NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ LOÀI CÂY NGẬP MẶN Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN CẦN GIỜ

TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHSP TPHCM Số 5(70) năm 2015 _ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ LOÀI CÂY NGẬP MẶN Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN CẦN GIỜ PHẠM VĂN NGỌT*, PHẠM XN BẰNG**, QCH VĂN TỒN EM*** TĨM TẮT Kết nghiên cứu cho thấy cao chiết từ 10 loài ngập mặn: Bần trắng (Sonneratia alba Sm.), Cóc kèn (Derris trifoliata Lour.), Cóc trắng (Lumnitzera racemosa Willd.), Đước đơi (Rhizophora apiculata Blume), Đước xanh (Rhizophora mucronata Lam.), Lức Ấn (Pluchea indica (L.) Lees.), Quao nước (Dolichandrone spathacea (L.f.) Seem.), Rau mui (Wedelia biflora (L.) DC.), Vẹt dù (Bruguiera gymnorhiza (L.) Lam.), Xu ổi (Xylocarpus granatum J Koenig) có khả kháng lại chủng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Từ khóa: rừng ngập mặn, hoạt tính kháng khuẩn, Cần Giờ, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli ABSTRACT Studying antibacterial activity of some mangrove species in Can Gio Mangrove Biosphere Reserve Results of the study show concentrated decoction from 10 species of mangrove species: Sonneratia alba, Derris trifoliata, Lumnitzera racemosa, Rhizophora apiculata, Rhizophora mucronata, Pluchea indica, Dolichandrone spathacea, Wedelia biflora, Bruguiera gymnorhiza, Xylocarpus granatum possess antibacterial activity against pathogenic bacteria such as Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa Keywords: Mangroves, Antibacterial activity, Can Gio, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli Mở đầu Khu Dự trữ Sinh (KDTSQ) Cần Giờ có hệ động - thực vật đa dạng phong phú Thảm thực vật rừng Cần Giờ khơng có vai trị phổi xanh khổng lồ điều hịa khí hậu, hệ sinh thái cịn nguồn tài ngun vơ q giá Nó tường chắn sóng, gió; nơi ở, thức ăn cho động vật; đặc biệt người dân địa phương sử dụng ngập mặn để chữa bệnh có từ lâu đời [1], [5] * TS, Trường Đại học Sư phạm TPHCM; Email: ngotpham@yahoo.com ThS, Trường THPT Bến Cát, Bình Dương *** ThS, Trường Đại học Sư phạm TPHCM ** 140 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHSP TPHCM Phạm Văn Ngọt tgk _ Kết điều tra cuả cho thấy KDTSQ Cần Giờ có 67 lồi ngập mặn thuốc (chỉ điều tra ngập mặn thức tham gia rừng ngập mặn) Trong số có 41 loài ngập mặn người dân sống sử dụng làm thuốc cách thức sử dụng thuốc chủ yếu sắc uống ăn rau Tuy nhiên, chưa có cơng trình nghiên cứu cách đầy đủ, khoa học thuốc thuốc từ ngập mặn Bài báo “Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn số loài ngập mặn Khu Dự trữ Sinh Cần Giờ” nhằm đánh giá khả kháng khuẩn số loài thuốc sử dụng phổ biến Địa điểm, đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Địa điểm thu mẫu Ở Khu Dự trữ Sinh Cần Giờ 2.2 Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu khả kháng khuẩn từ mẫu cao 10 loài ngập mặn KDTSQ Cần Giờ người dân sử dụng làm thuốc chữa bệnh Để thử hoạt tính kháng khuẩn, cân 0,05g cao khơ cho vào ống nghiệm có 10ml nước cất, sau hấp vô trùng 110oC phút Vi sinh vật dùng để kiểm định chủng vi khuẩn thử nghiệm Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus Escherichia coli từ Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, cấy truyền phương pháp thạch nghiêng môi trường MHA thử nghiệm sau 24 nuôi cấy Bảng Kí hiệu mẫu cao thử từ lồi ngập mặn Stt Tên loài Bần trắng - Sonneratia alba Cóc kèn - Derris trifoliata Cóc trắng - Lumnitzera racemosa Đước đôi - Rhizophora apiculata Đước xanh - Rhizophora mucronata Kí Stt Tên lồi hiệu BT Lức Ấn - Pluchea indica CK Rau mui - Wedelia biflora Kí hiệu CT Quao nước - Dolichandrone spathacea ĐĐ Vẹt dù - Bruguiera gymnorhiza ĐX 10 Xu ổi - Xylocarpus granatum QN VD LA RM 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp điều chế mẫu thử hoạt tính Các mẫu thực vật tươi rửa sạch, cắt nhỏ thành đoạn dài - 3cm, bếp lửa vàng, khơ, hạ thổ gói lại giấy báo khơ Ứng với lồi, lấy 30g mẫu khơ cho vào nồi đất, đổ 500ml nước cất đun cho sôi nhỏ 90 phút Sau đó, đổ nước sắc khay thủy tinh, ghi kí hiệu bỏ vào tủ sấy khô 60oC khối lượng không đổi Cao khô cho vào lọ thủy tinh, có ghi nhãn, đậy kín bảo quản tủ lạnh 5oC 141 XO Số 5(70) năm 2015 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ 2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn - Môi trường: sử dụng môi trường MHA thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn [2] - Chuẩn bị chủng vi khuẩn thử nghiệm: định lượng chủng vi khuẩn thử nghiệm cách sử dụng kết hợp phương pháp đo độ đục phương pháp đếm khuẩn lạc để thiết lập mối tương quan hồi quy tuyến tính độ đục nồng độ tế bào vi khuẩn - Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cao chiết: Xác định hoạt tính kháng khuẩn cao BT, CK, CT, ĐĐ, ĐX, LA, RM, QN, VD, XO phương pháp đục lỗ thạch Bauer cộng Hút 20µl dịch huyền phù chủng vi khuẩn thử nghiệm có số lượng tế bào vi khuẩn khoảng 105 ( 5*106 CFU/ml) nhỏ vào đĩa môi trường trải mặt thạch khô que thủy tinh vô trùng Dùng khoan nút chai vơ trùng đường kính 9mm đục lỗ thạch đĩa Nhỏ vào lỗ thạch 100µl dung dịch cao chiết từ thực vật ngập mặn Lặp lại lần với loại cao thử nghiệm Bao gói để vào tủ lạnh nhiệt độ 50C cho thuốc thử khuếch tán vào môi trường Sau đó, lấy để nhiệt độ phịng kiểm tra, đo đường kính vịng vơ khuẩn, chụp hình ghi lại kết [2], [3] 2.3.3 Phương pháp xử lí số liệu Dùng tốn thống kê, phần mềm Excel 2010 Statgraphics plus 3.1 để xử lí số liệu thu Khi xây dựng đường chuẩn sử dụng đường chuẩn có trị số P_value< 0,05 hệ số tương quan R2 > 90% So sánh độ mạnh hoạt tính cao thử độ tin cậy 95% Kết nghiên cứu Kết hoạt tính kháng khuẩn cao thử thể bảng Bảng Đường kính (mm) vịng vơ khuẩn (D - d) cao thử Chủng vi khuẩn kiểm định Tên cao BT CK CT ĐĐ ĐX LA QN RM VD XO S aureus B subtilis E coli 36,3 ± 1,5 d 13,7 ± 1,5 a 24,8 ± 1,3 c 26,3 ± 1,2 c 26,8 ± 2,3 c 23,7 ± 1,0 bc 13,7 ± 2,1 a 23,7 ± 4,6 bc 20,3 ± 1,5 b 23,5 ± 0,9 bc 18,7 ± 1,2 f 11,0 ± 1,1 ab 13,3 ± 0,6 de 11,3 ± 0,5 bc 14,2 ± 0,8 e 12,8 ± 1,0 cde 11,2 ± 0,2 b 11,8 ± 0,2 bcd 9,5 ± 0,4 a 12,3 ± 0,5 bcd 25,3 ± 2,5 e 7,8 ± 0,8 b 20,0 ± 1,1 cd 19,5 ± 0,7 c 17,7 ± 1,5 c 22,3 ± 1,6 d 0,0 ± 0,0 a 17,8 ± 0,8 c 17,5 ± 1,1 c 17,7 ± 1,5 c P aeruginosa 12,3 ± 1,0 d 0,0 ± 0,0 a 10,8 ± 0,8 cd 10,2 ± 0,2 bc 11,3 ± 0,5 cd 11,2 ± 1,4 cd 9,8 ± 0,5 bc 0,0 ± 0,0 a 10,3 ± 0,5 c 8,7 ± 1,0 b * Ghi chú: Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức 95%, đó: a < b < c < d 142 Phạm Văn Ngọt tgk TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ 3.1 Khả kháng Staphylococcus aureus cao chiết thử nghiệm S aureus biết đến loài vi khuẩn có khả kháng thuốc mạnh Một vài dòng kháng với tất loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, dòng ngày xuất nhiều Những dòng MRSA (Methicilin resistant Staphylococcus aureus) phổ biến hầu hết dòng kháng với nhiều kháng sinh khác Có điều đáng ngạc nhiên chủng vi khuẩn lại nhạy cảm với dịch chiết từ thuốc rừng ngập mặn Qua kết bảng 2, cho thấy: khả ức chế sinh trưởng S aureus cao chiết từ mẫu khô ngập mặn tương đối cao Tuy nhiên, hoạt tính cao chiết thử nghiệm khơng đồng có khác biệt độ mạnh (hình 1) Tồn cao thử nghiệm trừ CK QN cho hoạt tính kháng S aureus cao với đường kính vịng vơ khuẩn > 20 mm Ở độ tin cậy 95%, cao BT xem có hoạt tính mạnh, cao CT, ĐĐ, ĐX, LA, RM, XO có hoạt tính mạnh khơng có khác biệt Cao CK QN có hoạt tính tương tự mức trung bình Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) Staphylococcus aureus gây nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ gây độc người, thường xảy chỗ xây xước bề mặt da mụn nhọt, viêm loét Cùng họ Đước Rhizophoraceae, hai lồi Đước đơi Đước xanh có độ mạnh hoạt tính tương tự lồi Vẹt dù lại có hoạt tính yếu Tuy nhiên loài Vẹt dù ghi nhận từ nhân dân chữa viêm loét nhiễm trùng Như chúng tơi cho sử dụng loài thuộc họ Đước để chữa bệnh da tương tự loài Vẹt dù Staphylococcus aureus 40 40 36.3 30 30 24.8 20 26.3 13.7 10 23.7 23.7 26.8 23.520 20.3 13.7 10 0 BT CK CT ĐĐ ĐX LA QN RM VD XO Các cao chiết thử nghiệm Hình Biểu đồ so sánh độ mạnh hoạt tính kháng S aureus cao thử Abeysinghe (2010) cho chiết xuất vỏ lồi Cóc trắng (Lumnitzera racemosa) ethanol có hoạt tính mạnh nước [5] Có thể nồng độ chất có hoạt tính nước thấp hơn, li trích chất khơng hồn tồn vào dịch chiết mà cịn giữ lại phần cặn, bã Tuy vậy, công trình nghiên cứu chúng tơi, sử dụng cao khô cô đặc pha nồng dộ 50mg/ml hoạt tính lồi Cóc trắng thể gần mức mạnh (D-d = 24,8mm) 143 Số 5(70) năm 2015 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ Nghiên cứu Yompakdee (2012) hoạt tính kháng lồi Bần chua (Sonneratia caseolaris (L.) Engl.) cho thấy chiết xuất từ cao methanol có hoạt tính kháng mạnh S aureus [7] Điều tương tự với loài Bần trắng (Sonneratia alba) cơng trình nghiên cứu chúng tơi B A C Hình Đường kính vịng kháng Staphylococcus aureus cao chiết A: Bần trắng B: Cóc trắng C: Cóc kèn Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) 3.2 Khả kháng Bacillus subtilis cao chiết thử nghiệm Bacillus subtilis 20 20 18.7 15 10 15 12.3 11.0 13.3 12.8 14.2 11.2 11.8 11.3 10 9.5 0 BT CK CT ĐĐ ĐX LA QN RM VD XO Các cao chiết thử nghiệm Hình Biểu đồ so sánh hoạt tính kháng Bacillus subtillis cao thử Bacillus subtilis trực khuẩn hình que, có khả tạo bào tử, có khả chịu đựng điều kiện mơi trường khắc nghiệt, ngồi cịn có khả tạo chất đề kháng (kháng sinh) Mặc dù vi khuẩn gây bệnh B Subtilis đại diện cho nhóm vi khuẩn Gram (+) nhạy cảm với toàn cao chiết từ thuốc ngập mặn Điều cho thấy cao chiết từ thuốc rừng ngập mặn nói khơng có khả kháng Staphylococcus aureus mà kháng với vi khuẩn Gram (+) khác Qua kết nghiên cứu bảng hình 3, cho thấy khác biệt hoạt tính kháng Bacillus subtillis cao thử nghiệm Toàn cao thử nghiệm cho hoạt tính kháng Bacillus subtilis từ mức yếu đến trung bình (D-d < 20mm) So sánh độ tin cậy 95%, cao BT hoạt tính mạnh nhất, khác biệt hồn tồn so với cao cịn lại Cao VD có hoạt tính kháng Bacillus subtilis yếu 144 Phạm Văn Ngọt tgk TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ A C B Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) Hình Đường kính vịng kháng Bacillus subtilis cao chiết A: Bần trắng B: Đước xanh C: Xu ổi 3.3 Khả kháng Escherichia coli cao chiết thử nghiệm Các cao chiết từ ngập mặn đại đa số có tác dụng ức chế sinh trưởng E coli, số đó, lồi Bần trắng, Rau mui, Xu ổi ghi nhận dùng để trị bệnh đường tiêu hóa ỉa chảy, kiết lị, đau bao tử, viêm gan Có thể bệnh có liên quan đến phát triển E.coli đường tiêu hóa việc người dân dùng để trị bệnh hồn tồn có sở Escherichia coli 30 25 25 20 25.3 20 22.3 15 20.0 17.8 19.5 10 15 17.7 17.5 10 17.7 7.8 5 0 BT CK CT ĐĐ ĐX LA QN RM VD XO Các cao chiết thử nghiệm Hình Biểu đồ so sánh độ mạnh hoạt tính kháng E coli cao thử Qua hình cho thấy: cao QN chiết từ lồi Quao nước khơng có hoạt tính E coli, tất cao cịn lại cho hoạt tính kháng E coli So sánh độ mạnh hoạt tính độ tin cậy 95%, cao CK có hoạt tính thấp mức yếu, cao ĐĐ, ĐX, RM, VD, XO có hoạt tính tương tự mức trung bình (D-d > 15mm) Cao CT LA có hoạt tính tương tự mức mạnh (D-d > 20mm), cao BT chiết từ loài Bần trắng có hoạt tính cao mức mạnh (D-d > 25mm) Hoạt tính kháng E.coli cao chiết xuất ethanol loài Xu ổi (Xylocarpus granatum) đề cập nghiên cứu Premnathan cộng (1999) cho thấy mức trung bình Bandaranayake (1998) ghi nhận Đước đôi (Rhizophora apiculata) dùng làm thuốc có khả khử trùng, trị tiêu chảy, thương hàn Kết nghiên cứu chúng tơi cho thấy hoạt tính kháng E.coli lồi Đước đôi cao chiết đánh giá mức mạnh 145 Số 5(70) năm 2015 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ A B C Hình Đường kính vịng kháng E coli cao chiết A: Bần trắng B: Lức Ấn C: Đước đôi 3.4 Khả kháng Pseudomonas aeruginosa cao chiết thử nghiệm P aeruginosa biết đến với tên gọi trực khuẩn mủ xanh chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến, kháng lại nhiều kháng sinh thông dụng như: penicillin, ampicillin, chloramphenicol, tetracyclin Một số cao chiết cho kết ức chế sinh trưởng P aeruginosa, nhiên có khác biệt hoạt tính cao chiết (hình 7) Cao CK RM khơng có hoạt tính P aeruginosa, cao cịn lại có hoạt tính mức yếu So sánh độ tin cậy 95%, cao CT, ĐĐ, ĐX, LA, QN, VD có hoạt tính tương tự (P-value > 0.05) Cao BT có khác biệt, mạnh hoạt tính với cao ĐĐ, QN, VD khơng có sai khác với cao CT, ĐX, LA (bảng 2) Cao BT chiết xuất từ Bần trắng (Sonneratia alba) thể hoạt tính mạnh chủng S aureus, B subtillis, E coli lại tác động yếu đến sinh trưởng P aeruginosa Sahoo (2012) phân tích thành phần hóa học lồi Đước xanh (Rhizophora mucronata) có mặt số hợp chất saponins, tanin, phenol, flavonoid volatile oil (những dầu dễ bay hơi) cao chiết ethanol, trong cao nước tìm thấy tanin phenol Khi phân tích thành phần Bần trắng (Sonneratia alba), tác giả tìm thấy có mặt saponin, tanin, volatile oil cao ethanol tanin phenol diện cao nước [6] Trong cơng trình nghiên cứu chúng tôi, vỏ hai lồi ngập mặn li trích nước ức chế sinh trưởng P aeruginosa Như kết luận sơ hợp chất tanin phenol số hợp chất khác chưa nhận diện cao chiết nước loài Đước xanh (Rhizophora mucronata) Bần trắng (Sonneratia alba) tác nhân ức chế sinh trưởng vi khuẩn P aeruginosa, hợp chất khơng diện cao chiết lồi Cóc kèn (Derris trifoliata) Rau mui (Wedelia biflora) 146 Phạm Văn Ngọt tgk TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHSP TPHCM Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) _ Pseudomonas aeruginosa 14 12 12 10 9.8 12.3 10 10.8 8.7 11.3 10.2 10.3 11.2 4 2 0 0 BT CK CT ĐĐ ĐX LA QN RM VD XO Các cao chiết thử nghiệm Hình Biểu đồ so sánh độ mạnh hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosa cao thử A B C Hình Đường kính vịng kháng Pseudomonas aeruginosa cao chiết A: Bần trắng B: Đước xanh C: Quao nước Kết luận kiến nghị 4.1 Kết luận Cao chiết từ 10 loài loài ngập mặn: Bần trắng (Sonneratia alba Sm.), Cóc kèn (Derris trifoliata Lour.), Cóc trắng (Lumnitzera racemosa Willd.), Đước đơi (Rhizophora apiculata Blume), Đước xanh (Rhizophora mucronata Lam.), Lức Ấn (Pluchea indica (L.) Lees.), Quao nước (Dolichandrone spathacea (L.f.) Seem.), Rau mui (Wedelia biflora (L.) DC.), Vẹt dù (Bruguiera gymnorhiza (L.) Lam.), Xu ổi (Xylocarpus granatum J Koenig) có khả kháng lại chủng vi khuẩn gây bệnh ngày kháng nhiều loại thuốc Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Khả kháng khuẩn cao chiết từ 10 lồi ngập mặn cho thấy sử dụng ngập mặn nguồn để sản xuất loại thuốc, cải thiện việc điều trị bệnh nhiễm trùng gây vi khuẩn 147 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHSP TPHCM Số 5(70) năm 2015 _ 4.2 Đề nghị Vai trò ngập mặn to lớn sinh thái – môi trường kinh tế - xã hội, cần có nhiều biện pháp để bảo tồn lồi này, thường xun có hoạt động tuyên truyền cho người dân vai trò rừng ngập mặn để họ góp phần bảo vệ nguồn tài nguyên Có thể phổ biến người dân sử dụng số rừng ngập mặn làm thuốc chữa bệnh như: Bần đắng (Sonneratia alba Sm.), Lức Ấn (Pluchea indica (L.) Lees), Ơ rơ tím (Acanthus ilicifolius L.) Cần có nghiên cứu sâu thành phần hợp chất có chiết xuất từ lồi ngập mặn có khả kháng khuẩn để ứng dụng cho việc sản xuất loại thuốc chữa bệnh vi sinh vật gây TÀI LIỆU THAM KHẢO Phan Nguyên Hồng, Trần Văn Ba, Viên Ngọc Nam, Hoàng Thị Sản, Vũ Trung Tạng, Lê Thị Trễ, Nguyễn Hồng Trí, Mai Sỹ Tuấn, Lê Xuân Tuấn (1999), Rừng ngập mặn Việt Nam, Trung tâm nghiên cứu Tài Nguyên Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội, Nxb Nông nghiệp Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục Trần Linh Thước (2007), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nxb Giáo dục Abeysinghe PD (2010), “Antibacterial activity of some medicinal mangroves against antibiotic resistant pathogenic bacteria”, The Indian Journal of Medical Research, Vol 72(2), pp 167 - 172 Govindasamy C and R Kannanb (2012), “Pharmacognosy of mangrove plants in the system of unani medicine”, Asian Pacific Journal of Tropical Disease, Vol 2(1), pp S38 - S41 Sahoo G., N.S.S Mulla, Z.A Ansari and C Mohandass (2012), “Antibacterial Activity of Mangrove Leaf Extracts against Human Pathogens”, Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 74(4), pp 348 - 351 Yompakdee C S Thunyaharn, T Phaechamud (2012), “Bactericidal activity of methanol extracts of crabapple mangrove tree (Sonneratia caseolaris (L.) Engl.) against multi-drug resistant pathogens”, Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 74(3), pp 230 - 236 (Ngày Tòa soạn nhận bài: 10-4-2015; ngày phản biện đánh giá: 14-4-2015; ngày chấp nhận đăng: 18-5-2015) 148