26 5 Bông sÑ 4 2020 chuyÃn in pdf �� KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVII SỐ 4 2020 2 , , 2 2 Công Hà My, Lê Thị Lan Anh, Dương Đức Hiếu, Trần Nam Triều, Vũ Hoài Nam, Trần Thị Kim Lan, Bùi Trần Anh Đào,[.]
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVII SỐ - 2020 , , 2 Công Hà My, Lê Thị Lan Anh, Dương Đức Hiếu, Trần Nam Triều, Vũ Hoài Nam, Trần Thị Kim Lan, Bùi Trần Anh Đào, Bùi Khánh Linh Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam TÓM TẮT Để đánh giá hiệu phát ấu trùng giun móc chó phương pháp Baermann phương pháp đĩa thạch, tiến hành thu thập 122 mẫu phân chó để làm vật liệu thí nghiệm ni xác định ấu trùng giun móc Bằng phương pháp ni ấu trùng đĩa thạch, thu 47,54% số lượng mẫu phân chứa ấu trùng giun móc, đó, phương pháp Baermann thu 6,56% số lượng mẫu phân có ấu trùng giun móc Kết thí nghiệm cho thấy phương pháp ni ấu trùng giun móc đĩa thạch có nhiều lợi so với phương pháp Baermann, thời gian thu ấu trùng giun móc nhanh, thiết kế hệ thống thí nghiệm đơn giản, dễ dàng vận hành Từ khố: Ấu trùng giun móc, phương pháp thu ấu trùng giun móc thạch, Baermann RPSDUL HIILFDF RI PHWKRGV R HPDWRGD ODUYDH FROOHFWLR L GR V X Q X LHX DQ KL LP DQ XL Q D H KL DQ QK DQ DP LHX X DL DP DQ QK D XL KDQK LQK 800 ,Q RUGHU WR FRPSDUH WKH HIILFDF RI GHWHFWLQJ KRRN RUP DUYDH LQ GRJV EHW HHQ WKH %DHUPDQQ PHWKRG DQG JDU S DWH F W UH PHWKRG D WRWD RI GRJ IHFD VDPS HV HUH FR HFWHG DV WKH H SHULPHQWD PDWHULD V IRU F W ULQJ DQG GHWHUPLQLQJ WKH KRRN RUP DUYDH % WKH JDU S DWH F W UH PHWKRG WKH KRRN RUP DUYDH HUH GHWHFWHG LQ RI WKH IHFD VDPS HV PHDQ KL H E %DHUPDQQ PHWKRG WKH KRRN RUP DUYDH HUH GHWHFWHG LQ RI IHFD VDPS HV RQ ,Q DGGLWLRQ GHWHFWLQJ KRRN RUP DUYDH E JDU S DWH F W UH PHWKRG SUHVHQWHG VHYHUD DGYDQWDJHV LQ FRPSDULVRQ LWK %DHUPDQQ PHWKRG V FK DV VKRUW WLPH IRU GHFWHFWLQJ KRRN RUP DUYDH VLPS H H SHULPHQWD GHVLJQ DQG RSHUDWLRQ V RRN RUP DYDH DJDU S DWH F W UH %DHUPDQQ FR HFWLRQ PHWKRGV I ĐẶT VẤN ĐỀ Tình trạng nhiễm bệnh giun tròn truyền qua đất (Soil-transmitted helminth infections - STHs) vấn đề phổ biến toàn giới ảnh hưởng đặc biệt đến nơi có điều kiện sống thấp kém, nước sinh hoạt không bảo đảm hay đất bị ô nhiễm, vệ sinh cá nhân vệ sinh mơi trường có nhiều hạn chế hay hiểu biết y tế cộng đồng thấp Theo báo cáo WHO năm 2020, ước tính 1,5 tỷ người nhiễm STHs, chiếm 24% dân số giới, với tỷ lệ cao châu Phi, Trung Quốc nước Đông Nam Á Để chẩn đoán STHs cần dựa vào phát ấu trùng phân Tuy nhiên, hầu hết trường hợp nhiễm xảy cấp tính, lượng trứng thải phân ít, làm giảm độ nhạy phương pháp Riêng loài giun móc giun lươn có vịng đời trực tiếp, ấu trùng khơng nở thể vật chủ mà nở bên ngồi mơi trường, khiến việc xét nghiệm KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVII SỐ - 2020 phân tìm trứng/ấu trùng trở nên khó khăn Phương pháp Baermann phương pháp thường sử dụng để thu ấu trùng giun tròn Tuy nhiên phương pháp có số nhược điểm: hệ thống thiết kế thí nghiệm cồng kềnh, khả phát khơng cao ấu trùng có khả bám vào hệ thống ống dẫn hay vải gạc, khiến việc chẩn đoán trở nên khó khăn Bên cạnh đó, phương pháp thạch agar phương pháp sử dụng số phịng thí nghiệm ký sinh trùng giới để thu ấu trùng hiệu (Buonfrate cs., 2015; Jucelene, 2003) chưa giới thiệu Việt Nam Phương pháp sử dụng môi trường thạch để trứng từ mẫu phân nở trực tiếp bề mặt thạch, giúp quan sát dễ dàng có độ nhạy cao, phát ấu trùng nhanh hơn, xác, rút ngắn thời gian kinh phí cho nghiên cứu sâu để chẩn đoán sớm bệnh giun tròn truyền lây sang người Trong nghiên cứu này, tiến hành so sánh phương pháp thu ấu trùng phương pháp thạch với phương pháp Baermann - phương pháp nuôi ấu trùng thường quy dùng hầu hết phịng thí nghiệm ký sinh trùng Việt Nam, với mục đích để cập nhật giảng dạy trường đại học tìm phương pháp có khả thu lượng lớn ấu trùng phục vụ cho thí nghiệm chuyên sâu giun tròn, ứng dụng phòng trị bệnh II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp thu thập mẫu Các mẫu phân chó thu thập theo phương pháp ngẫu nhiên Phú Thọ, Bắc Ninh Hà Nội Mẫu kiểm tra phịng thí nghiệm Bộ môn Ký sinh trùng – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2.2 Phương pháp nuôi ấu trùng giun trịn đĩa thạch Chuẩn bị mơi trường thạch agar 20%, cho 52 vào đĩa petri nhỏ Lấy gram phân đặt vào đĩa thạch Để đảm bảo ấu trùng không phát tán bên ngồi, lồng đĩa thạch (đường kính 30mm) vào đĩa petri to (đường kính 90mm), đổ khoảng 5ml Glycerin 25% vào đĩa petri to đậy nắp lại Sau để đĩa thạch vào tủ ấm 370C qua đêm Hàng ngày kiểm tra có mặt ấu trùng đĩa thạch kính hiển vi soi (giun móc sử dụng làm model nghiên cứu, giun móc thuộc nhóm giun trịn) 2.3 Phương pháp Baermann Lắp đặt hệ thống Baermann: đặt phễu thủy tinh lên giá, lắp ống cao su vào đáy phễu khoá chặt ống cao su lại Đặt g phân vào vải xô, buộc lại dây cao su để tạo thành túi, sau đặt túi vào phễu thuỷ tinh Thêm nước ấm vào phễu nước ngập mặt túi phân Để yên qua đêm Hàng ngày kiểm tra có mặt ấu trùng cách mở khoá ống cao su, hứng nước vào cốc thuỷ tinh soi kính hiển vi 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Xử lý số liệu phương pháp thống kê sinh học thông qua phần mềm Microsoft Excel 2019 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Để so sánh tỷ lệ phát ấu trùng thu từ phương pháp Baermann phương pháp nuôi ấu trùng thạch, chúng tơi kiểm tra 122 mẫu phân chó kết thể bảng Trong tổng số 122 mẫu xét nghiệm, tỷ lệ dương tính với giun trịn qua phương pháp ni cấy thạch 58/122 (47,54%), có 8/122 (6,56%) ghi nhận phương pháp Baermann Nếu coi phương pháp nuôi ấu trùng thạch phương pháp chuẩn với độ nhạy 100% độ nhạy phương pháp Baermann ứng dụng chẩn đốn ấu trùng giun trịn ký sinh thấp, đạt 13,79% Ở phương pháp Baermann q trình thu, ấu trùng bám vào vải gạc hệ thống KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVII SỐ - 2020 Bảng Tỷ lệ nhiễm ấu trùng giun tròn ký sinh chó thơng qua phương pháp ni ấu trùng thạch phương pháp Baermann (n = 122) Phương pháp Số mẫu nhiễm Tỷ lệ (%) Nuôi ấu trùng thạch DHUPDQQ Ghi chú: *8 mẫu dương tính ghi nhận đồng thời hai phương pháp xét nghiệm ống dẫn làm giảm tỷ lệ phát hiện, phương pháp ni ấu trùng thạch, ấu trùng nở trì bề mặt thạch Kể từ phương pháp nuôi ấu trùng thạch giới thiệu Arakaki cs vào năm 1990 để phát ấu trùng giun lươn S V D LV, số nghiên cứu tiến hành đánh giá hiệu phương pháp với phương pháp khác, tất cho thấy hiệu vượt trội phương pháp nuôi cấy thạch cao phương pháp Baermann Kết nghiên cứu Ines Ede J cs (2011) tỷ lệ phát ấu trùng phương pháp Bearmann (72,5%) thấp phương pháp nuôi ấu trùng thạch (95%) Kết so sánh số tiêu như: lượng phân, thời gian, nhiệt độ phương pháp Baermann thu ấu trùng thạch nhằm tìm phương pháp đạt điều kiện nuôi lý tưởng thể bảng Bảng So sánh tiêu phương pháp thu ấu trùng Chỉ tiêu Nuôi ấu trùng thạch Baermann gram gram 24 - 48 48 - 96 Lượng phân Thời gian quan sát thấy ấu trùng Nhiệt độ Có thể thấy phương pháp ni ấu trùng thạch có thời gian quan sát thấy ấu trùng ngắn lượng phân sử dụng cho phương pháp so với phương pháp Baermann Tương tự, nghiên cứu khác chứng minh phương pháp ni ấu trùng thạch có khả thu nhanh số lượng ấu trùng so với phương pháp Baermann Harada-Mori (Reiss cs., 2007) Thời gian ủ lâu làm tăng hiệu việc phát ấu trùng, cụ thể ngày thí nghiệm Jongwutiwes (1999) Tại Việt Nam, phương pháp thường dùng để nuôi ấu trùng phịng thí nghiệm thú y Baermann Phương pháp nghiên cứu cải tiến để nâng cao hiệu việc thu ấu trùng (Chiejina S.N., 1982; Persson L., 1974) có nhiều hạn chế, số với mẫu cần xét nghiệm phải kèm hệ thống ni riêng cồng kềnh, thời gian để ấu trùng nở dài độ nhạy thấp Trong đó, phương pháp ni ấu trùng thạch tiến hành với số lượng mẫu lớn, thu ấu trùng với tỷ lệ cao mà số phương pháp chẩn đốn thơng thường khó để phát (Kotze AC cs., 2004), hệ thống ni đơn giản, tiết kiệm chi phí, thao tác dễ dàng, thu toàn ấu trùng mà không bị lẫn tạp bẩn Điều có ý nghĩa việc cung cấp lượng lớn kháng nguyên tinh dễ dàng, giúp chủ động cung cấp nguyên liệu, rút ngắn thời gian kinh phí cho nghiên cứu sâu để chẩn đốn sớm bệnh giun móc truyền lây sang người, điều chế chế phẩm sinh học ứng dụng điều trị KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVII SỐ - 2020 Hơn nữa, phương pháp thạch cho phép quan sát chuyển động ấu trùng bề mặt thạch Để so sánh hình thái ấu trùng giun móc phương pháp, hình ảnh chụp lại sau thu thể hình A Hình Hình thái ấu trùng giun móc thu phương pháp nuôi ấu trùng thạch (A) phương pháp Baermann (B), (vật kính 10X) Khơng có khác biệt rõ ràng hình thái ấu trùng giun móc thu từ phương pháp, nhiên ấu trùng thu phương pháp thạch có khả di động mạnh, cịn lơ thu phương pháp Baermann ấu trùng chuyển động chậm khơng chuyển động Do đó, ngồi việc hỗ trợ phát ấu trùng phân (Hailegebriel cs., 2017), phương pháp thạch ứng dụng để kiểm tra tác động loại thuốc ngừa ký sinh trùng lên phát triển giun móc, kiểm tra kháng thuốc loài (Tritten cs 2011; Kopp cs., 2008) trùng (Braga, 2009) Việc ứng dụng phương pháp nuôi ấu trùng thạch hữu ích để xác định yêu cầu sinh trưởng phát triển giun móc, dễ dàng mô tả tác động hợp chất từ vi khuẩn thể vật chủ ấu trùng (Reiss cs., 2007) Cụ thể, điều chỉnh nhiệt độ bổ sung điều kiện cần thiết khác cho phát triển ấu trùng bổ sung vi khuẩn để làm nguồn thức ăn cho ấu trùng (McCoy, 1929) hay hạn chế phát triển nấm môi trường nuôi phát triển nấm môi trường khiến ấu trùng bị bắt giữ sợi nấm, từ làm giảm khả di chuyển thu nhận thức ăn ấu Trong tổng số 122 mẫu xét nghiệm, tỷ lệ phát giun móc phương pháp nuôi cấy thạch 47,54%, cao đáng kể so với phương pháp Baermann (6,56%) Ngoài ra, phương pháp ni ấu trùng thạch có thời gian quan sát thấy ấu trùng ngắn lượng phân sử dụng cho phương pháp so với phương pháp Baermann truyền thống Từ ưu điểm trên, khuyến nghị đưa phương pháp thạch ứng dụng rộng rãi phịng thí nghiệm ký sinh trùng Bên cạnh đó, nghiên cứu giun tròn đòi hỏi việc trì vịng đời để xác định đặc tính hóa sinh, phân tử dinh dưỡng liên quan đến giai đoạn giun trịn điều kiện phịng thí nghiệm Phương pháp thạch ni ấu trùng từ giai đoạn trứng phân đến giai đoạn gây nhiễm (L3), quan sát biểu không biểu gen mục tiêu trình phát triển giun trịn nói riêng lồi ký sinh trùng khác nói chung IV KẾT LUẬN Lời cảm ơn: Cảm ơn môn Ký sinh trùng trường Đại học Miyazaki chuyển giao phương pháp thạch phát ấu trùng KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVII SỐ - 2020 TÀI LIỆU THAM KHẢO Arakaki, T., M Iwanaga, F Kinjo, A Saito, R Asato, and T Ikeshiro, 1990 Ef cacy of agar plate culture in detection of Strongyloides V D LV infection International Journal for Parasitology; 76: 425–428 Buonfrate, D; Formenti, F; Perandin, Fand Z Bisof , 2015 Novel approaches to the diagnosis of Strongyloides stercoralis infection Clinical Microbiology and Infection, Volume 21(6) Chiejina SN, 1982 Evaluation of modi ed Baermann apparatus for the recovery of infective trichostrongylid larvae from herbage samples Journal of Helminthology; 56: 105 – 109 F.R Braga, R.O Carvalho, J.M Araújo, A.R Silva, J.V Araújo, W.S Lima, A.O Tavela, S.F Rodrigo, 2009 Predatory activity of the fungi Duddingtonia agrans, Monacrosporium thaumasium, Monacrosporium VL V and Arthrobotrys robusta on Angiostrongylus vasorum rst stage larvae Journal of Helminthology; 83: 303 - 308 Hailegebriel T, Petros B, Endeshaw T., 2017 Evaluation of Parasitological Methods for the Detection of Strongyloides Stercoralis among Individuals in Selected Health Institutions in Addis Ababa, Ethiopia L SLD Journal of Health Sciences; 27 (5): 515–522 Ines Ede J, Souza JN, SantosRC, Souza ES, Santos FL, Silva ML, 2011 Ef cacy of parasitological methods for the diagnosis of Strongyloides V D LV and hookworm in faecal specimens D S; 120(3): 206 – 210 Jongwutiwes, S., Charoenkorn, M., Sitthichareonchai, P., Akaraborvorn, P., & Putaporntip, C., 1999 Increased sensitivity of routine laboratory detection of Strongyloides stercoralis and hookworm by agar-plate culture Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene; 93(4): 398–400 Jucelene Marchi Blatt and Geny Aparecida Cantos, 2003 Evaluation of Techniques for the Diagnosis of Strongyloides stercoralisn Human Immunode ciency Virus (HIV) Positive and HIV Negative Individuals in the City of Itajaí, Brazil The Brazilian Journal of Infectious Diseases; 7(6):402-408 Kopp, S R., Coleman, G T., mccarthy, J S., & Kotze, A C., 2008 Application of L L anthelmintic sensitivity assays to canine parasitology: Detecting resistance to pyrantel in Ancylostoma caninum L D Parasitology, 152(3-4): 284–293 10 Kotze AC, Clifford S, O’Grady J, Behnke JM, McCarthy JS., 2004 An L L larval motility assay to determine anthelmintic sensitivity for human hookworm and Strongyloides species American Journal of Tropical Medicine and Hygiene ; 71: 608 – 616 11 McCoy, O R., 1929 The growth of hookworm larvae on pure cultures of bacteria L , 69 (1777): 74–75 12 Persson L., 1974 A modi ed baermann apparatus for the recovery of infective nematode larvae from herbage and manure Zentralbl Veterinarmed; 21: 483 – 488 13 Reiss, D., Harrison, L.M., Bungiro, R., Cappello, M., 2007 Short report: an agar plate method for culturing hookworm larvae: analysis of growth kinetics and infectivity compared with standard coproculture techniques American Journal of Tropical Medicine and Hygiene; 77 (6): 1087–1090 14 Tritten, Lucienne et al., 2011 , L and L L ef cacy of Monepantel (AAD 1566) against laboratory models of human intestinal nematode infections PLoS neglected tropical diseases 5(12): e1457 15 World Health Organisation, 2020 Soiltransmitted helminth infections https://www who.int/news-room/fact-sheets/detail/soiltransmitted-helminth-infections Ngày nhận 15-2-2020 Ngày phản biện 26-3-2020 Ngày đăng 1-6-2020