kiểm soát hiệu dịch bệnh nhiều năm Tuy nhiên, vào cuối kỷ 20 xuất loại virus tái tổ hợp chủng EACMV – UG mạnh bùng phát Uganda nhanh chóng lan sang Đơng Trung Phi Năm 1942, virus khảm sắn phát Ấn Độ, tỷ lệ dịch bệnh bùng phát cao Tamil Nadu Kerala Tùy thuộc vào giống thời gian năm mà tổn thất suất củ thay đổi từ khơng đáng kể lên đến 84 % 1.1.2 Phân loại Sri Lanka Cassava Mosaic Virus (SLCMV) virus thuộc vùng Sri Lanka đảo thuộc Ấn Độ, nằm Gemirividae (được chia làm bốn chi: Mastrevirus, Curtovirus, Topocuvirus Begomovivus) họ virus lớn gây bệnh thực vật thuộc chi Begomovirus chứa vật chất di truyền sợi đơn DNA (single strand, ssDNA), nhóm virus có phạm vi vật chủ rộng, thường gây bệnh cho hai mầm [1] 1.1.3 Genome Virus Sri Lanka Cassava Mosaic Virus (SLCMV) có gene vịng đơn DNA khép kín (ssDNA) lưỡng cực chia làm hai phân đoạn DNA – A DNA – B Trong phân đoạn DNA – A chịu trách nhiệm mã hóa proteins liên quan đến nhân lên đóng gói DNA hạt virus tế bào vật chủ chúng xâm nhiễm vào, bên cạnh cịn tham gia vào việc kiểm soát biểu gene Còn phân đoạn DNA – PHỤ LỤC Chủng tham chiếu DNA-B STT Tên chủng Mã số SLCMV-VTN6 LC312130 SLCMV-HN7 MH891841 SLCMV-SLCMV-B Cambodia KT861469 SLCMV-Erode 2011 KU550962 SLCMV-Erode 2014 KF898350 SLCMV-Attur KP455485 SLCMV-Adivaram AJ579308 SLCMV-TVM3 KP455487 SLCMV-Malappuram KR611578 10 SLCMV-TVM1 KR611580 11 SLCMV-pLS4 2015 AJ314738 12 SLCMV-pLS4 2018 NC_003862 13 ICMV-pICM15 AJ314740 14 ICMV-India AJ512823 15 ICMV-Muvattupuzzha AJ575820 16 SACMV-South Affica 2001 AF155807 17 SACMV-South Affica 2018 NC_003804 18 SACMV-Madagasca KJ887749 19 EACMV-ca055 FN668380 20 EACMV-K35FB-19 AJ704934 21 EACMV-K72FB-45 AJ704974 22 ACMV-AP3 AJ427911 23 ACMV-CM-KT AY211886 24 ACMV-Cameroon AF112353 25 TGMV K02030 42 PHỤ LỤC 5: DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 1- Danh mục báo, báo cáo khoa học tác giả liên quan đến đề tài (đính kèm báo, báo cáo) + Báo cáo khoa học: Cuốn báo cáo tổng hợp kết đề tài Bài báo chấp nhận đăng Tạp chí Khoa học Cơng nghệ - Đại học Nguyễn Tất Thành 2- Quyết định liên quan đến hướng dẫn sinh viên làm luận văn (nếu có) 43 Phụ lục 5.1 Bài báo gửi đăng tạp chí Khoa học Công nghệ, Đh Nguyễn Tất Thành Phiếu đăng kí nộp TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH Ban Biên tập Tạp chí “Khoa học Cơng nghệ” PHIẾU ĐĂNG KÍ NỘP BÀI Tạp chí KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Tên báo: Loại thảo (chọn phần sau) x Kết nghiên cứu Thông tin, chuyên đề Bài viết tổng luận Tên địa liên lạc tác giả chịu trách nhiệm Nguyễn Thanh Việt Thân Văn Thái, Viện Kỹ thuật Công nghệ cao, Đh Nguyễn Tất Thành Số điện thoại: 0975716090 Email: tvthai@ntt.edu.vn ntviet@ntt.edu.vn Tác giả trao cho Nhà trường quyền xuất bản, tái bản, công bố, phổ biến in điện tử báo Bằng việc kí vào phiếu này, tác giả khẳng định rằng: i) Tôi (chúng tôi) tác giả (đồng tác giả) thảo ii) Tôi nhận đồng ý tác giả đứng tên báo kí đại diện iii) Những tài liệu cơng bố (hình, bảng) có liên quan đến nội dung báo nhận cho phép iv) Bản thảo chưa đăng thời chưa gửi đăng tạp chí khác Tơi đảm bảo rằng: khơng gửi đăng công bố thảo tạp chí khác Ban Biên tập gửi thư cho biết định thảo không chấp nhận, trừ trường hợp hai bên có thoả thuận khác v) Bất kỳ tổ chức cá nhân có liên quan (tham gia tài trợ cho nghiên cứu) xác định lời cảm ơn thảo vi) Bản thảo chuẩn bị theo quy định cuả Tạp chí Bản thảo sửa chữa lần cuối coi gốc, thay đổi gốc và/ gửi lại gốc không hẹn, thời gian công bố báo bị chậm lại Đồng ý (hay không đồng ý) cho cơng bố tồn văn viết website Tạp chí “Khoa học Công nghệ”, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành sau in Tp Hồ Chí Minh, ngày 06 tháng năm 2019 Tác giả (kí ghi rõ họ tên) Thân Văn Thái Ghi chú: Tác giả điền đầy đủ thông tin vào phiếu gửi trực tiếp đến Ban Biên tập Tạp chí theo đường bưu điện theo email (tapchikhcn@ntt.edu.vn) fax (028 3940 4759) Nếu thảo không chấp nhận xuất bản, Phiếu đăng kí khơng có giá trị 44 Bài báo gửi đăng Tạp chí Khoa học Công nghệ, Đh Nguyễn Tất Thành Xác định đặc điểm di truyền học Sri Lanka cassava mosaic virus gây bệnh khảm sắn Việt Nam Nguyễn Thanh Việt*, Trần Kiên Cường**, Nguyễn Thị Nhã**, Thân Văn Thái* *Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành **Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Email: tvthai@ntt.edu.vn TÓM TẮT Bệnh khảm sắn (Cassava mosaic disease, CMD), vi-rút thuộc họ Geminiviridae gây ra, mười bệnh gây thiệt hại mùa màng lớn toàn giới Trong nghiên cứu này, mẫu sắn với bệnh tích khảm đặc trưng thu thập Tây Ninh, Ninh Thuận Củ Chi Kết PCR xác định mẫu dương tính với SLCMVs Phân tích đặc điểm di truyền genome A B cho thấy chủng SLCMVs nghiên cứu chia sẻ mức độ tương đồng cao nucleotide amino acid với nhóm với chủng SLCMVs phân lập Sri Lanka, Ấn Độ, Campuchia Trung Quốc qua dự đốn chủng SLCMVs có chung nguồn gốc Kết dự đoán SLCMVs lưu hành nước ta bắt nguồn từ quốc gia báo cáo bệnh trước đó, đặc biệt Campuchi, quốc gia có chung đường biên giới với nước ta Kết nghiên cứu giúp đánh giá đặc điểm sinh học, di truyền học nhằm hỗ trợ cơng tác kiểm sốt dự đoán xu hướng lưu hành SLCMVs sắn nước ta Từ khóa: Sri Lanka cassava mosaic virus, genome A, genome B, Việt Nam Giới thiệu Cây sắn, thuộc họ Euphorbiaceae, ba loại trồng quan trọng cung cấp cho nhu cầu carbohydrates toàn giới Bệnh khảm sắn (cassava mosaic disease, CMD) vi-rút thuộc họ Geminiviridae gây thiệt hại nghiêm trọng kinh tế an ninh lương thực cho vùng trồng sắn thuộc quốc gia Châu Phi Ấn Độ, đe doạ trực tiếp tới vùng trồng sắn khác tồn giới [1] Tính đến nay, xác định loài gây bệnh, bao gồm African cassava mosaic virus (ACMV), East African cassava mosaic virus (EACMV), South African cassava mosaic virus (SACMV) gây bệnh khảm sắn Châu Phi; Indian cassava mosaic virus (ICMV) gây bệnh khảm sắn Ấn Độ; Sri Lanka cassava mosaic virus (SLCMV) gây bệnh khảm sắn Sri Lanka, Ấn Độ sau lan sang số nước thuộc khu vực đông nam bao gồm Singapore, Campuchia, Trung Quốc Việt Nam [2] SLCMV thuộc chi Begomovivus, họ Geminiviridae họ vi-rút lớn gây bệnh thực vật hai mầm Cũng giống Begomovivus khác, SLCMV lây truyền bọ phấn trắng Bemisia tabaci Genome SLCMV dạng DNA mạch đơn (single strain DNA, ssDNA) gồm hai mạch vòng DNA-A DNA-B với chiều dài xấp xỉ 2700 bp vùng dịch mã hai chiều chuỗi DNA [2] DNA-A mã hoá cho loại protein, ký hiệu AC1-4, AV1 AV2, protein AV1 đóng vai trị protein vỏ có chức quan trọng trình gây nhiễm vi-rút vào tế bào chủ [3] DNA-B mã hoá cho hai protein, BC1 BV1, liên quan đến chức vận chuyển vi-rút Các triệu chứng ghi nhận cấy sắn nhiễm SLCMV bao gồm vàng lá, xoăn lá, teo ngọn, còi cọc dẫn tới suất chất lượng củ giảm SLCMV lần đầu báo cáo gây bệnh khảm sắn Sri Lanka từ trước năm 2002 có mối quan hệ với SLCMV gây bệnh khảm sắn Ấn Độ năm 2005 Năm 2016, Campuchia báo cáo phát SLCMV gây bệnh khảm sắn tại tỉnh Ratanakiri thuộc khu vực phía Đơng giáp Việt Nam Năm 2017, sắn trồng tỉnh Tây Ninh có biểu triệu chứng bệnh khảm sắn SLCMV gây 45 bị úa vàng xuăn teo, phát triển chậm còi cọc Theo số liệu thống kê Cục Bảo vệ thực vật tính tới tháng 02/2019, nước có khoảng 26 nghìn diện tích sắn trồng bị nhiễm SLCMV 14 tỉnh, thành phố nước bao gồm Tây Ninh, Ninh Thuận, Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Bà Rịa Vũng Tàu, Bình Dương, Bình Phước, Gia Lai, Long An, Đắk Lắk, Khánh Hịa, An Giang, Kon Tum, Bình Thuận gây thiệt hại kinh tế cho người dân ảnh hưởng tới nguồn cung cấp nguyên liệu giống cho nhu cầu nước xuất [4] Trong nghiên cứu này, xác định đặc điểm di truyền học số chủng SLCMVs mẫu bệnh khảm sắn thu thập tỉnh có báo cáo lưu hành bệnh bao gồm Tây Ninh, Ninh Thuận Củ Chi Kết sử dụng để xác định mối tương quan mặt di truyền học chủng SLCMVs lưu hành, từ xác định mức độ tác động SLCMVs đưa gợi ý canh tác sắn nước ta Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu bệnh phẩm sắn với triệu chứng đặc trưng bệnh khảm vi-rút bị bệnh còi cọc; xuất vết vàng xen lẫn phần xanh, nhỏ bình thường, bị biến dạng nhăn nheo (Hình 1) Mẫu bệnh thu thập Tây Ninh, Ninh Thuận Củ Chi Lá rửa với nước cất sát trùng bề mặt cồn 70° bảo quản -20 °C đến sử dụng để tách chiết DNA Hình Mẫu sắn với bệnh tích đặc trưng bệnh khảm vi-rút 2.2 Tách chiết DNA thực phản ứng PCR DNA SLCMVs tách chiết kít HITM DNA Plant Kit (ABT, Việt Nam) theo hướng dẫn nhà sản xuất Qui trình tách chiết DNA tóm tắt sau: 50 mg mẫu bệnh ủ ni-tơ lỏng trước nghiền nhỏ cối chày Tiếp theo mẫu ly giải cách bổ sung hỗn hợp gồm 400 µl dung dịch PLS1, 10 µl RNase A (ủ 65 °C 30 phút) 130 µl PLS2 Tiếp theo, DNA gắn cột silica, rửa với washing buffer lần Cuối DNA tách khỏi cột silica elution buffer DNA bảo quản -20 °C đến sử dụng cho phản ứng PCR Phản ứng PCR thực với thành phần điều kiện sau: µl DNA tinh sạch, µl dNTPs (10 mM), µl loại cho mồi sense (SLMVA-F: 5’ATGTCGAAGCGACCAGCAGATATCAT -3’), anti-sense (SLMVA-R: 5’TTAATTGCTGACCGAATCGTAGAAG -3’), μl 10x PCR buffer, 1.25U DNA Polymerase (MyTaq™ DNA Polymerase, Bioline, England) bổ sung nước cất khử ion đến đủ 25 µl Chu trình nhiệt phản ứng PCR sau: 94 °C phút; 35 chu kỳ 94 °C 30 giây, 53 °C 30 giây, 72 °C phút; kéo dài chuỗi 72 °C phút Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 1,2 % 2.3 Giải trình tự gen, phân tích trình tự gen xây dựng phả hệ 46 Giải trình tự gen: Sản phẩm PCR tinh kít QIAquick PCR Purification (QIAgen) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm PCR tinh sử dụng để giải trình tự theo phương pháp Sanger sequencing với cặp mồi đặc hiệu (FirstBase, Malaysia) Phân tích trình tự gen: Kết giải trình tự gen phân tích phần mềm DNASTAR Lasergene (DNASTAR®) Trình tự nucleotide (nt) amino acid (aa) chủng SLCMVs chủng tham chiếu phân tích, so sánh phần mềm BioEdit 6.0 [5] Xây dựng phân tích phả hệ: Trình tự di truyền gen SLCMVs nghiên cứu so sánh với chủng SLCMVs tham chiếu Trình tự gen xếp sử dụng chương trình CLUSTAL X alignment [6] Cây phả hệ xây dựng dựa vào phần mềm Mega 7.0 với tham số Kimura-2 parameter mô thay đổi nt Bootstrap re-sampling 1,000 lần [7] Kết thảo luận Việt Nam quốc gia có điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa nằm phía đơng bán đảo Đơng Dương Trong đó, nơng nghiệp đóng vai trị quan trọng cho kinh tế quốc gia Sắn lương thực có vị trí quan trọng thứ năm giới thứ ba Việt Nam sau lúa ngơ Việc trồng sắn có nhiều lợi lương thực khác dễ trồng dễ thích nghi, vốn đầu tư vv Ngồi chức lương thực phục vụ cho người, đến sắn sử dụng vào nhiều mục đích ngun liệu cho ngành cơng nghiệp sinh học, chăn nuôi, thủy sản, vv Tại nước ta, sắn trồng có sản lượng thu hoạch cao thứ ba (sau lúa mía) trồng số khu vực nước ta bao gồm Bắc Trung bộ, Duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đơng Nam Trung du miền núi phía Bắc với diện tích khoảng 97% diện tích sắn nước Tuy nhiên thách thức lớn ngành trồng sắn nước ta suất trồng sắn chưa cao, thị trường không ổn định tác động loại bệnh hại ngày tăng từ ảnh hưởng tới suất chất lượng sắn nguyên liệu Bệnh khảm sắn vi-rút bệnh truyền nhiễm đặc biệt nguy hiểm, dễ lây lan phát triển nhanh, ảnh hưởng nghiêm trọng đến suất, chất lượng, kinh tế an ninh nguyên liệu giống khu vực trồng sắn khắp nước ta SLCMVs có nguồn gốc từ Sri Lanka sau phát quốc gia Ấn Độ, Campuchia, Việt Nam Trung Quốc Riêng nước ta, tính đến tháng 02/2019 bệnh xuất 14 tỉnh, thành phố với diện tích trồng sắn bị giảm suất buộc tiêu hủy hoàn toàn khoảng 26 nghìn [4] 3.1 Phát SLCMV mẫu sắn bệnh phản ứng PCR SLCMVs mẫu bệnh phẩm lấy tỉnh Tây Ninh, Ninh Thuận Củ Chi chẩn đoán phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu vùng genome A Sản phẩm PCR (kích thước khoảng 800 bp) cho kết dương tính với SLCMVs (Hình 2) Kết PCR khuếch đại đặc hiệu với genome A SLCMVs mẫu bệnh phẩm cho thấy triệu chứng xuất nhiễm bệnh đặc trưng vi-rút có khả tồn phát tán nhanh từ vùng nhiễm bệnh sang vùng lân cận nhờ trung gian truyền bệnh bọ phấn trắng và/hoặc hoạt động giao thương buôn bán nguyên liệu, giống (A) CC (B) TN NT 47 Hình (A) Tổng số DNA SLCMVs mẫu thu tách chiết (B) PCR phát SLCMVs mẫu chẩn đoán CC (Củ Chi), TN (Tây Ninh), NT (Ninh Thuận) 3.2 Phân tích so sánh trình tự genome Trình tự đoạn genome phát xác định phương pháp giải trình tự Sanger sequencing (FirstBase, Malaysia), kết cho thấy ba chủng nghiên cứu chia sẻ mức độ tương đồng với chủng vi-rút phân lập Campuchia năm 2015 Trung Quốc năm 2018 Trình tự đầy đủ genome A B xác định với kích thước genome 2,760 nt 2,737 nt Kết so sánh trình tự nt genome A B cho thấy chủng phân lập Việt Nam chia sẻ mức độ tương đồng 99.7-100% 99.5-100%, với chủng tham chiếu phân lập từ Sri Lanka, Ấn Độ, Trung Quốc, Campuchia 93.3-99.8% 95.4-99.7% cho genome A B (Bảng 1) [8, 9] Bảng Mức độ tương đồng nt aa genome A B chủng SLCMVs phân lập Tây Ninh, Ninh Thuận Củ Chi so với chủng tham chiếu Strains DNA-A DNA-B AV1 AV2 AC1 AC2 AC3 AC4 BV1 BC1 Ninh thuận 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 (100) (100) (100) (100) (100) (100) (100) (100) 99.8 99.7 99.7 99.0 100 100 99.4 100 (100) (100) (99.2) (100) 100 100 99.3 99.7 (100) (100) 100 100 (100) (100) 100 100 (100) (100) 99.0 97.6 Củ Chi 99.7 99.7 (100) Tây Ninh 99.7 99.5 99.7 (100) SLCMA- 99.8 99.7 A/Cambodia HN7/China 100 (100) 99.7 99.6 99.8 (100) TVM3/India 98.5 98.2 99.8 (100) malappuram 97.7 96.6 /India PSL4-2018/ 99.3 (100) 93.3 Sri lanka- 95.4 92.3 (99.1) (99.0) (97.0) 99.7 99.9 99.7 (99.1) (99.6) (99.2) 94.6 99.9 99.5 (94.9) (99.6) (99.2) 94.3 99.8 99.7 (94.0) (99.6) (99.2) 93.8 96.7 99.0 (99.2) (99.6) 99.4 99.8 (99.2) (99.6) 99.3 99.7 (98.8) (99.6) 98.4 98.2 (93.2) (94.7) (98.4) (99.2) (95.0) (97.6) (97.9) 99.5 96.0 94.8 96.7 98.3 96.5 97.5 (93.2) (93.4) (93.3) (94.0) (97.0) (93.3) (97.2) 82.3 95.9 95.8 93.0 98.3 97.5 95.9 (96.8) (85.5) (92.3) (95.5) (90.2) (96.0) (94.4) (94.7) 3.3 Phân tích phả hệ Cây phả hệ cho genome A B xây dựng để phân tích mối quan hệ trình tự genome A B của chủng nghiên cứu với chủng tham chiếu thu thập liệu Genbank-NCBI Phân tích phả hệ cho thấy genome A B chủng nghiên cứu thuộc nhóm SLCMVs Trong đó, genome A nằm nhóm với chủng phân lập từ Sri Lanka (pSL1), Campuchia, Trung Quốc (HN7) Ấn Độ [8-10] Trong đó, genome B chủng nghiên cứu nằm nhóm với chủng phân lập 48 từ Capuchia, Trung Quốc Ấn Độ, tách khỏi phân nhóm bao gồm chủng phân lập từ Sri Lanka (pSL4) Ấn Độ (TVM1, Malappuram) (Hình 3) Kết cho thấy tái tổ hợp sảy genome B để hình thành nhóm SLCMVs [11] Hình Cây phả hệ phân tích mối tương quan genome A B chủng SLCMVs nghiên cứu với chủng tham chiếu Kết luận kiến nghị Trong nghiên cứu xác định yếu tố gây bệnh khảm sắn Tây Ninh, Ninh Thuận Củ Chi SLCMVs Phân tích di truyền genome A B chủng SLVMVs phân lập cho thấy chủng chia sẻ mức độ tương đồng cao chúng tơi dự đốn có loại chủng SLCMV lưu hành nước ta có nguồn gốc với chủng SLCMVs lưu hành số quốc gia Sri Lanka, Campuchia, Ấn Độ Trung Quốc Khu vực Đông nam cung cấp nguyên liệu sắn cho giới tới 95%, việc xuất SLCMVs gây bệnh khảm sắn tác động tiêu cực đến nguồn cung cấp nguyên liệu sắn cho toàn giới, ảnh hưởng đến sinh kế hang triệu hộ nông dân trồng sắn khu vực Do cần phải tiếp tục thực biện pháp nhằm ngăn chặn lây lan SLCMVs sang khu vực chưa nhiễm bệnh nhiều biện pháp khác chia sẻ kiến thức, cập nhật thông tin, thử nghiệm sử dụng giống sắn kháng SLCMVs Lời cảm ơn: Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ NTTU đề tài mã số 2019.01.73/HĐ-KHCN 49 Tài liệu tham khảo Dutt, N., R.W Briddon, and I Dasgupta, Identification of a second begomovirus, Sri Lankan cassava mosaic virus, causing cassava mosaic disease in India Arch Virol (2005) 150:2101-2108 Patil, B.L and C.M Fauquet, Cassava mosaic geminiviruses: actual knowledge and perspectives Mol Plant Pathol (2009) 10:685-701 Briddon, R.W., et al., Distinct evolutionary histories of the DNA-A and DNA-B components of bipartite begomoviruses BMC Evol Biol (2010) 10:97 Nguyễn, H.T and T.N Phạm, Ảnh hưởng bệnh khảm virus đến suất chất lượng tinh bột số giống sắn Đông nam Tây nguyên Kỷ yếu hội thảo quốc gia bệnh hại Thực vật Việt Nam lần thứ 18 (2019) 31-36 Hall, T.A., BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT Nucl Acids Symp Ser (1999) 41:95-98 Thompson, J.D., et al., The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools Nucleic Acids Res (1997) 25:4876-4882 Kumar, S., G Stecher, and K Tamura, MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets Mol Biol Evol (2016) 33:1870-1874 Wang, H.L., et al., First report of Sri Lankan cassava mosaic virus infecting cassava in Cambodia Plant Disease (2016) 100:1029 Wang, D., et al., First Report of Sri Lankan Cassava Mosaic Virus Infected Cassava in China Plant Disease (2018) 103 10 Saunders, K., et al., Characterisation of Sri Lankan cassava mosaic virus and Indian cassava mosaic virus: evidence for acquisition of a DNA B component by a monopartite begomovirus Virology (2002) 293:63-74 11 Tiendrebeogo, F., et al., Evolution of African cassava mosaic virus by recombination between bipartite and monopartite begomoviruses Virol J (2012) 9:67 Genetic characterization of Sri Lanka cassava mosaic virus infecting cassava in Vietnam Thanh Viet Nguyen*, Kien Cuong Tran**, Thi Nha Nguyen**, Van Thai Than* *NTT Hi-Tech Institute, Nguyen Tat Thanh University **Department of Biotechnology, Nguyen Tat Thanh University Email: tvthai@ntt.edu.vn Abstract Cassava mosaic disease, causes by Geminiviridae family, is one of ten most importance plant viral diseases that causes heavy economic loss in crop industry all around the world In this study, we successfully detected SLCMVs from the cassava leaves with typical cassava mosaic disease collected from Tay Ninh, Ninh Thuan, Dong Nai, Ba Ria-Vung Tau, and Ho Chi Minh City Genetic characterization of the genome A and genome B revealed that the studied SLCMV strains shared the highest nucleotide and amino acid identity each others and shared closely relationship with the SLCMV strains isolated in Sri Lanka, India, Cambodia, and China, suggesting that these strains shared common ancestor The results also suggested that the circulating SLCMVs in Vietnam may infected from SLCMVs isolated in one of those contries, especially Cambodia where sharing the border with Vietnam These results provided important information on the biological and molecular characterization of the circulating SLCMVs in Vietnam, as well as the evident for control and predict the circulation of SLCMVs in future Keywords: Sri Lanka cassava mosaic virus, genome A, genome B, Vietnam 50 Phụ lục 5.2: Quyết định hướng dẫn Sinh viên nghiên cứu khoa học Sinh viên Trần Kiên Cường, Khoa CNSH, Khóa luận tốt nghiệp, điểm trung bình Hội đồng 9.4/10 51 52 Phụ lục 5.3: Bài tóm tắt Kỷ yếu Hội nghị CNSH toàn quốc 2019, Trung tâm CNSH Tp HCM 53 54 PHỤ LỤC 6: (hợp đồng, thuyết minh đề cương) 1- Thuyết minh đề tài (photo ký với Trường) 2- Hợp đồng thực đề tài NCKH (photo ký với Trường) 55