Sắc ký cột SẮC KÝ BẢN MỎNG (TLC)

Bài Phân lập các hợp chất mẫu từ rau cũ bằng phương pháp sắc ký cột I Giới thiệu chung Ngày nay xu hướng sử dụng các thực phẩm sạch hạn chế sử dụng các hoá chất các nguồn để làm nguyên liệu hay tìm ki. SỬ DỤNG SẮC KÝ BẢN MỎNG (TLC) XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CHẤT MÀU TRONG RAU CỦ

Bài : Phân lập hợp chất mẫu từ rau cũ phương pháp sắc ký cột I Giới thiệu chung - Ngày xu hướng sử dụng thực phẩm hạn chế sử dụng hoá chất nguồn để làm nguyên liệu hay tìm kiếm, xác định hoạt tính hợp chất tự nhiên thực vật Đầu tiên ta cần phân lập hợp chất thực vật Bài thí nghiệm sử dụng phương pháp sắc ký cột - Trong phương pháp sắc ký cột có ba thành phần • Chất hấp phụ ( pha tĩnh) thường oxid nhôm, silicagel, CaCO3 , than hoạt tính, polyamid, Các chất phải tiêu chuẩn hố Ở sử dụng silicagel • Dung mơi rửa cột (pha động) loại riêng biệt hỗn hợp 2,3 loại dung mơi có tỷ lệ thích hợp • Dung dịch mẫu sau xử lý ( pha cố định ) -Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hay chất làm cho pha cố định nhồi ống hình trụ gọi “cột”, sử dụng buret làm cột Tuỳ theo tính chất chất sử dụng làm cột mà trình tách cột xảy chủ yếu theo chế hấp phụ ( cột hấp phụ), chế phân bố ( cột phân bố) hay chế trao đổi ion ( cột trao đổi ion) Ở sử dụng sắc ký cột hấp phụ ♦ Nguyên tắc:  Sắc ký hấp phụ thực ống thuỷ tinh thẳng đứng gọi “ cột” với chất hấp phụ đóng vai trị pha tĩnh, dung mơi rửa cột đóng vai trị pha động II III chảy qua chất hấp phụ Đối với chất riêng biệt hỗn hợp, tuỳ theo khả hấp phụ khả hồ tan đối vói dung mơi rủa cột để lấy trước sau  Việc lựa chọn kích thước cột quan trọng Thơng thường cột có đường kính nhỏ chiều dài dài tách tốt Thiết bị hoá chất Thiết bị - Cột sắc ký ( buret) - Erlen 50ml - Cốc 100ml - Giá đỡ - Pipet 10ml Hoá chất - Silicagel - Dung dịch Cloroform : ethanol (15:1 ) - Cồn 96 Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị cột - Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất sấy khơ - Cho bơng gịn vào đáy cột - Kẹp cột thẳng đứng giá Cho chất hấp phụ vào cột thường gọi nhồi cột Có hai cách nhồi cột: nhồi cội khơ nhồi cột ướt.Tiến hành nhồi cột ướt chất hấp phụ silicagel: - Lắc, trộn bột hấp phụ với dung mơi thành hỗn hợp dịch, rót vào cột Chất hấp phụ lắng tự nhiên xuống đáy cột Hỗn hợp dịch không nên sệt để tránh bọt khí giữ cột khơng nên q lỏng để rót vào cột - Chiều cao hỗn hợp lắng xuống đáy nên khoảng 5, cm Chuẩn bị mẫu - Cho lượng nhỏ cải vào cối với 10ml cồn 960 Nghiền nhỏ - Lọc lấy dịch - Đem dịch sấy 110 C đến dịch sệt lại Triển khai sắc ký cột - Đưa chất phân tích vào cột chuẩn bị - Cho dung môi cồn 96 vào cột Giai đoạn gọi rửa cột ( giải ly chất khỏi cột) Tuỳ thuộc vào chất hấp phụ dùng yêu cầu cốt độ chảy mà tiến hành rửa cột áp suất thường rửa cột áp suất nén sử dụng rửa cột áp suất thường nghĩa dung môi chảy nhờ trọng lực Kiểm tra khả phân tách mỏng Thực tương tự bước sắc ký mỏng Kết thí nghiệm - IV  Bắt đầu rửa Mẫu sau kiểm tra cột mỏng Công thức : Rf = a/b Trong đó: Sau rửa cột -  Rf: Mức độ di chuyển chất phân tích a: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu thử, tính cm b: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung mơi chạy, tính cm Kết tính tốn: Rf= 3.9/4.2=0.93 Dựa vào kết ta thấy Rf= 0.93 q lớn khơng tách hợp chất màu cải Một số nguyên nhân dẫn đến khơng tách mẫu do: - Khi nhồi cột pha hỗn hợp chất hấp phụ dung môi lỏng - Khi chuẩn bị cột cho vào cột nhiều - Do dung môi phân tách không chuẩn BÀI SỬ DỤNG SẮC KÝ BẢN MỎNG (TLC) XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CHẤT MÀU TRONG RAU CỦ I GIỚI THIỆU CHUNG Sắc ký mỏng (TLC) số phương pháp sắc ký phổ biến với pha tĩnh lớp mỏng hạt hấp thụ (silica gel) tráng mỏng bề mặt nhựa rắn ( nhựa nhôm) Một lượng nhỏ mẫu triển khai gần đáy TLC đặt pha động (dung môi hexan) Dung môi thấm từ đáy TLC lên phía đầu nhờ vào tượng mao dẫn Sự phân tách hợp chất xảy dựa vào khác thành phần hóa học tính chất vật lí, tương tác với pha tĩnh pha động với mức độ khác Yếu tố trì hỗn, giá trị Rf sử dụng để mô tả so sánh thành phần mẫu khác Các hợp chất màu quả, hoa, phân tách xác định cách sử dụng sắc ký mỏng (TLC) Các sắc tố xanh gội chất diệp lục đóng vai trị phân tử hấp thụ ánh sáng Carotenoid chất màu vàng hỗ trợ thực vật q trình quang hợp Ngồi ra, xanthrophy 11 có lục lạp cô lập xác định kỹ thuật sắc ký II DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT TLC silica gel Rau chân vịt Chlorofom Capillary tubes Hexane Pestle Acetone Thin stemmed pipets III QUÁ TRÌNH TIẾN HÀNH IV Bước 1: xử lí mẫu Giã nhuyễn mẫu rau chân vịt Thêm 22ml aceton Lọc lấy dịch Sấy 100℃ 15 phút Cho dịch sấy vào ống nghiệm thêm 2ml hexam - Bước 2: chuẩn bị mỏng V Cắt mỏng theo tỉ lẹ 3*4cm Sấy mỏng 105℃ 30 phút Kẻ đường ngang song song cách đáy 0.5cm Chấm điểm đường kẻ - Bước 3: pha dung môi sắc ký chạy mẫu VI Pha chlorofom:ethanol tỉ lệ 4.8 : 0.2ml Chấm mẫu lên sắc ký sấy khô, lập lại thao tác lần Cho sắc ký vào bình chứa dung mơi đậy kín KẾT QUẢ - VII VIII Quan sát sắc ký thấy vạch màu xuất gần đỉnh mỏng dùng kẹp gắp IX Để dung môi mỏng bay toàn X Quan sát vạch màu chạy sắc ký XI Sử dụng máy quang phổ để xem kỹ màu chạy sắc ký XII XIV Hình 1: vạch màu xuất sắc ký XV XVI XVII XVIII Hình 2: quan sát sắc ký máy quang phổ Cách xác định giá trị Rf: XIX XX Vậy từ kết ta tính giá trị Rf mẫu rau chân vịt: XXI Rf = = = XXII XXIII Bài Xác định hàm lượng protein thô Lý thuyết: XXIV Protein hình thành từ nhiều nguyên tố Carbon, Hydrogen, Nitrogen, Oxygen… nitrogen chiếm tỷ lệ tương đối cao ổn định (chiếm khoảng 15-17% khối lượng phân tử protein) Hàm lượng Protein thô nguyên liệu định lượng gián tiếp cách xác định hàm lượng Nitrogen tồn phần có mẫu Từ lượng nitrogen tồn phần có nhân với hệ số bảng quy đổi theo FAO/WHO-1973, có lượng protein tương ứng thực tế nguyên liệu, bên cạnh Protein cịn có chất hữu khác có chứa Nitrogen Amid, Alkaloid, Ammoniac (thí dụ thực phẩm lên men)… Do hàm lượng nitrogen tồn phần thức thường cao lượng Nitrogen có Protein XXV Tùy theo nguồn gốc protein mà người ta sử dụng hệ số trung bình protein để tính khối lượng protein Hệ số protein động vật trung bình 6,25 thực vật 5,96 Theo tiêu chuẩn FAO/WHO-1973, ta có bảng hệ số tính tốn sau: Chất xác định XXVII Hệ số protein (F) XXVIII Ngũ cốc – lúa mì XXXII 5,7 XXIX Gạo XXXIII 5,95 Sữa sản phẩm chế biến XXXIV 6,38 XXXI Thực phẩm khác XXXV 6,25 Nguyên tắc: Phương pháp Kjeldahl phương pháp định lượng nitrogen toàn phần đơn giản tương đối xác dựa nguyên tắc vơ hóa ngun liệu H2SO4 đậm đặc chất xúc tác Lấy sản phẩm đem kiềm hóa NaOH KOH để thu muối amoni tương ứng Dùng hệ thống chưng cất đạm Kjeldahl để thu khí NH3 Định lượng NH3 acid H2SO4, từ suy lượng nitrogen tồn phần có mẫu XXVI XXX XXXVI a) Thực hành: Dụng cụ: XXXVII Hệ thống Microkjeldahl: XXXVIII Bình định mức 100ml: Giá đỡ burette 25ml: XL Burette 25ml: XLI Pippette 10ml: XXXIX XLII Erlen 250ml: XLIII Cốc 250 ml: XLIV Cốc 100ml: XLV b) - XLVI - c) XLVII XLVIII Đũa thủy tinh: cái Hóa chất H2SO4 đđ (98,72% có d=1,84) Chất xúc tác, dùng hỗn hợp xúc tác sau đây: 1) K2SO4: 50g CuSO4: 3,5g 2) K2SO4: 100g CuSO4: 10g 3) K2SO4: 100g CuSO4: 10g 4) Seleni bột: 1g HgO: 10g (giải phóng Hg độc) Dung dịch Sodium hydroxide NaOH 0,01N Dung dịch Sodium hydroxide NaOH 30% Chỉ thị màu: dùng Alizarin natri sunfonat, phenolphatalein màu Tashiro Cách pha thị mày Tashiro: Dung dịch A: metyl đỏ 0,001g + cồn 96o vừa đủ 100ml, hịa tan nồi cách thủy sơi Dung dịch B: dung dịch Metylen xanh 1% nước 4ml + cồn 960 vừa đủ 100ml Tỷ lệ pha trộn sử dụng 1:1 với dung dịch a B hỗn hợp thị mày có màu xanh lục pH = 5,5, chuyển thành màu tím pH>5,5 Chuyển màu gian đoạn màu xám bẩn pH = 5,5 Trong trường hợp chuyển màu không rõ ràng thay đổi tỷ lệ pha chế hai dung dịch cho chuyển màu không rõ ràng thay đổi tỉ lệ pha chế hai dung dịch cho chuyển màu màu xanh lục giảm từ từ, thêm giọt dung dịch chuẩn NaOH 0,1N làm màu chuyển sang xám bẩn đột ngột thêm giọt màu chuyển sang tím Dung dịch acid boric bão hịa có pH=5,5: hịa tan 40g acid boric vào lít nước nóng, sau để nguội, cho thêm nước vừa đủ lít Điều chỉnh pH: 5,5 NaOH 0,1N (khoảng 13ml) với hỗn hợp thị màu Tashiro màu xanh bẩn Dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N Phương pháp tiến hành: *Vô hóa mẫu: - Cân thật xác khoảng 1g thực phaamrtrong thí nghiệm sử dụng 2ml nước mắm) cho vào bình Kjeldahl với H2SO4 đậm đặc khoảng 5g chất xúc tác - Để nghiêng bình Kjeldahl bếp có lưới Amiăng đun từ từ bếp điện L - Nếu thực phẩm chứa nhiều nước, đun nước bốc hình thành khói trắng SO2 Khi tan bọt, đun sôi dung dịch suốt khơng màu có màu xanh lơ CuSO4, để nguội LI d) Chưng cất: LII Chuẩn bị bình hứng : hút 25ml H2SO4 0,1N cho vào erlen 100ml Lắp eerlen vào ống sinh hàn cho đầu ống sinh hàn ngập vào dung dịch Chuyển dung dịch vơ hóa vào bình định mức, rửa bình Kjeldahl hai lần với nước cất, nước rửa chuyển vào bình định mức, định mức đến 100ml, hút 10ml Sunfonat làm thị màu (hoặc với thị màu Tashiro) Sau cho thêm 10-15 ml NaOH 30% XLIX LIII LIV Cất kéo nước định lượng trực tiếp NH3 bay sang hòa tan bình hứng dung dịch H2SO4 0,1N Kết biện luận: Hàm lượng nitrogen toàn phần (g/100ml): LV LVI LVII LVIII Trong đó: N: số ml H2SO4 0,1N cho vào erlen trước để kết hợp với NH3 LIX n: Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ H2SO4 thừa LX P: thể tích mẫu thứ tính ml LXI K: Vđm/Vm với Vđm: thể tích bình định mức Vm: thể tích dung dịch cho vào Kendal LXII LXIII Hàm lượng nitrogen tồn phần có mẫu 48,36g/100ml, lượng nitrogen tồn phần có 1ml mẫu 0,4836g/ml Hàm lượng protein thơ có mẫu là: 0,4836 x 6,25 = 3,0225 (g/ml) LXIV Bài 5: Ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt lực enzyme α-amylase LXV Lý thuyết: Tiến hành: LXVI Lấy ống nghiệm đánh số từ tới Tiến hành thêm hóa chất theo bảng sau: LXVII Ống LXVIII nghiệ m LXXIII LXXIX LXXXV XCI XCVII CIII CIX CXV Na2H PO4 0,2M (ml) LXIX C6H8 O7 0,1M (ml) LXX pH đạt LXXI Tinh LXXII bột 0,2% (ml) Dịch chiết enzy me (ml) LXXIV 9,34 LXXV 10,66 LXXVI 4,6 LXXVII LXXVIII LXXX 10,30 LXXXI 9,70 LXXXII 5,0 LXXXIII LXXXIV LXXXVI 11,14LXXXVII 8.86 LXXXVIII 5,4 LXXXIX XC XCII 12,08 XCIII 7,92 XCIV 5,8 XCV XCVI XCVIII 13,22 XCIX 6,78 C 6,2 CI CII CIV 14,54 CV 5.46 CVI 6,6 CVII CVIII CX 16,46 CXI 3,54 CXII 7,0 CXIII CXIV Nhỏ giọt liugol lên mặt kính đồng hị, phút nhỏ dung dịch ống lên giọt thuốc thử liu gol Dùng đũy thủy tinh khuấy quan sát màu chúng Khi dung dịch ống âm tính với liugol (tức khơng cịn màu xanh) nhỏ giọt liugol vào tất ống nghiệm Kết biện luận: CXVI CXVII CXVIII CXIX CXX CXXI Ố CXXIII ng nghiệm CXXII CXXVI CXXVII CXXX CXXXI Màu CXXIV với liugol Kết CXXV Giải thích Xanh CXXVIII Enzyme CXXIX pH khơng thích hợp làm enzyme tím khơng hoạt bị bất hoạt, tinh bột cịn nên phản ứng động màu với liugol Xanh CXXXII Enzyme CXXXIII pH khơng thích hợp mực gần khơng enzyme hoạt động vơ hoạt động yếu CXXXV Xanh CXXXVI Enzyme CXXXVII pH chưa thích hợp, enzyme nhạt hoạt động hoạt động không mức tối đa mạnh ống nghiệm CXXXIX MàuCXL EnzymeCXLI pH thích hợp enzyme, enzyme vàng hoạt động hoạt động mức tối đa, tinh bột bị phân mạnh giải hồn tồn khiến khơng có phản ứng màu với liugol CXLIII Xanh CXLIV Enzyme CXLV Giống ống nghiệm nhạt hoạt động yếu ông nghiệm CXLVII Xanh CXLVIII Enzyme CXLIX Giống ống nghiệm mực gần không hoạt động CLI XanhCLII Enzyme CLIII Giống ống nghiệm tím khơng hoạt động Như vậy, pH có ảnh hưởng tới hoạt lực enzyme, độ pH = 5,8 mức pH mà enzyme α-amylase hoạt động tốt nhất, xa điểm pH này, hoạt lực enzyme yếu dần, cuối hồn tồn khơng hoạt động CXXXIV CXXXVIII CXLII CXLVI CL CLIV CLV Bài 9: xác định số acid Peroxid chất béo Xác định số 1.1 Lý thuyết: acid: Định nghĩa: số acid lượng mg KOH cần thiết để trung hòa acid tự chứa 1g chất cần thử CLVI Nguyên lý: Dùng NaOH 0,1N để trung hòa acid tự chất cần thử, với phenolphetalein làm thị màu CLVII 1.2 - Thực hành: a) Dụng cụ: Buret 25ml Giá đỡ buret Erlen 25ml Cốc 100ml ống đong 50ml - pipette 5ml b) Hóa chất: Cồn 960 Ether trung tính NaOh 0,1N Phemolphtalein 1% c) Phương pháp tiến hành: CLVIII Cân 5g dầu mỡ, hòa tan 50ml hỗn hợp gồm 25ml cồn 25ml ether trung tính Chuẩn độ NaOH 0,1N có màu hồng bền vững với phenolphtalein sau 30 giây CLIX Đối với loại tinh dầu có nhiều este dễ bị xà phịng hóa, ta sử dụng dung dịch NaOH 0,05N để chuẩn độ d) Kết giải thích: CLX Thể tích NaOh dùng để chuẩn độ 0,7ml CLXI Chỉ số acid: A= = CLXII Trong đó: CLXIII 5,61: số mg KOH tương ứng với 1ml NaOH 0,1N CLXIV a: số ml NaOH 0,1N sử dụng định lượng CLXV b: trọng lượng chất thử để định lượng (g) CLXVI (mg) lượng KOH cần để trung hòa acid tự chứa 1g chất thử 0,79mg Chất béo chưa bị oxi hóa nhiều => chất béo cịn tươi Sự hóa chất béo – Chỉ số Peroxid 2.1 Lý thuyết  Khi có mặt O2 khơng khí, acid béo có thành phần dầu mỡ acid béo khơng no dễ dàng bị hóa phần tạo thành peroxide Hiện tượng xảy làm dầu mỡ bị ôi hay bị khô CLXVII CLXVIII Việc xác định số peroxide dựa vào phản ứng sau: RC2O2H2R’-COOH + 2KI + 2CH3COOH -> RC2OH2-R’-COOH + I2 + 2CH3COOK + H2O CLXIX Lượng Iodine phóng thích chuẩn độ dung dịch natrithiosunfat: CLXX CLXXI Na2S2O3 + I2 -> 2NaI + Na2S4O6 2.2 Dụng cụ - hóa chất: 2.2.1 Dụng cụ: - Erlen 250ml - Erlen nút nhám - Bóp cao su - Ống đong - Buret 25ml - Becher 100ml 2.2.2 Hóa chất - EDTA 5% - Chroforom - Acid acetid - Dung dịch KI bão hòa (59,8g KI/100ml) - Na2S2O3 0,002N - Chỉ thị hồ tinh bột 1% 2.3 Thực hành - Cho vào erlen khoảng 100ml dầu thực vật - - Ở erlen bổ sung thêm 5ml EDTA 5% (cho dịng khí qua erlen này, dùng máy bơm) Sau thời gian giờ, lấy 5ml dung dịch dầu đem xác định số peroxide Thêm vào 30ml hỗn hợp Cloroform – acid acetid tỷ lệ 1:2 Lắc Thêm tiếp 1ml dung dịch KI bão hòa Đậy nắp Lắc hỗn hợp cẩn thận phút (thỉnh thoảng mở nắp), để yên phút bóng tối Thêm vào hỗn hợp khoảng 50ml nước cất Định phân iod dung dịch Na2S2O3 0,002N vài giọt thị hồ tinh bột 1% dung dịch màu xanh tím hồn tồn Nếu lượng Na2S2O3 0,002N dùng q nhiều chuẩn độ lại với dung dịch Na2S2O3 0,1N Đồng thời làm thí nghiệm kiểm chứng khơng có chất béo Nếu chuẩn màu trắng vượt qua 0,1ml Na2S2O3 phải pha lại hóa chất Kết giải thích: Erlen chứa mẫu dầu cần 0,5ml Na2S2O3 để chuẩn độ Erlen chứa 50ml nước cất không cần chuẩn độ Na2S2O3 => lượng Na2S2O3 0ml CLXXII = (mmol peroxide/1kg chất khử) CLXXIII Trong đó: 0,05: số milimol peroxide tướng ứng với 1ml Na2S2O3 chuẩn độ (dung dịch 1N) CLXXIV CLXXV V: Số ml Na2S2O3 0,002N dùng để chuẩn độ mẫu thử CLXXVI v: số ml Na2S2O3 0,002 N dùng để chuẩn độ mẫu trắng CLXXVII p: trọng lượng mẫu thử dùng để định lượng CLXXVIII 500: Là chuyển từ dung dịch 0,002N sang dung dịch 1N Chỉ số PoV thấp chứng tỏ độ ôi mẫu chất béo mang phân tích thấp => chất béo cịn tươi CLXXIX - Mẫu không chứa dầu không cần Na2S2O3 để chuẩn độ => chứng minh khơng có chất béo => khơng có I2 tạo để phản ứng màu với tinh bột CLXXX CLXXXI  ... DỤNG SẮC KÝ BẢN MỎNG (TLC) XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CHẤT MÀU TRONG RAU CỦ I GIỚI THIỆU CHUNG Sắc ký mỏng (TLC) số phương pháp sắc ký phổ biến với pha tĩnh lớp mỏng hạt hấp thụ (silica gel) tráng mỏng. .. mẫu lên sắc ký sấy khô, lập lại thao tác lần Cho sắc ký vào bình chứa dung mơi đậy kín KẾT QUẢ - VII VIII Quan sát sắc ký thấy vạch màu xuất gần đỉnh mỏng dùng kẹp gắp IX Để dung môi mỏng bay... toàn X Quan sát vạch màu chạy sắc ký XI Sử dụng máy quang phổ để xem kỹ màu chạy sắc ký XII XIV Hình 1: vạch màu xuất sắc ký XV XVI XVII XVIII Hình 2: quan sát sắc ký máy quang phổ Cách xác định