KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN BACILLUS N6.1 ĐỐI KHÁNG EDWARDSIELLA ICTALURI GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN BACILLUS N6.1 ĐỐI KHÁNG EDWARDSIELLA ICTALURI GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực MSSV: 107111217 : MAI NGỌC TUYỀN Lớp: 07DSH4 TP Hồ Chí Minh, 2011 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nuôi trồng thủy sản mạnh Việt Nam Tính đến thời điểm này, kim ngạch xuất thủy sản Việt Nam đạt tỷ USD với 843.000 thủy sản loại Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn dự báo, giá trị xuất thủy sản Việt Nam đến hết quý IV năm 2010 nhiều khả đạt mức 4,74 tỷ USD, riêng kim ngạch xuất cá tra chiếm ưu đạt khoảng 1,38 tỷ USD Sản lượng cá tra ngày gia tăng ln kèm theo phát sinh dịch bệnh Một bệnh quan trọng cá tra nuôi bệnh gan thận mủ, có số cơng trình nghiên cứu bệnh Và nguyên nhân gây bệnh xác định chủ yếu vi khuẩn E ictaluri (Crumlish ctv, 2002) Khi bệnh xảy ra, nông dân thường lạm dụng kháng sinh hóa chất diệt khuẩn để phòng bệnh điều trị cho cá việc tạo chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc (Schwarz ctv., 2001; Akinbowale ctv., 2006) Để thay phương pháp phòng bệnh truyền thống, phương pháp phòng trị bệnh liệu pháp sinh học sử dụng vaccine, chất kích thích miễn dịch, peptide kháng khuẩn, prebiotic (hợp chất tiền sinh học), đặc biệt phương pháp trị liệu sinh học vi sinh vật có lợi (probiotic) ngày ưa chuộng Việc sử dụng vi sinh vật thay kháng sinh để chữa bệnh trở thành bước tiếp cận đầy hứa hẹn nuôi trồng thủy sản Với ý nghĩa khoa học tính thực tiễn nêu chúng tơi tiến hành “Khảo sát số đặc tính vi khuẩn Bacillus N6.1 đối kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra” Đề tài thực Phịng thí nghiệm Vi sinh – Phịng Sinh học thực nghiệm – Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II 1.2 Tình hình nghiên cứu Trong năm 2010, Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II tiến hành phân lập, tuyển chọn dòng vi khuẩn có đặc tính đối kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra Nguồn vi sinh vật phân lập từ hệ tiêu hóa, nước, bùn ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt ao nuôi cá tra nguồn vi sinh từ ngân hàng vi sinh Đã tiến hành đợt thu mẫu với tổng số mẫu 284 mẫu (hệ tiêu hóa, nước bùn), số khuẩn lạc sàng lọc qua AHLs 592, vi khuẩn lactic 120 khuẩn lạc, vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus 165 khuẩn lạc Một số nghiên cứu khác vi khuẩn probiotic có đặc tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh nuôi trồng thủy sản Sàng lọc vi khuẩn có đặc tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh cách tiếp cận sử dụng chủ yếu việc phân lập vi khuẩn probiotic Trong trình sàng lọc này, đa số nhà nghiên cứu áp dụng phương pháp xác định hoạt tính ức chế in vitro (Spangaard ctv., 2001; Chythanya ctv., 2002; Hjelm ctv., 2004) Hiện nay, có bốn phương pháp thường sử dụng để sàng lọc chủng vi khuẩn tiết hợp chất ức chế in vitro: phương pháp lớp kép (Dopazo ctv., 1988), phương pháp đục lỗ mặt thạch, phương pháp cấy ria vuông góc, phương pháp đĩa giấy khuếch tán Tất phương pháp dựa nguyên tắc chủng vi khuẩn sản xuất hợp chất ngoại bào có tính chất ức chế chủng vi khuẩn khác, hoạt tính thể thông qua việc ức chế tăng trưởng vi khuẩn khác mơi trường agar 1.3 Mục đích nghiên cứu Làm sở để tạo sản phẩm probiotic phù hợp có đặc tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ E ictaluri 1.4 Nội dung nghiên cứu  Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào  Khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ, NaCl lên tăng trưởng khả đối kháng với E.ictaluri Bacillus N6.1  Khảo sát khả chịu pH thấp muối mật  Khả phân huỷ phân tử tín hiệu N-Hexanoyl hemoserine lactone  Khảo sát chất đối kháng Bacillus N6.1 lên phát triển E ictaluri phương pháp nuôi chung (co-culture) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt CHƯƠNG II: TỒNG QUAN 2.1 Tình hình ni cá tra Đồng Bằng Sơng Cửu Long Trong năm gần đây, nghề nuôi thủy sản nước phát triển nhanh có nhiều bật Hiện Đồng sông Cửu Long, diện tích ni cá tra khơng lớn (năm 2009 5540 ha) sản lượng hàng năm cho 1.000.000 Năm 2010, tình hình sản xuất, tiêu thụ cá tra vùng ĐBSCL có nhiều biến động Đến hết tháng 11/2010, tổng sản lượng sản xuất cá tra toàn vùng đạt gần 2,4 tỉ cá giống, diện tích thả ni 5.420 ha, đạt 90,3% kế hoạch năm; nhờ nâng cao suất (trung bình đạt 261,2 tấn/ha/vụ) nên sản lượng cá thu hoạch 1.141.000 tấn, đạt 95,1%/năm Sản lượng cá xuất đạt 600.000 tấn, kim ngạch xuất đạt 1,3 tỉ USD, giảm 2,8% lượng, 7,8% kim ngạch xuất so kỳ năm 2009 Dự kiến năm xuất đạt 645.000 tấn, kim ngạch xuất đạt 1,4 tỉ USD Đi sâu vào hình thức mơ hình ni, nghề ni cá tra có chuyển đổi từ mơ hình nước chảy lồng bè, đăng quần sông vùng thượng nguồn sơng Tiền sơng Hậu sang mơ hình ni ao dọc cồn bãi ven sông dịch chuyển phía hạ lưu với chất lượng cá tốt Tuy nhiên, tình hình sản xuất tiêu thụ cá tra thể thiếu bền vững, có nhiều nguyên nhân chủ yếu là:  Việc phát triển cá tra nhanh năm vừa qua, đơi vượt q quy hoạch ngành, vượt ngồi quản lý nhà nước dẫn đến cạnh tranh không lành mạnh việc tiêu thụ sản phẩm thị trường quốc tế  Sự không ổn định mặt cung cầu thiếu chế liên kết phối hợp chuổi hệ thống dẫn đến hệ lụy biến động giá thị trường, chất lượng sản phẩm, ô nhiễm môi trường, phá sản người nuôi  Với số lượng lên đến tỉ giống hàng năm việc quản lý đàn cá bố mẹ trại sản xuất thời gian dài vừa qua chưa thật quan tâm mặt quản lý hổ trợ mặt kỹ thuật Hệ dẫn đến chất lượng giống cá tra có ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt biểu giảm sút, tốc độ tăng trưởng chậm hơn, dể nhiễm bệnh trình ương nuôi, tỉ lệ hao hụt cao nuôi  Bệnh cá tra nuôi nguyên nhân gây hao hụt cho người ni Trong loại bệnh gan thận mủ, bệnh trắng gan, trắng mang bệnh gây thiệt hại to lớn cho người nuôi thiệt hại đến 20 – 30% sản lượng ao ni Ngồi bệnh nội ngoại ký sinh tác nhân gây tổn thất cho ao nuôi  Vấn đề ảnh hưởng đến môi trường nuôi chất lượng môi trường nước cấp cho ao nuôi thách thức ổn định bền vững nghề nuôi cá tra Việc giải chất thải nước thải từ ao nuôi cá tra thách thức lớn, đỏi hỏi phải có giải pháp công nghệ kỹ thuật để đảm bảo bền vững môi trường  Vần đề thị trường tiêu thụ cá tra, tương tự với sản phẩm tôm nuôi, chất lượng sản phẩm chế biến đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm đáp ứng yêu cầu truy xuất nguồn gốc nhà nhập đặt việc sản xuất, chế biến, bảo quản xuất sản phẩm cá tra.(Oanh Lê - Nguồn viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II) Hình 2.1: Thu hoạch cá tra ĐBSCL ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 2.2 Giới thiệu vi khuẩn Edwardsiella spp bệnh gan thận mủ cá tra 2.2.1 Vi khuẩn Edwardsiella spp 2.2.1.1 Phân loại Phân loại khoa học, Edwardsiella thuộc: Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Edwardsiella thường gặp hai loài gây bệnh là: E.tarda E.ictaluri E.tarda tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn cá nước ấm, đặc biệt cá da trơn E ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn quan nội tạng gan, thận, tụy cá không vảy, gây bệnh nhiễm trùng đường ruột cá da trơn Mỹ, tác nhân gây bệnh gan thận mủ cá tra Việt Nam Edwardsiella thường gây bệnh động vật máu lạnh: rắn, cá sấu, cá… số động vật thủy sản khác Ở Việt Nam phân lập E.tarda từ cá trê giống; E.ictaluri từ cá tra, cá basa… Bệnh gây thiệt hại ao nuôi cá hương (cỡ từ 4-6cm) đến 5-6 tháng tuổi, xuất cá có kích cỡ 15cm, tỷ lệ tử vong cá từ 60-70%, có trường hợp tới 100% Bệnh xuất nhiều vào mùa xuân, mùa thu ao nuôi mật độ cao, ni cá lồng bè A B Hình 2.2: Vi khuẩn E.ictaluri (hình A) cá tra bị bệnh nhiễm Edwardsiella (hình B) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 2.2.1.2 Đặc điểm sinh hóa Theo Hawke ctv (1981) Edwardsiella ictaluri, lồi thuộc Enterobacteriacea, Gram âm, hình que, ngắn, kích thước 0.75x1.5-2.5μm Di động yếu 25-300C, khơng di động nhiệt độ cao hơn, catalase dương tính, cytochrome oxidase âm tính lên men glucose (Shott, 1989) Khơng sinh H2S Indole âm tính Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phát triển chậm môi trường BHI (36-48 28-300C) Ở Việt Nam, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh chủ yếu cá tra (ở tất giai đoạn phát triển) Tỷ lệ hao hụt lớn cá tra giống, gây thiệt hại kinh tế lớn giai đoạn cá tra thịt cỡ 300-500g ( Thanh Dung ctv., 2004) Theo Ferguson ctv (2001), bệnh ghi nhận xuất ĐBSCL vào cuối năm 1998 có tên BNP (Bacilliaty Necrosis of Pangaius) Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập cá tra nuôi bè Việt Nam, với dấu hiệu có nhiều nốt trắng gan (Thanh Dung ctv., 2005) 2.2.2 Bệnh gan thận mủ cá tra 2.2.2.1 Lịch sử phát Bệnh gan thận mủ cá tra xuất lần vào cuối năm 1998, tác nhân gây bệnh lúc đầu xác định nhóm nghiên cứu trường Đại học Stirling phối hợp với trường Đại học Cần Thơ Bacillus sp (Ferguson ctv., 2001) Đến năm 2002 nhóm nghiên cứu đính lại tác nhân gây bệnh gan thận mủ cá tra vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Crumlish ctv., 2002) E ictaluri báo cáo cá nheo Mỹ, Ictalurus punctatus (Hawke, 1979) E ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính cá da trơn, hội chứng gọi tắt ESC (Enteric Septicaemia of Catfish) dẫn đến tỉ lệ chết cao cá nheo Mỹ (Austin Austin, 1999) Bệnh tìm thấy nơi nuôi cá nheo nước Mỹ Bệnh xảy tất kích cỡ cá nuôi tập trung giai đoạn cá hương cá giống ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt (USDA/APHIS, 2003) Bệnh xảy theo mùa, đặc biệt xảy thường xuyên nhiệt độ nước nằm khoảng 20 – 29oC (Tucker ctv., 2004) Cá bị bệnh ESC thường giảm ăn, lờ đờ, bơi dạng xoay vòng, xuất huyết xung quanh vùng miệng phần bụng Nhiều vết lở loét nhỏ màu trắng xuất bề mặt da Cá nhiễm bệnh thường Các bệnh thường gặp cá tra giống thịt lồi mắt bụng trương to Bệnh vi khuẩn Bệnh xuất huyết: Aeromonas hydrophila, Clostridium botulinum, Pseudomonas spp., Edwardsiella tarda: mass mortality: 70-80% Edwardsiella ichtaluri gây bệnh gan thận mủ Tỉ lệ chết cao: 80-100% Bệnh ký sinh trùng: Cryptobia spp., Ichthyophthyrius multifiliis, Trichodina, Epistylis - tỉ lệ chết: 15-20% Hình 2.3: Các bệnh thường xuyên xuất cá tra qua giai đoạn nuôi (Lý Thị Thanh Loan ctv., 2007) 2.2.2.2 Dấu hiệu bệnh lý Xuất vết thương nhỏ da (phía mặt lưng), đường kính khoảng 35mm Những vết thương phát triển thành khối u rỗng bên làm cho da bị sắc tố Cá mắc bệnh chức vận động vây bị rách, gẫy Có thể xuất vết thương bên biểu bì, cơ, ấn vào phát khí có mùi hôi Các vết thương gây hoại tử vùng xung quanh Bệnh xuất ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt chất lượng nước môi trường nuôi xấu, nuôi với mật độ dày Nhiệt độ thích hợp để phát triển khoảng 300C 2.2.2.3 Một số nghiên cứu biện pháp phịng bệnh gan thận mủ Có nhiều nghiên cứu giới lĩnh vực sản xuất vaccine phòng bệnh E ictaluri gây cá da trơn Shoemaker ctv (1999) nghiên cứu ảnh hưởng ba loại vaccine sống cải tiến dạng đông khô (Immuno X+5, Immuno2 X+5, Serial 1A) loại vaccine sống truyền thống (RE-33) Cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) gây miễn dịch phương pháp ngâm ngày tuổi khác (từ ngày tuổi đến 31 ngày tuổi) Kết cho thấy hiệu lực vaccine thể từ cá gây miễn dịch giai đoạn ngày tuổi 10 ngày tuổi Tỉ lệ sống cá ngày tuổi gây miễn dịch dao động khoảng 58,4 – 77,5%, cá 10 ngày tuổi dao động khoảng 64,1 – 78,9% Ba năm sau đó, nhóm tác giả nghiên cứu phương pháp in vivo việc sử dụng loại vaccine sống cải tiến này, gây miễn dịch từ giai đoạn trứng cá nheo Mỹ, phương pháp ngâm thời gian 10 phút Kết cho thấy phương pháp gây miễn dịch hiệu quả, với tỉ lệ bảo hộ khoảng 59,7% (Shoemaker ctv., 2002) Trong năm gần đây, số nhóm nghiên cứu quan tâm đến việc phát triển chế phẩm vi sinh (probiotic) số chế phẩm sinh học khác bổ sung vào thức ăn để phòng bệnh E ictaluri cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) Shelby ctv (2007) bổ sung hai loại chế phẩm vi sinh có chứa Pediococcus sp Enterococcus sp (riêng lẻ phối hợp với nhau) vào thức ăn cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) giống cho ăn vịng 5-8 tuần Sau tiến hành đo tiêu: tăng trọng, hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) thông số miễn dịch protein huyết thanh, immunoglobulin, lysozyme, complement Các số liệu vi sinh cho thấy hai chủng vi khuẩn probiotic tồn thức ăn sau bổ sung thời gian bảo quản khoảng tuần Tuy nhiên tác giả khơng tìm thấy khác biệt ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt tăng trọng, đáp ứng miễn dịch tính kháng bệnh cá sau thời gian cho ăn thức ăn có bổ sung probiotic Aboagye ctv (2008) thử nghiệm ảnh hưởng chế phẩm vi sinh Lymnozyme đến tỉ lệ sống cá nheo Mỹ sau gây nhiễm thực nghiệm với Edwardsiella ictaluri Kết nghiên cứu cho thấy, nghiệm thức có bổ sung Lymnozyme vào nước hàng ngày liên tục hai tuần, tỉ lệ chết cá sau gây nhiễm Edwardsiella ictaluri (45%) giảm cách có ý nghĩa thống kê (p = 0,002) so với nghiệm thức đối chứng (80%) Các nhà khoa học Nauy Mỹ nghiên cứu hiệu kháng khuẩn hai lọai peptide tổng hợp cecropin B cecropin P1 số chủng vi khuẩn gây bệnh cá, có E ictaluri (Kjuul ctv., 1999) Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cecropin B dao động từ 0,3-1,3 µm Các dẫn xuất cecropin B biết đến có họat tính kháng khuẩn nhiều lồi vi khuẩn gây bệnh, có khả tăng cường tính đề kháng cá nheo Mỹ gây cảm nhiễm với E ictaluri (Kelly ctv., 1993) Prebiotic hợp chất bổ sung vào thức ăn, có tác dụng kích thích sinh trưởng hoạt tính hệ vi khuẩn có lợi diện hệ tiêu hóa vật chủ (Delzenne & Roberfroid, 1994) Prebiotic thường sử dụng kết hợp với probiotic (gọi synbiotic) Các hợp chất đường mạch ngắn sử dụng phổ biến prebiotic bổ sung vào thức ăn thủy sản, số bao gồm: Inulin, fructoseoligosaccharide, transgalacto-oligosaccharide, lactulose (Mahious, 2005), isomaltooligosaccharide (Li ctv., 2009) Hiệu dinh dưỡng sức khỏe số oligosaccharide chứng minh cá (Glencross ctv., 2003; Li & Gatlin, 2005; Pryor ctv., 2003) Isomalto-oligosaccharide nồng độ 0,2% sử dụng kết hợp với vi khuẩn probiotic Bacillus OJ (108 cfu/g thức ăn) bổ sung vào thức ăn cho tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) giúp điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường phản ứng miễn dịch khả đề kháng virus đốm trắng, thông qua ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt hiệu ứng tương hỗ hai loại chế phẩm (Li ctv., 2009) Mannan-oligosaccharide (MOS), loại prebiotic chiết xuất từ nấm men, chứng minh có hiệu tăng cường đáp ứng miễn dịch tính đối kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus (Welker ctv., 2007) 2.3 Tổng quan probiotic nuôi trồng thủy sản 2.3.1 Định nghĩa probiotic Thuật ngữ probiotic bắt nguồn từ tiếng Hy lạp “probios” có nghĩa “cho sống” Qua thời gian với phát triển khoa học hiểu biết nhân loại thuật ngữ định nghĩa nhiều lần Vào năm 1965, Lilly Still định nghĩa probiotic nhân tố thúc đẩy phát triển sản xuất vi sinh vật Vào năm 1974, Parker định nghĩa probiotic dựa mối quan hệ vi sinh với vật chủ “probiotic sinh vật chất có lợi cho động vật có khả cải thiện hệ vi sinh đường ruột” Đến năm 1989, Fuller mở rộng định nghĩa probiotic: “probiotic sinh vật sống cung cấp dạng thức ăn cho động vật nhằm cải thiện cân hệ sinh vật đường ruột” Havenaar Huis Int Veld (1992) định nghĩa “probiotic chủng hay hỗn hợp vi sinh vật sống, cung cấp cho người động vật, có lợi cho vật chủ cách cải thiện đặc tính hệ vi sinh vật địa” Gatesoup (1999) định nghĩa “probiotic sinh vật sống cung cấp dạng thức ăn nhằm cải thiện sức khỏe cho vật chủ” FAO/WHO (2002), Reid cộng (2003) lại định nghĩa “probiotic vi sinh vật sống kiểm soát chặt chẽ, với lượng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ” Vào năm 2003, Jean Fioramonti cộng định nghĩa probiotic cách ngắn gọn đầy xúc tích: “probiotic định nghĩa vi sinh vật ảnh hưởng có lợi lên sức khỏe tốt cho vật chủ” 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt Trước đây, probiotic thường ứng dụng cho người động vật cạn, thuật ngữ probiotic thường ngụ ý vi khuẩn gram dương chủ yếu Lactobacillus sinh vật áp dụng làm probiotic ngày nhiều gồm vi khuẩn gram âm, gram dương, bacteriophage, nấm men tảo đơn bào, phạm vi sử dụng rộng hơn, người động vật cạn, probiotic ngày ứng dụng đối tượng động vật thủy sản Khác với người động vật cạn, động vật thủy sản bao bọc môi trường nước tác nhân gây bệnh tồn cách độc lập với vật chủ Những vi sinh vật gây bệnh hấp thụ liên tục vật chủ thông qua trình tiêu thụ thức ăn, động vật thủy sản tiêu hóa lượng lớn vi khuẩn từ mơi trường nước, kết mối tương tác tự nhiên khu hệ vi sinh môi trường đối tượng thủy sản Trong nuôi trồng thủy sản mối tương tác probiotic vật chủ không giới hạn đường ruột vật chủ, probiotic cịn hoạt động mang, da môi trường nước xung quanh vật chủ Do vậy, Verschuere cộng (2000) đề xuất định nghĩa cho phép mở rộng ứng dụng thuật ngữ probiotic nuôi trồng thủy sản “probiotic hỗn hợp vi sinh vật sống thêm vào có lợi cho vật chủ cách thay đổi nhân tố liên quan đến vật chủ quần xã vi sinh vật xung quanh, cải thiện khả sử dụng thức ăn giá trị dinh dưỡng, tăng cường chống chịu bệnh, cải thiện chất lượng môi trường sống vật chủ” 2.3.2 Đặc điểm chung probiotic  Có khả sống sót môi trường acid dày, tồn tạm thời hình thành khuẩn lạc ruột non  Khơng gây hại cho vật chủ  Probiotic phải tới vị trí cần tác động thể vật chủ  Biểu có lợi vật chủ (cạnh tranh đối kháng với sinh vật gây bệnh, sinh enzyme chế phẩm cuối mà vật chủ sử dụng được) 11 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt  Không chứa gen gây độc gen kháng kháng sinh 2.3.3 Các chế tác động probiotic Gia tăng khả bám đối kháng trực tiếp, ảnh hưởng có hại tác nhân gây bệnh yếu tố quan trọng probiotic để làm giảm tính gây độc suốt trình nhiễm bệnh Các chủng probiotic phải có đặc tính kháng lại vi khuẩn gây bệnh điều kiện in vitro lẫn in vivo thông qua số chế khác Đa số nghiên cứu probiotic công bố thập niên qua, có nhiều nghiên cứu giải thích chế tác động probiotic Nhìn chung, probiotic có chế tác động sau: 2.3.3.1 Sản sinh hợp chất ức chế Kháng khuẩn tượng phổ biến tự nhiên Vì vậy, tương tác vi sinh vật đóng vai trị quan trọng đảm bảo trạng thái cân vi sinh vật hữu ích vi sinh vật gây bệnh Những lồi vi khuẩn khác giải phóng số hợp chất hóa học có khả tiêu diệt kiềm hãm vi khuẩn khác để đấu tranh giành lấy lượng hay chất hóa học (Fredrickson Stephanopoulos, 1981) Những hợp chất bao gồm: bacteriocin, siderphore, lysozyme, protease, hydrogen peroxide acid hữu Vi khuẩn sinh acid lactic tạo hợp chất bacteriocin giúp ức chế vi khuẩn khác Có nhiều nghiên cứu in vitro chứng minh khả ức chế vi khuẩn gây bệnh số chủng vi khuẩn chọn lựa bổ sung vào môi trường ương ni ấu trùng Gaixa (1889) có báo cáo tồn vi khuẩn nước biển có khả ức chế Vibrio sp Sau đó, Rosenfeld Zobell (1947) mơ tả nghiên cứu sản sinh chất ức chế vi sinh vật biển kể từ nhiều nghiên cứu tiếp theo, theo hướng sử dụng vi sinh vật tác nhân kiểm soát sinh học Nogami Maeda (1992), Nogami ctv (1997) chứng minh vi khuẩn Thalasobacter utilis ức chế vi khuẩn Vibrio anguillarum, làm gia tăng khả sống sót ấu trùng cua xanh Portunus trituberculatus, đồng thời làm giảm số lượng Vibrio nước ương ấu 12 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt trùng Các nghiên cứu cho thấy chủng ngăn chặn phát triển vi khuẩn V angillarum cá bơn trưởng thành Scophthalmus maximus Limanda limanda Sử dụng V alginolyticus probiotic đề cập để tăng cường khả sống sót phát triển ấu trùng tôm chân trắng Litopenaeus vannamei trại nuôi Ecuador Gần chủng vi khuẩn nước mặn, Pseudomonas I2 phân lập từ cửa sơng, có khả sinh hợp chất ức chế lại Vibrio gây bệnh tơm Hợp chất kháng khuẩn chứng minh có khối lượng phân tử thấp, bền nhiệt, tan chloroform, kháng thủy giải ezyme (Chythanya cộng sự, 2002) 2.3.3.2 Cạnh tranh chất dinh dưỡng hay lượng sẵn có Đấu tranh giành lấy chất dinh dưỡng hay lượng có sẵn đóng vai trị quan trọng việc hình thành hệ vi sinh vật đường ruột hay môi trường ni thủy sản Minh chứng điển hình cho tác động vi khuẩn có khả sinh siderophore Tất vi khuẩn cần sắt để tăng trưởng, siderophore chất có trọng lượng phân tử thấp, có khả gắn với ion sắt Siderophore hịa tan sắt kết tủa thành dạng dễ sử dụng, cơng cụ thu lượm sắt hiệu Các chủng vi khuẩn vơ hại sản xuất siderophore sử dụng probiotic để cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh tính gây bệnh có liên quan đến việc sản xuất siderophore đấu tranh giành lấy phân tử sắt môi trường thiếu sắt giai đoạn cần thiết (Verchuere ctv., 2000) Chủng Vibrio E cải thiện khả đề kháng vi khuẩn gây bệnh Vibrio P, Vibrio splendidus ấu trùng cá bơn Nghiên cứu in vitro cho thấy rằng, Vibrio E phát triển môi trường bị tách hết sắt Vibrio P khơng Hơn nữa, cá bơn bột cho ăn rotifer làm giàu chất siderophore deferoxamine Vibrio E đạt tỉ lệ sống cao sau gây nhiễm với Vibrio P, so với lô đối chứng (Gatesoupe, 1997) Từ kết có liên quan thí nghiệm in vitro in vivo, nhà khoa học kết 13 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt luận hiệu probiotic Vibrio E phần đấu tranh giành lấy phân tử sắt với tác nhân gây bệnh 2.3.3.3 Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại Khả hình thành khuẩn lạc khả bám dính probiotic biểu mô ruột lớp nhầy đường ruột vật chủ chế bảo vệ vật chủ chống lại tác nhân gây bệnh thông qua cạnh tranh thụ quan bám dính, dinh dưỡng khơng gian, oxy sản sinh chất kháng khuẩn Một số chế liên quan đến bám dính vi sinh vật lên tế bào biểu mô ruột bao gồm: Liên kết hydro, tương tác tĩnh điện, vị trí gắn dựa cấu trúc chuyên biệt Những đặc tính mạnh cạnh tranh quan trọng giúp trì vi khuẩn đường ruột động vật Các yếu tố ảnh hưởng tới hình thành khuẩn lạc vi sinh vật phụ thuộc vào:  Mối quan hệ với vật chủ như: nhiệt độ thể, enzyme, đặc tính kháng di truyền Ví dụ, vi khuẩn theo nguồn nước thực phẩm đến miệng đóng góp vào q trình dinh dưỡng, số chủng giữ lại trở thành quần cư vi khuẩn đường ruột Những chủng cịn lại bị tiêu diệt thơng qua q trình tiêu hố bị loại thải thơng qua q trình tiết Ngoài ra, sinh trưởng vi khuẩn đường ruột cịn bị ức chế hợp chất kháng khuẩn tiết từ vật chủ  Các yếu tố có mối quan hệ với vi sinh vật như: ảnh hưởng hợp chất kháng khuẩn, protease, bacteriocin, hydrogen peroxide, hình thành NH3, diacetyl, biến đổi pH sản sinh acid hữu  Các nghiên cứu gần chứng minh chủng Lactobacillus plantarum có khả bám dính hình thành màng nhầy bên đường ruột, chủng sử dụng vị trí gắn chuyên biệt manose để cạnh tranh vị trí gắn với chủng gram âm gây bệnh lớp nhầy đường ruột cá Ngoài ra, hình thành khuẩn lạc khả bám dính probiotic đóng vai trị quan trọng điều hịa kích thích hệ thống miễn dịch tế bào chủ 14 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 2.3.3.4 Đóng góp mặt dinh dưỡng enzyme tiêu hóa Một số nghiên cứu vi sinh vật ảnh hưởng có lợi cho q trình tiêu hóa động vật thủy sản: khử độc hợp chất độc hại thức ăn, phân hủy hợp chất khó tiêu chitin, cellulose…trong thức ăn nhờ enzyme thủy giải (cellulase, amylase…) Ngoài probiotic cung cấp vitamin (biotin vitamin B12), carotenoid, protein, acid béo chuỗi ngắn chuỗi acid béo khơng bão hịa (PUFAs-polyunsaturated fatty acids) eicosapentaenoic acid (EPA) docosahexaenoic acid (DHA) cần thiết cho sinh trưởng cá Ở mức độ in vivo, có nhiều báo cáo cho cho cá ăn probiotic nồng độ từ 103-1012 cfu/g thời gian từ 30-90 ngày gia tăng tỷ lệ sống sót, tăng trọng, giảm hệ số chuyển đổi thức ăn Ở cá, có báo cáo cho Bacteroides Clostridium đóng góp mặt dinh dưỡng cho vật chủ đặc biệt cung cấp acid béo vitamin Một số vi sinh vật Agrobacterium sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp., Microbacterium sp., Staphylococcus sp đóng góp vào q trình tiêu hóa cá hồi chấm hồng Bắc cực (Salvelinus alpinus L.) Một số chủng Bacillus (Bacillus licheniformis, B subtilis, B polymixa, B laterosporus B circulans) thúc đẩy tăng trưởng ấu trùng cá tầm Acipenser nudiventris: tăng chiều dài khối lượng, tăng hệ số chuyển đổi thức ăn, tăng hệ số tăng trưởng đặc hiệu (Specific Growth Rate) Ngồi số vi khuẩn cịn tham gia vào q trình tiêu hóa lồi nhuyễn thể hai mảnh vỏ cách sản sinh enzyme ngoại bào protease, lipase, đồng thời cung cấp nhân tố dinh dưỡng cần thiết Những nghiên cứu tương tự cho thấy hệ vi sinh vật khu trú tôm Penaeus chinensis bổ sung nguồn enzyme tiêu hóa hợp chất đồng hóa tương tự động vật 2.3.3.5 Cải thiện chất lượng nước Chất lượng nước cải thiện nhờ bổ sung chủng probiotic đặc biệt chủng Bacillus sp Các chủng Gram dương chuyển đổi hợp chất hữu thành 15 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt CO2 tốt chủng gram âm Có báo cáo cho việc sử dụng chủng Bacillus sp cải thiện chất lượng nước, tăng khả sống tăng tốc độ phát triển Penaeus monodon làm giảm tác nhân gây bệnh Vibrio Việc xử lý nước nuôi thủy sản probiotic cho thấy tác dụng giảm chất hữu nước ao nuôi thủy sản, giảm hàm lượng BOD giảm độc tố amoni, nitrite hydro sulfua, khống chế vi khuẩn gây bệnh, tăng suất tôm cá 2.3.3.6 Tăng cường đáp ứng miễn dịch Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu kích thích probiotic, q trình hình thành khuẩn lạc bám dính probiotic ruột cá điều kiện cần thiết để tăng cường đáp ứng miễn dịch thông qua liên kết kiểu phân tử liên quan đến vi khuẩn- BAMPs (bacteria associated molecular patterns) có tính bảo tồn cao thụ thể chyên biệt bề mặt tế bào biểu mô ruột Một số nghiên cứu chứng minh Clostridium butyricum giúp gia tăng khả kháng Vibrio cá hồi gia tăng hoạt tính thực bào bạch cầu Rengpipat ctv (2000) cho sử dụng Bacillus sp (chủng S11) bảo vệ tôm sú Penaeus monodon khỏi tác nhân gây bệnh cách hoạt hóa hệ thống miễn dịch dịch thể tơm Balca´zar (2003) chứng minh sử dụng hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp Vibrio sp ảnh hưởng tốt tới phát triển khả sống sót ấu trùng tôm thẻ chân trắng đồng thời bảo vệ chống lại Vibrio harveyi virus gây hội chứng đốm trắng Sự bảo vệ xuất phát từ kích thích hệ thống miễn dịch việc gia tăng thực bào hoạt động kháng khuẩn Ngoài ra, nhiều tác giả chứng minh sử dụng vi khuẩn lactic Lactobacillus rhamnosus (chủng ATCC 53103) hàm lượng 105 cfu/g, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, L sakei kích thích miễn dịch cá hồi Oncorhynchus mykiss cách thúc đẩy hoạt tính thực bào, sản sinh superoxide, lyzozyme, tăng cường hoạt tính bổ trợ (ACH50) 16 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt 2.3.3.7 Tác động kháng virus Một số vi khuẩn sử dụng probiotic có tác dụng kháng virus, chế chưa hiểu xác Việc kiểm tra phịng thí nghiệm có bất hoạt virus nhờ hợp chất hóa học hợp chất sinh học dịch chiết từ tảo biển dịch chiết ngoại bào từ vi khuẩn Kamei ctv (1988) báo cáo cho chủng Pseudomonas sp, Vibrios sp, Aeromonas sp nhóm Coryneform phân lập từ trại ấp trứng cá hồi có hoạt tính kháng virus IHHNV (infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus) Direkbusarakom ctv (1998) phân lập hai chủng Vibrio sp NICA 1030 NICA 1031 có hoạt tính kháng IHHNV Oncorhynchus masou virus (OMV) với tỷ lệ giảm hai virus từ 62% 99% 2.3.4 Vai trò probiotic nuôi trồng thủy sản Khi đưa probiotic vào môi trường nước ao, vi sinh vật sinh sôi phát triển nhanh môi trường nước Sự hoạt động vi sinh vật có lợi có tác dụng sau ao hồ nuôi thủy sản:  Phân hủy chất hữu nước, hấp thu xác tảo chết làm giảm gia tăng lớp bùn đáy  Giảm độc tố mơi trường nước (do chất khí: NH3, H2S… phát sinh), làm giảm mùi nước  Giúp ổn định độ pH nước, ổn định màu nước probiotic hấp thu chất dinh dưỡng hòa tan nước nên hạn chế tảo phát triển nhiều, giảm chi phí thay nước  Nâng cao khả miễn dịch tôm cá (kích thích hệ miễn dịch khơng đặc hiệu tơm, cá)  Ức chế hoạt động phát triển vi sinh vật có hại (do lồi vi sinh vật có lợi cạnh tranh thức ăn tranh giành vị trí bám với vi sinh vật có hại) Trong 17 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt môi trường nước, vi sinh vật có lợi phát triển nhiều kìm hãm, ức chế, lấn át phát triển vi sinh vật có hại, hạn chế phát triển mầm bệnh Ngoài ra, số probiotic sử dụng cách trộn vào thức ăn để nâng cao khả hấp thu tôm cá, làm giảm hệ số thức ăn phòng chống bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cho tơm cá Vì vậy, sử dụng probiotic có ý nghĩa nhiều mặt việc nâng cao hiệu kinh tế cho mơ hình ni thủy sản như:  Làm tăng hiệu sử dụng thức ăn (giảm hệ số thức ăn)  Tôm cá mau lớn, rút ngắn thời gian nuôi  Tăng tỷ lệ sống tăng suất tơm cá ni bị hao hụt  Giảm chi phí thay nước  Giảm chi phí sử dụng kháng sinh hóa chất điều trị bệnh 2.3.5 Giới thiệu quorum sensing khả bẻ gãy hệ thống quorum sensing vi khuẩn gây bệnh nuôi trồng thủy sản 2.3.5.1 Định nghĩa quorum sensing Vi khuẩn giao tiếp với cách sử dụng phân tử tín hiệu hóa học Chúng tiết ra, tiếp nhận phản ứng với tích lũy phân tử tín hiệu Việc phát phân tử tín hiệu mơi trường cho phép vi khuẩn phân biệt quần thể vi khuẩn mật độ thấp mật độ cao, kiểm sóat việc biểu thị gen thay đổi mật độ tế bào Quá trình gọi quorum sensing Nhiều kiểu hình vi khuẩn điều khiển quorum sensing, bao gồm độc lực, sản xuất kháng sinh, tạo thành màng sinh học … Trong giới vi sinh vật tồn hai lọai ngôn ngữ quorum sensing, ngôn ngữ phổ biến ngôn ngữ đặc hiệu, cho phép vi khuẩn giao tiếp lồi lồi Q trình quorum sensing vi khuẩn Gram âm điều khiển phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL) Ở vi khuẩn Gram dương, trình 18 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt quorum sensing điều khiển phân tử oligopeptide có chiều dài đến 17 amino acid Quá trình giao tiếp thơng qua hệ thống tín hiệu protein I /protein R xem chế chuẩn vi khuẩn Gram âm sử dụng để thông tin liên lạc với Hệ thống quorum sensing kiểu sử dụng để kiểm soát việc biểu gen 25 loài vi khuẩn Gram âm Trong trường hợp, AHL loại phân tử tín hiệu mà việc tổng hợp phụ thuộc vào protein I Một protein khác (protein R) chịu trách nhiệm việc nhận biết phân tử tín hiệu AHL sau q trình hoạt hóa việc phiên mã số gen đích Phân tử tín hiệu AHL chứng minh có liên quan đến q trình quorum sensing nhiều tác nhân gây bệnh người thực vật Pseudomonas aeruginosa (Rumbaugh ctv., 2000), Erwinia carotovora, Agrobacterium tumefaciens (Whitehead ctv., 2001), Vibrio harveyi (Manefield ctv., 2000) loài vi khuẩn gây bệnh khác nuôi trồng thủy sản (Bruhn ctv., 2005) 2.3.5.2 Hệ thống quorum sensing vi khuẩn Edwardsiella spp Hệ thống quorum sensing gần phát nhóm vi khuẩn gây bệnh quan trọng cá (Edwardsiella spp.) Han ctv (2010) xác định có bốn loại phân tử tín hiệu AHL (BHL, HHL, 3-oxo-HHL phân tử AHL chưa xác định được) liên quan đến độc lực Edwardsiella tarda, tác nhân gây bệnh loài cá nước nước mặn lươn, cá nheo Mỹ, cá đối, cá tráp, cá rô phi, ca bơn Gần đây, nhóm nghiên cứu lại xác định bốn loại phân tử tín hiệu AHL nói tồn Edwardsiella ictaluri, vi khuẩn gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi Việt Nam 19